Белтъци Цели Цели на преподавателя



страница4/5
Дата08.02.2017
Размер0.65 Mb.
#14475
1   2   3   4   5

Табл. 2-4. Аминокиселинен състав на колаген тип I*


Аминокиселинен остатък

%



глицин

33



пролин

10



3-хидроксипролин и 4-хидрокси-пролин

10



хидроксилизин

1



други

46


*По данни на [17].


Високият процент на глицин и пролин и наличието на хидроксипролин
и хидроксилизин не е случаен. Характерната първична структура предопределя
възникването на особен тип спирала с ляв ход, (подобна на спиралата, образувана
от синтетичен полипролин (т.н. полипролинова спирала, тип II, чиито параметри
са сравнени в табл. 2-3 с тези на други вторични структури). Този тип спирала
не съдържа вътрешно верижни водородни връзки. Три полипептидни вериги (две
1 и една 2 вeриги) с ляв ход образуват тройна суперспирала с десен ход
(фиг. 2-18), наречена тропоколаген, който е основната структурна единица
на колаген. Трите вериги са в близък контакт, както личи от напречния пререз.
Веригите се свързват една с друга чрез водородни връзки. Само глицин, най-малката
аминокиселина, приляга по размери в сърцевината на суперспиралата. Това
обяснява защо глицин е на всяка трета позиция.


 Фиг. 2-18. Структура на проколаген, тропоколаген и колагенови
фибрили (тип I).

 Най-горе - тройна спирала на проколаген с десен ход, съдържаща


три спирали с ляв ход от полипролинов тип II. В една от веригите е показан повтарящият се елемент в първичната структура,
а в другата
е представена вторичната структура. И трите вериги са от полипролинов тип ІІ (вж табл. 2-3). Първоначално образуващите се
сигнални препропептиди не са представени. Виждат се само пропептидите в амино- и карбоксилния край.

Тропоколаген се получава след поредица от промени в


тройната спирала: различни вътреклетъчни химически модификации (описани
в текста), екзоцитоза и извънклетъчно отстраняване на крайните пропептиди.
Напречният пререз на тропоколаген показва необходимостта всеки трети остатък
да бъде глицин, за да се осъществи близък контакт между веригите.

Ковалентните


напречни връзки, образуващи се във и между отделните тропоколагенови молекули
водят до бавно зреене на колаген. Във формиращите се колагенови фибрили
(най-долу) има характерно (около 23 %) отместване на тропоколагеновите
молекули една спрямо друга. Пакетирането на фибрилите във влакна не е представено.

Тройната суперспирала е много устойчива на развиване, тъй като


тя е с десен ход, а съставящите я три спирали - с обратен ляв ход (принцип,
използван и при изработване на здрави стоманени конструкции).

Тропоколагеновите молекули се обединяват във фибрили, като всяка


тропоколагенова молекула се отмества с около 23 % от своята дължина по
отношение на съседните. Между отделните молекули остава празни пространства,
в които в костите се отлага хидроксилапатитни кристали.

2.3.3.3. Значение на следсинтетичната обработка (зреене) на колаген за здравината на колагеновите фибрили

Първоначално синтезираните -вериги в ендоплазмения ретикулум
са под форма на препроколаген, съдържащи в N-края сигнален "пре"-пептид,
насочващ полипептидната верига във весикулите на ендоплазмения ретикулум.
След отделянето на сигналния пептид се получава проколаген, който съдържа
пропептиди (в N-края 150 остатъка и 250 остатъка в С-края).

Вътреклетъчните посттранслационни модификации на проколаген започват


с хидроксилиране на пролин и лизин. Определени хидроксилизинови остатъци
се гликозилират с галактозни или глюкозни остатъци (създават се О-гликодидни
връзки). Определени аспарагинови остатъци се гликозилират (създават се
N-гликозидни връзки). Образуват се дисулфидни връзки (вътрешно верижни
в N-пропептидите, а в С-пропептидите вътрешно-верижни и междуверижни).

Описаните модификации са условие за образуване на тройната спирала.


След това проколагенът се транспортира до апарата на Голджи, където завършва
О-гликозилирането и проколагенът се секретира извън клетките.

Извън клетките от проколаген се отцепват N- и С- крайните пропептиди.


Получават се тропоколагенови молекули, които се свързват една с друга,
и образуват колагенови фибрили. В тях всяка тропоколагенова молекула се
отмества с около 23 % от своята дължина по отношение на съседните. Колагеновите
фибрили се пакетират в колагенови влакна. В техните рамки продължава зреенето
на колаген, водещо до по-нататъшно усилване здравината на колаген. Лизил
оксидаза катализира окислително дезаминиране на -амино-групи на лизин
и хидроксилизин до алдехиди. Тези реактивни алдехиди реагират помежду си
(алдолна кондензация) или с неокислени лизини дават Шифови бази. Чрез тези
две реакции се формират стабилни ковалентни напречни връзки, усилващи якостта
на влакната.
2.3.4. Имуноглобулини

Имуноглобулините, наричани антитела, са защитни белтъци, които


разпознават и свързват чужди за организма макромолекули (белтъци, нуклеинови
киселини, полизахариди), след което ги бележат и предават на фагоцитите
за разрушаване. Антитела се образуват и срещу ниско-молекулни вещества,
ако са прикрепени към макромолекула. Групата, която се разпознава от антитялото,
се нарича антигенна детерминанта или епитоп.

