Акад. Кирил Братанов” Българска Академия на Науките

„Акад.Кирил Братанов”

• 
  Профилактика на редица заболявания предавани по полов път, подобряване на породния състав, рационално използване на ценните мъжки разплодници, които в момента изобщо не достигат. Разбира се, днес обществено икономическите условия са коренно различни от тези преди десет години.
  
• 
  Организацията на използваните през периода на АПК биотехнологии в размножаването на овцете в момента не могат да бъдат прилагани поради промяната на собствеността на животните и оттеглянето на държавната субсидия от частното животновъдство. Това е и основната причина, която ликвидира и.о. днес днес в практиката, но същевременно е и причина да се разработи нова организация, схеми и методи за приложението на и.о. в условията на частното овцевъдство.
  

Обикновено подборът и селекцията на разплодниците се осъществява от регионалните специалисти на дирекцията за контрол върху развъдната дейност и на собствениците на овцете. За сега основните показатели за подбора на разплодниците си остават произхода и екстериорните им качества. Все още не е залегнала практиката да се направи преценка на сексуалните и спермо производителните качества на кочовете, което фактически е и основната им дейност. В общата оценка обикновено данните за размерите, консистенцията на тестисите, обема на еякулатите, качествените и количествени показатели на спермата няма. Става така, че с голямо закъснение и с икономически загуби се констатира, че даден разплодник има ниска оплодителна способност, нещо повече, в условията на частното животновъдство не е изключено да се констатира, че разплодникът не е в състояние да заплоди овцете поради факта, че е заразен от заразен ендемит или е лош спермопродуцент, произвежда еякулати с ниска концентрация, с висок процент патологични сперматозоиди и др.недостатъци, и едва когато овцете започнат масово да се повтарят след 18-20 дни или след 36-40 дни, тогава се констатира, че кочът не е подходящ. Това е и първа основна причина, която прави задължителна предварителна подготовка и оценка на спермопродукцията на разплодниците за случната кампания.

Кочовете-производители трябва целогодишно да се поддържат в разплодна кондиция, която да не се понижава през и след случната кампания. За целта кочовете-производители през случния период да се претеглят всеки 10 дена и съобразено с качеството и количеството на еякулатите им, живото тегло и кондицията им, да се определя количеството и качеството на дажбата им. Храненето със слама и плява да се избягва или да се дават в минимални количества, тъй като кочовете развиват сламест корем, който им пречи при скачките. През неслучния пасищен период основната храна на кочовете-производители е пашата, която се допълва с концентриран фураж не повече от 500-1200 г (овес, просо,трици). При оскъдни пасища се полага подхранване с покосена зелена трева или люцерна, която да се дава завехнала. През зимния сезон кочовете се хранят с 1-1 ½ кг сено, 3-4 кг сочен фураж (моркови, царевичен силаж) и 1200 кг концентриран фураж. При наближаване на случната кампания (30-40 дни) кочовете-производители се поставят на увеличена дажба, като се включват храни с високо белтъчно и витаминно съдържание (слънчогледов, соев шрот, яйца, мляко) и др.

През случния период кочовете-производители се подхранват с по-големи количества концентриран фураж и храни от животински произход.

При интензивно използване (повече от 40 дни) ежедневно към дажбата на племенните кочове се прибавят 2-3 яйца и 1-2 л.мляко (при снижаване количеството на концентратите).

От концентрираните фуражи най-подходящи за хранене на кочовете са овеса, просото, ечемика, триците и шрота. Няма основание да се опасяваме от замяната на овеса с просо и на ечемика с трици стига да се осигури необходимото количество кръмни единици, смилаем белтък, калций, фосфор и каротин.