Имуноглобулините се синтезират от плазмени клетки, произлизащи


от В-лимфоцитите. Известни са пет класа имуноглобулини (табл. 2-5).

На фиг. 2-19 е представена схематично структурата на имуноглобулин


от най-разпространения клас IgG. Всеки имуноглобулин се състои от две леки
(L от англ. light) и две тежки вериги (H от англ. heavy), свързани помежду
си чрез дисулфидни връзки.



Фиг. 2-19. Схема за структурата на имуноглобулин от клас IgG.

Молекулата съдържа две тежки вериги (H) и две леки вериги (L). СH и


VH - константен (непроменлив) и вариабилен (променлив) участък в тежката
верига; СL и VL - константен и вариабилен участък в леката верига; СНО
- въглехидратна съставка. Хипервариабилните участъци са в жълт цвят, а антиген-свързващите
участъци са означени със стрелки.

В рамките на всяка от веригите има и вътрешноверижни дисулфидни
връзки. Всяка от веригите съдържа вариабилен (V от англ. variable) и константен
(С от англ. constant) участъци. Леките вериги съдържат 220, а тежките 440
аминокиселинни остатъци. Вариабилните участъци на L и Н веригите оформят
две места за свързване на определен антиген. Н веригите са гликопротеини
(съдържат въглехидратна съставка).

Вариабилните места за свързване на антигена са специфични, а константните


участъци са еднакви за всички имуноглобулини в даден клас.
<з>Останалите четири класа имуноглобулини се отличават от IgG по
вида на тежката верига, по броя на мономерите, по застъпеността в серума
(вж табл. 2-5) и по функциите, които изпълняват. Секретираният имуноглобулин
може да бъде под форма на мономер (М), димер (D), тример (T), или пентамер (P). IgD няма
секреторна форма.
Табл. 2-5. Видове имуноглобулини в зависимост от вида на тежката верига*


Клас
имуноглобулини


Тежка верига
H


Лека верига
L



Структура


Kонцентрация
в серума (mg/dL)




IgA



 или 

22 или 22
M, D, T**

200



IgD



 или 

22 или 22
-

3



IgE



 или 

22 или 22
М

0.05



IgG



 или 

22 или 22
M

1000



IgM



 или 

22 или 22
P

120


* По данни на [1] и [19]


** M - мономер, D - димер, T- тример, P - пентамер; IgD няма секреторна форма.
IgG са основният и най-масово представен в кръвта клас антитела.
Чрез Н-веригите те се прикрепват към рецептори на фагоцити, които поглъщат
и разрушават свързания от IgG антиген (микроорганизъм). IgG могат да се
свързват и към белтъци от системата на комплемента и да ги активират. Единствено
IgG могат да преминават през плацентата от майката в плода.

IgМ са първите антитела, които се синтезират в В-лимфоцитите.


При диференциация на В-лимфоцитите могат да се образуват различни антитела
срещу един и същи антиген. В резултат на разместване на гени в ДНК L-вериги
от IgМ могат да се прегрупират с Н-вериги от друг клас и така да се получат
и други имуноглобулини IgA, IgG или IgE, които са с еднаква антигенна специфичност
като изходния IgM ( този процес се нарича превключване от клас в клас).

IgA се съдържат в слюнка, сълзи, мляко, чревни секрети като мономери,


димери или тримери. IgE участват в алергични реакции с увеличено освобождаване
на хистамин. Участват и в защитата срещу чревни паразити.

Функцията на


IgD е неясна.

Всеки човек може да произвежда антитела срещу 106 [1] до


109 [19] антигени. Генерирането на такъв огромен брой антитела осигурява
ефикасна защита срещу чужди макромолекули. То е възможно поради комбинацията
и пренареждането на различни структурни гени, отговорни за синтезата на
вариабилните участъци в Н и L веригите ( виж глава 15).

2.3.5. Инсулин

Както бе посочено (т. 2.2.2, фиг. 2-5 и 2-6), инсулин се синтезира като по-високомолекулен предшественик препроинсулин. Сигналният пептид в N-края (с 23 остатъци) е необходим за насочване на полипептидната верига към цистерните на ендоплазмения ретикулум, след което той се отделя, тъй като повече не е необходим. Получаващият се проинсулин съдържа от N-към С-края фрагментите, съответстващи на В-веригата, С-пептида (свързващ пептид) и А-веригата. Ролята на С-пептида е да осигури правилна конформация, за да могат да се образуват правилните дисулфидни връзки (фиг. 2-7 и фиг. 2-6). След това С- пептид, заедно

с още два дипептида, бива отделен. Активният инсулин има кратък полуживот в кръвта (3-5 минути). Наличието на дисулфидни връзки позволява лесно и бързо дезактивиране на хормона чрез тяхната редукция под действие на специфичен ензим (глутатион-инсулин трансхидрогеназа).