От грубите фуражи най-подходящо е сеното (смес от люцерна и детелина и ливадо сено). От сочните фуражи много благоприятно въздействие оказват морковите. Концентрираните фуражи се залагат на три пъти: сутрин преди скачка, сутрин след скачката и вечер. Най-добре е при кочовете-производители винаги да има прясна, чиста вода. При липса на такава възможност, водопой се извършва 2-3 пъти дневно, но никога не се извършва водопой непосредствено преди и след скачка. Периодът за подготовка на кочовете- производители при случната кампания трае 60 дни. През това време от коча се вземат не по-малко от 15-20 еякулата за прочистване на застарелите сперматозоиди, приучване коча към регулярно използване и за проучване индивидуалните му способности. Стремежа е да се повиши нервно-рефлекторния тонус с цел повишаване спермообразуването. В периода на работа на пункта възрастните кочове извършват като правило 2-3 скачки на ден, а в отделни дни 5-6 скачки. Първите две скачки трябва да се извършват рано сутрин, два часа след храненето и разходката. Първите две скачки се извършват непосредствено една след друга с промеждутък 5-10 мин. Трета и четвърта скачка се извършват след не по-малко от един час. След четвъртата скачка на коча се дава по-продължителна почивка, не по-малко от три часа.

Сперма се получава от кочовете с изкуствена вагина. За да се обезпечи бързо и качествено получаване на спермата необходимо е да се извърши следното:

За целта кочът-спермодарител се изчиства от прах и др.нечистотии. Коремната му област заедно с препуциума се измива с хладка вода и сапун, след това препуционалната торбичка се промива с 25 мл. 2% фурацилинов разтвор, който се задържа 5-10 мин. и чрез масаж се втрива по лигавицата на цялата препуционална торба. За да се отстрани замърсяването на вагината от тялото на спермодарителя, на последния се поставя престилка с отвор около препуциума.

Изкуствената вагина се състои от следните части: външен цилиндър, вътрешна гума, съединителна гума, спермосъбирателна чашка и гумени пръстени.

Монтирането се извършва по следния начин:

а) Стерилна вътрешна гума се поставя във външния цилиндър с гладката страна навътре без да се образуват гънки, обръщат се двата и края върху цилиндъра, така че се образува свободно пространство между цилиндъра и вътрешната гума. Краищата се фиксират с гумени пръстени. Около единия отвор се образува от вътрешната гума свободна ивица широка 1 см.

б) На изходния край на и.в. се поставя къса 7-8 см съединителна гума, на която се монтира стерилна спермосъбирателна чашка.

в) така монтираната и.в. се приготвя за получаване на сперма по следния начин:

През отвора на цилиндъра се налива топла 55-60º вода докато вагината се напълни. Последната се разклаща, за да се затопли равномерно. При по-ниска от 18ºC температура в помещението, водата трябва да се смени 2-3 пъти през 5 мин, за да се затопли вагината при желаната температура (42-44ºC). След това може да се излее половината от водата и през кранчето да се вдуха въздух, докато стените на вътрешната гума се приближат една до друга. Може да се работи и с вагина напълнена само с вода. Спермосъбирателната чашка непосредствено преди нейното поставяне се проплаква със сперморазредител или 1% стерилен воден разтвор на чист натриев хлорид. Чашката трябва да бъде предварително стерилизирана чрез изваряване и изсушаване. В случаите когато температурата на случната зала е под 10ºC за предпазване на сперматозоидите от температурен шок задължително се използва стерилна двустенна спермосъбирателна чашка или специално ушит калъф от вълнен ватиран плат. В двустенни чашки се налива топла вода 45ºC, ако се забави получаването на сперма водата в чашката се подменя през 5-6 мин. При ниска температура в помещението и двустенната чашка може да бъде поставена във вълнено калъфче. Ако не разполагате с двустенна самосъбирателна чашка, се приготвя специално ушит калъф от вълнен ватиран плат. Чашката се поставя в калъфчето и се загряват в сушилен шкаф или фурна до 50ºC след което се монтира на изкуствената вагина заедно с калъфчето, за да се предпази от температурен шок прясно получената сперма, която е с температура 38.5ºC.

г) На предния край на вагината се поставя каучуков капишон. Вътрешната гума на 1 см от входа на вагината се смазва със стерилизиран вазелин, посредством суха стъклена пръчка, предварително стерилизирана чрез изваряване. Смазва се старателно само външния отвор. За избягване на замърсяване на вазелина се препоръчва използването на вазелин в туби.

д) Температурата на вагината се измерва с термометър до 50 или 100ºC, който се поставя в гънките на вагината. Непосредствено преди извършването на скачката температурата на вагината трябва да бъде 42-43ºC. Когато кочът еякулира във вагина с една и съща температура, у него се изработва положителен условен рефлекс.

е) Скачката за получаване на сперма кочът извършва в случната зала или в стаята за изкуствено осеменяване при подложка- размърляна овца. В станциите получаването може да стане и върху чучуло, коч или здрава размърляна овца. Особено трябва да се държи сметка за заразните и паразитни болести. Подложката се държи от един помощник или се фиксира в специален станок.

ж) По време на скачката изкуствената вагина се държи на височината на крупата под наклон 30-35º почти успоредно с корема на коча. След извършване на скачката изкуствената вагина се изправя отвесно със спермосъбирателната чашка надолу. Сваля се каучуковия пръстен със съединителната гума и със силно притягане се затваря нейния отвор, непосредствено над чашката, след което съединителната гума се сваля от цилиндъра. Чашката се поставя във водна баня при температура 32ºC и се прави преценка и разреждане на спермата.

з) След всяко получаване на сперма изкуствената вагина се почиства и измива. След измиването вагината се изплаква с чиста вода обилно. Така измитата изкуствена вагина се облива с вряща вода в продължвние на 2-3 мин., след което се монтира нацяло и се прибира в шкафа, където изсъхва.

и) За всеки коч се определя отделна вагина, която след нейното приготвяне може да се използва за получаването най-много на два последователни еякулата.

4. Преценка на спермата

Извършва се задължително за всеки еякулат предназначен за осеменяване, веднага след получаването му по отношение на следните показатели: обем, цвят, мирис, консистенция, подвижност на сперматозоидите, брой на същите в 1 см³ (или гъстота на спермата) и преживяемост във водна баня при 46ºC.

Нормално обемът на еякулата е 1-1,5 см³ , цвят сиво-бял, а консистенцията сметаноподобна. Спермата на пръча има слабо зеленикав оттенък. Веднага след получаването през стъклото на спермосъбирателната чашка с просто око се виждат вълнообразни и кълбовидни движения на спермалната маса. Не се допуска до използване сперма с обем под 0.5 см³ и с отклонения от нормалния цвят, консистенция и мирис. Гъстотата на спермата се определя чрез субективна окомерна преценка под микроскоп (трихиноскоп), като едновременно се преценява подвижността на сперматозоидите. Гъстата сперма се означава с буквата Г – „гъста” (ако зрителното поле е запълнено навсякъде със сперматозоиди) , средната с буква С –„средна” (ако в зрителното поле между отделните сперматозоиди се забелязват и свободни пространства, големи до един сперматозоид), и ряката с буква Р – „рядка” (ако между отделните сперматозоиди се наблюдава свободно пространство, по-голямо от един сперматозоид). За осеменяване се използва само гъста, в извънредни случаи и средно-гъста сперма.

Подвижността на сперматозоидите се преценява под микроскоп или трихиноскоп със слабо увеличение (80-120 пъти) при температура около 38 ºC с помощта на биотерм или с обикновена светлинна крушка насочена към масичката на микроскопа /трихиноскопа/. Температурата на масичката на микроскопа не трябва да надвишава 35 ºC. Върху предварително темперирано до 38 ºC предметно стъкло се поставя капка сперма, колкото лещено зърно, която се покрива с покривно стъкло и така се получава тънък слой. Подвижността на сперматозоидите се преценява на око по десетобалната система. Всяка единица означава 10% сперматозоиди с настъпателно праволинейно и енергично движение. При средно вълнение на спермата, т.е. при средно количество вълни се дава оценка 9, а при слабо вълнение, т.е. при по-малко количество вълни-8, т.е. 80% от сперматозоидите са с праволинейни и енергични движения.

Не се използва за осеменяване сперма, която има оценка 7 бала и съдържаща по-малко от 70% сперматозоиди с настъпателни движения.

Определяне броя на сперматозоидите в 1 см³ се извършва в броителна камера на Бюркер. Установяване преживаемостта на сперматозоидите чрез термична проба при 46ºC се извършва по следния начин: взема се 0,4 см³ разредител, с който се извършва разреждането на спермата, поставя се в епруветка, след това се прибавя 0,1 см³ от изследваната сперма. Епруветката се разклаща внимателно и се поставя във водна баня при 46 ºC. След 60 мин. се изважда от водната баня, разклаща се добре и се слага капка върху предметното стъкло, и се наблюдава под микроскоп (трихоноскоп) за наличието на подвижни сперматозоиди. При наличност над 5% сперматозоиди с настъпателни праволинейни и енергични движения, спермата се допуска до употреба.

5. Разреждане на спермата.

5.1. Разреждането на спермата на коча и пръча е необходимо не само за увеличаване на обема на същата и създаване възможност за изкуствено осеменяване на по-голям брой животни, но и за по-правилно дозиране. Освен това чрез разреждането се създават по-добри условия за сперматозоидите при тяхното съхранение и транспорт.

5.2. За разреждането на спермата се използват няколко вида разредители: кристалоидни за краткосрочно съхранение, и колоидни за дългосрочно съхранение на спермата.

5.2.1 Кристалоидни разредители

Глюкозо-фосфатния сперморазредител, който съдържа 3,2 г глюкоза безводна, 2,8 г кисел вторичен натриев фосфат в 100 см³ дестилирана вода. Тази среда се получава в осеменителния пункт от два съставни разтвора, изпратени в ампули по 20 см³, облепени с етикет, на който е означено съдържанието на ампулата, фосфат или глюкоза. Сперморазредителят се приготвя, като в чисто стерилизирано и сухо стъкло (колба) се смесва цялото съдържание на една ампула с етикет „глюкоза” и на другата с етикет „фосфат”. След смесването им общият разтвор се разклаща. Така приготвеният разредител служи за разреждане на сперма в продължение на 1-2 дни, след което се приготвя нов. Разредителят се съхранява на тъмно и хладно място и винаги в добре запушено стъкло (банка), от което се взема чрез отливане необходимото за работа през деня количество. С глюкозо-фосфатния разредител се разрежда спермата, която се използва до 2-3 часа след получаването и, и се осеменява в топли помещения (над 18 ºC) или в студени помещения под 18 ºC, като разредената сперма се държи във водна баня по време на осеменяването.

Разредителят „ Златно руно” се продава готов в шишета по 100 мл. Употребата му като кристалоиден разредител е много лесна. Необходимо е с помощта на стерилна спринцовка и игла (еднократна употреба) да се изтегли от шишето необходимото количество от средата, да се темперира и разреди спермата. Наченатото шише се съхранява в хладилник при 0-2 ºC.

5.2.2. Колоидни разредители

Млечният сперморазредител съдържа добре обезмаслено краве мляко. Приготвя се непосредствено преди употребата му по следния начин: кравето мляко се сварява, оставя се да изстине, като каймакът му се отделя няколко пъти. Млечният разредител се използва в случаите, когато разредената сперма ще се съхранява при температура около 0-4 ºC. или осеменяването се извършва в помещение с температура под 18 ºC.

Колоидният разредител „Златно руно” се приготовлява непосредствено преди употребяването му по следната рецепта: на 100 мл. среда се поставя 20 мл.жълтък. Със стерилен нож се счупва по средата черупката на прясно кокоше яйце с оглед да се отдели по-лесно жълтъка от белтъка и да не се допуска разкъсване на обвивката на жълтъка. Последният се поставя в стерилен стъклен съд (петриева паничка), разкъсва се обвивката му, с помощта на градуирана пипета или спринцовка с широк конус. Взема се необходимото количество, като се внимава да не попаднат частички от обвивката на жълтъка или зародиша, и се смесва с кристалоидната среда „Златно руно”. С помощта на стъклени перли или обикновен кухненски нож на бавни обороти се разбива жълтъка до получаването на хомогенна емулсия.

Колоидните разредители се използват за разреждане на сперма, която ще се съхранява около 0-4 ºC.

Друг разрешен колоиден разредител използуван в нашата практика, това е жълтъчно-глюкозо цитратния за коч, който може да се приготовлява само в станциите или в локалните лаборатории. Последните три разредителя се използват когато спермата се получава в станциите или локалните лаборатории и се транспортира до пунктовете /фермерите/ за извършване на осеменяването на овцете.

5.3. Техника на разреждането.

Преди разреждането е необходимо уеднаквяване на температурата на разредителя и спермата, за да се избегне студения шок. За целта съдът със сперморазредителят се поставя предварително във водна баня, в която се поставя и спермата веднага след получаването и. След 5-10 мин. престояване, което е достатъчно за уеднаквяване на температурата на разредителя и спермата, се пристъпва към самото разреждане. Последното се извършва в спермосъбирателна чашка, в която разредителят се влива посредством пипета или спринцовка в спермата на капки по стените на чашката, която леко се разклаща обхваната в шепата на лаборанта/осеменителя. Разрежда се в граници от 1 плюс 1 до 1 плюс 4-6 в зависимост от подвижността на спермата и нуждата. След разреждането незабавно под микроскопа (трихоноскоп) се преценява подвижността на сперматозоидите и ако същата е понижена, то спермата се бракува, а разредителят се заменя с новоприготвен такъв.

5.4. Спермата, която ще се съхранява или транспортира, първоначално се разрежда в съотношение 1 плюс 1, след което се доразрежда в степен да се получи една доза с обем 0,20 мл. Да съдържа 80-100 милиона настъпателно подвижни сперматозоиди необходима за еднократно осеменяване на овца.

След доразреждането на спермата се прави проверка за процента подвижни сперматозоиди, ако последната не се е понижила, спермата се допуска за употреба. Спермосъбирателната чашка с разредената сперма се изважда от водната баня. Оставя се на стайна температура да се темперира и след 10-15 минути се разлива в пеницилинови флакончета предварително надписани с името на коча, номера му, датата на получаване на спермата.След това спермата се поставя в хладилника за постоянно охлаждане до 0-4ºC. Транспортирането на спермата може да стане до 30 мин. след получаването и. При разреждането на спермата в станциите или централните лаборатории да се използува метода за асептично разреждане и дозиране на спермата.

6. Съхранение и транспорт на спермата

6.1. Голямо постижение в метода на изкуственото осеменяване е решаването на въпроса за съхраняването на спермата, което прави човека независим от времето и пространството. Разплодниците се използуват във физиологическо допустими интервали, спермата може да се транспортира до най-отдалечените места и за изкуствено осеменяване на женски животни в най-подходящо време.

6.2. Допускат се за съхранение и транспорт само екулати с обем над 1 мл, подвижност на сперматозоидите 10 или 9 бала, концентрация над 1,0 милиард и преживаемост над 5% сперматозоиди във водна баня при 46ºC след 60 мин. Съхранява се и се транспортира само сперма разредена с колоиден разредител („Златно руно”, „Жълтъчно-глюкозо-цитратен, Млечен и др. специално утвърдени от лекарствената комисия среди).

6.3. Спермата разредена с посочените разредители се съхранява при температура около 0-4 ºC. За целта се използуват следните уреди: електрически хладилник с регулатор, обикновен термус с широк отвор. Хладилникът се използва за охлаждане и съхранение на спермата в станциите и локалните лаборатории, а термосите за транспорт и съхранение в пунктовете за изкуствено осеменяване на овце. Спермата разредена с кристалоидни разредители се използва за стационарна употреба. Възможно е, ако се налага транспортиране на близко разстояние да се съхранява за не повече от 2-4 часа включващо и времето за осеменяване. За да се запази спермата в този срок най-добре е да се съхранява при температура от 12 до 16 ºC. За целта се използват хладилни чанти, кутии облепени с термоизолационна материя, стеропорови кутии и др.охладени до 12ºC. В тях се поставя спермата и в това състояние бързо се транспортира до пунктовете за осеменяване на овцете, където се съхранява при температура от 12 до 16 ºC в тъмни и хладни помещения в рамките на общо 4 часа след нейното получаване.

6.4. За да се поддържа температурата около 0-4 ºC е необходимо термусите да бъдат напълнени с лед, който се подменя периодически в зависимост от околната температура. Обикновеният термус се поставя в дървено сандъче, пространството между стените на което е плътно запълнено с изолационна материя (стеропор).

6.5. Транспортирането на спермата от лабораториите се извършва в термус, напълнен с лед, след което могат да се използуват всички видове транспортни средства при условие, че са взети мерки за предпазване термосите от затопляне, замръзване, тръскане, механични повреди и обръщане.

6.6. За съхраняването и пренасянето на спермата в термоси трябва същата да бъде разлята в стъклени пеницилинови флакончета, които се напълват догоре, запушват се със запушалки, последните се притискат и се парафинират. Флакончетата със спермата предварително надписани с датата и номера на коча се завиват в лигнинова или книжна салфетка, поставят се в гумено или пластмасово пликче, за да се предпазят от директен контакт с ледените късчета, замърсяване или намокряне и след това се поставят в термоси. Използуват се напълно чисти, сухи, стерилизирани флакончета и запушалки. След употреба същите се измиват с четка и подходящи препарати, проплакват се обилно с чиста вода, изваряват се в продължение на 30 мин. и се подсушават. По-добре е да се направи суха стерилизация. Преди сухото стерилизиране шишенцата и тапите, и др. лабораторна посъда трябва да се проплаква обилно с дестилирана вода.

6.7.Дълбоко замразена /д.з/ сперма от кочове и пръчове. Спермата, предназначена за дълбоко замразяване, трябва да отговаря на следните изисквания: 1/ да е получена от клинично здрави кочове; 2/ да има концентрация на сперматозоидите не по-малко от 2,5 милиарда в 1 см³; 3/подвижността на сперматозоидите да е минимум 70%; 4/ неподвижните сперматозоиди да не са повече от 20%, а патологичните до 20%; 5/ преживяемостта на сперматозоидите при температура 46 ºC след 60 мин. да бъде 5% живи сперматозоиди, а при 39 ºC след 300 мин. над 5%;

6/ Да не съдържа патогенна и условнопатогенна микрофлора, вируси и плесени; 7/количеството на сапрофитните микроорганизми да не е повече от 500 микробни тела в 1 см³ сперма. Степента на разреждането зависи от гъстотата на спермата и се определя с оглед в дозата сперма да се съдържат 100 млн. в обем 0,16 мл. живи сперматозоида с праволинейно постъпателно движение преди замразяване. За замразяване на спермата от коч се използуват три технологии: -под формата на гранули (гранулиране), на пайети (пайетиране) и в минитюби.

6.7.1.Гранулиране на спермата

Японските учени Нагазе и Нива докладваха на конгреса в Италия гр.Тренто през 1964г. разработената от тях технология за замразяване на сперма от бици. Същата намери широко приложение и в технологията за замразяване на спермата от коч. Отговарящата на посочените по-горе показатели сперма се разрежда с лактозен разредител в съотношение 1:3 и се препоръчва дозираното разреждане посочено по-горе. След което се еквилибрира при температура 0-4 ºC за 2-4 ч. След това се накапва в гнезда /ямки/ направени в пресовано блокче от сух лед /сняг/, където температурата е (-79 ºC). След като престоят 3 мин. се образуват замразените гранули, които се поставят за продължително съхраняване в течен азот (-196 ºC). Преди употреба гранулите се размразяват при температура 40 ºC в 0,5 см³ 2,8%-ов воден разтвор на натриев цитрат. Наред с предимствата на гранулирането, изразени в лесна приложимост, икономично използване на контейнерите, добра активност на сперматозоидите след размразяване и опростена методика на впръскване на спермата, то има и следните недостатъци: 1/използува се междинен хладагент (сух сняг-CO₂) 2/гранулите са в непосредствен контакт с хладилните среди (CO₂ и течния азот) и се създават условия за допълнително контаминиране на спермата с различни микроорганизми; 3/необходимо е допълнително разреждане на гранулата при размразяването и; 4/ процесите на замразяване на спермата не подлежат на механизиране и явтоматизиране, което затруднява производствения процес; 5/има трудности при идентифицирането на гранулите, получени от различни кочове, което може да се отрази на развъдно-подобрителната работа.

Гранулирането на спермата беше възприето като основен метод за дълбоко замразяане на сперма от кочове в нашата страна. Посочените недостатъци на тази технология и незадоволителният % на заплодяемост от I-во осеменяване наложи в овцевъдната практика да се пристъпи към внедряване на пайетирането.

6.7.2.Пайетиране на спермата

Пайетирането на спермата е предложено от R.Cassou (1968 Франция) , като метод за замразяване на сперма от кочове. Пайетите представляват пластмасови тръбички (сламки), които по размер биват големи (съдържащи 1,2 см³ сперма), средни (0,5 см³) и малки (0,25 см³). Установи се по-голяма икономическа ефективност за малките пайети, които се използуват в нашата страна.Преди пайетирането спермата се разрежда с оригиналния френски разредител 1 пакетче Лейцифос N:478. Приготовлява се по следния начин: 1/ Съдържанието на едно пакетче се разтваря в 400 мл. бидестилирана вода подгрята до 40 ºC; 2/прибавя се 50 см³ жълтък от прясно кокоше яйце в 100 см³ бидестилирана вода подгрята до 50 ºC, хомогенизира се до получаването на хомогенен разтвор; 3/ внимателно двата разтвора се смесват и хомогенизират –така се приготвя разредител - А 4/ правите първоначално разреждане на спермата при температура 34 ºC водна баня в съотношение 1:2 като към получения обем разредена сперма прибавите 3% глицерин постепенно на капки или бавно по стената на чашката, като леко разклащате сместа 5/ поставяте разредената сперма в хладилник при 4 ºC за 45-60 мин 6/приготовляване на средата Б. За целта към определено количество от първоначалния разтвор на Лейцефос със жълтък се прибавя на два пъти глицерин, така че да се получи концентрация на глицерина 11%. Разтвор Б се темперира в същия хладилник при съшата температура, където е разредената сперма в разредител А 7/след 60-та мин. разредената сперма в разтвор А се доразрежда в съотношение 1:1 с разтвор Б, така че крайното разреждане на спермата да съдържа 7% глицерин. Степента на разреждането се определя с оглед в 1 доза (пайета с обем 0,25 мл) да има 30-35 млн.живи настъпателно подвижни сперматозоида, след размразяването.След доразреждането спермата се оставя в хладилника за еквилибрация за 2-3 часа, след което веднага се пристъпва към разфасоване на спермата в пайети които са предварително надписани с датата, номера на коча и породата.Пайетната машина е поставена в хладилна витрина, където температурата е също 4 ºC. Приготвените пайети се поставят най-напред на азотни пари при -110 ºC, след 5-7 минути пайетите се потапят в течен азот (-196 ºC), където се съхраняват продължително време в специални пластмасови пурети предварително надписани с данните на коча и датата на получаването на спермата.

Преди употреба пайетите се изваждат от контейнерите и се размразяват направо във водна баня при Т ºC- 39 ºC. Спермата се аплицира в женския полов апарат чрез специални инструменти (пистолет-катетър) не по-късно от 10-15 мин. след размразяването. Използува се сперма, която след размразяването има подвижни сперматозоиди над 30%,а от някои ценни кочове до 25% и устойчивост при термична проба 5% минимум след 300 мин. при 39 ºC.

6.7.3.Технологиии при минитюби

Тази технология се прилага съвсем ограничено в нашата страна. Използуват се пластмасови тръбички (минитюби) с обем 0,25 см³. Те се различават от пайетите само по размера си и начина на на затваряне /запушват се стъклени или метални перлички/. Производство са на германска фирма, собственост на д-р Симет. Спермата, преди да се постави в минитюбовете, се разрежда в съотношение 1:3 с патентования разредител триладилконцентрат. Към част 1 от него се прибавят 1 част жълтък ии 3 части дестилирана вода. Напълнените минитюби се еквилибрират при температура 0-4 ºC в продължение на 4 ч, след което се замразяват на азотни пари и се съхраняват в течен азот. Отмразяването на минитюбите е същото както при пайетите. Аплицирането на спермата става с помощта на специален катетър за минитюби. Технологията за дълбоко замразяване на спермата от кочове и дългосрочното съхранение на генетичния материал е от изключително голямо значение за селекцията и запазването на природното разнообразие в овцевъдството. Произведените досега многобройни опити за приложението на д.з. сперма от коч в практиката по традиционните методи за осеменяване на овцете: вагинално, плитко и дълбоко цервикално, се получиха много ниски резултати (около 16-18% заплодяемост). Това бе причината да се премине към нова технология за аплициране на дълбоко замразената сперма.

Прилагайки лапароскопския метод за осеменяване, резултатите значително се повишиха (65-68% заплодяемост). Разбира се,че този метод на осеменяване е значително по-скъп и трудоемък, но неговото приложение е оправдано и високо рентабилно за получаването на разплоден материал за нуклеосови стада и за разплодни животни, без което съвременната селекция не е в състояние да бележи успехи. В още едно направление този метод е необходим - за възстановяването на линии от аборигенни породи с цел опазването природното разнообразие на овцевъдството в Р.България.