За клиничното приложение на тези познания- вж т. 2.5.4. и глава 18; за производството на човешки инсулин чрез генно инженерство - виж т. 16.7.7.

Други примери включват рецепторите, свързващи специфично определени хормони и предаващи хормоналния сигнал в клетката (глава 17), регулаторните хромозомни белтъци (глава 3) и други. На ензимите и техните функции е посветена глава 4.

2.4. Методи за пречистване на аминокиселини, пептиди и белтъци

2.4.1. Резюме

Съдържащите се в биологични течности аминокиселини и белтъци се изолират и пречистват, за да е възможно тяхното измерване, изучаване и използване. Разделянето (фракционирането) се постига чрез различни методи въз основа на различия по сумарен заряд, молекулни размери, разтворимост, афинитет към специфични вещества и др. свойства.

Електрофорезата е метод за разделяне на заредени молекули въз основа главно на различия в сумарния им заряд. Посоката на придвижване към един от полюсите на външно електрично поле се определя от знака на сумарния заряд на молекулите, а скоростта на придвижване - от съотношението заряд/молекулна маса, както и от интензитета на полето, формата на молекулите и структурата на носещия гел. При рН = или > 8.6 серумните белтъци са заредени отрицателно и в агарозен гел се разделят на следните фракции: албумин, 1-, 2- и -глобулини и -глобулини.

Изоелектричното фокусиране, SDS-полиакриламидната електрофореза и капилярната електрофореза са важни разновидности на електрофорезата.

При хроматографските техники веществата се разпределят между статична и подвижна фаза. Разделянето зависи от относителната способност на веществата да се свързват по-силно с едната или другата фаза. При разпределителната хроматография аминокиселините се разделят въз основа на различната им разтворимост в два несмесващи се разтворители (полярен и неполярен).

При йонообменната хроматография аминокиселините, пептидите и белтъците се разделят въз основа на зарядови различия. При нея смес от аминокиселини (напр. белтъчен хидролизат) се пропуска през колона, съдържаща йонообменна смола със заредени групи, които свързват противоположно заредените аминокиселини. Чрез създаване на градиент за рН и солевата концентрация на елуентите, отделните аминокиселини се отмиват постепенно от колоната и се разделят. В съвременния вариант йонообменната хроматография се прилага в специални апарати под високо налягане (HPLC-техника), осигуряващо изключително висока разделителна способност и повторимост на резултатите. При обратно-фазовата HPLC-техника смолата съдържа хидрофобни групи, за да се свържат и забавят хидрофобните молекули. В този случай елуирането от колоната става с органични разтворители. Цялата процедура в аминокиселинните анализатори (елуиране, събиране на отделни фракции, анализ на всяка фракция, записване на резултатите е автоматизирана.

Афинитетната хроматография се основава на специфично нековалентно свързване на белтъци към различни лиганди, вкл. и антитела, прикрепени към хроматографска колона. Последващото елуиране се прави с чист лиганд в по-висока концентрация отколкото тази на свързания към колоната лиганд.

2.4. Методи за пречистване на аминокиселини, пептиди и белтъци

Съдържащите се в биологични течности аминокиселини, пептиди и белтъци се изолират и пречистват, за да е възможно тяхното измерване, изучаване и използване. Разделянето (фракционирането) се постига чрез различни методи въз основа на различия по сумарен заряд, молекулни размери, разтворимост, афинитет към специфични вещества и др. свойства. В клиничната практика тези методи се използват както за диагностика на заболявания, така и за препаративно получаване и пречистване на различни биопродукти.

2.4.2. Електрофоретични техники

2.4.2.1. Принцип

Електрофорезата е метод за разделяне на заредени молекули или по-големи частици въз основа главно на различия в сумарния заряд. Посоката на придвижване към един от полюсите на външно електрично поле се определя от знака на сумарния заряд на молекулите. Скоростта на придвижване се определя от съотношението заряд/молекулна маса. Освен това разделянето зависи и от интензитета на полето и формата на молекулите в сместа, както и от структурата на носещия гел (агаров, агарозен, целулозно-ацетатен, полиакриламиден гел, хартия или друг). При подбиране на различни експериментални условия електрофоретичните методи се прилагат успешно както за разделяне на смеси от аминокиселини, така и на смеси от пептиди и белтъци в аналитичен и в препаративен вариант. Буферът, в който се разтваря сместа за разделяне, се избира да има рН, различно от рI на веществата, които трябва да се разделят или пречистват. При pН>pI, аминокиселините и белтъците са заредени отрицателно и се движат към анода. При рН<рI те са заредени положително и се движат към катода.


2.4.2.2. Агарозна електрофореза на серумни белтъци

Плазмените белтъци имат йоногенни групи, които определят сумарния заряд на дадена белтъчна молекула. При разделяне на тези белтъци чрез електрофореза върху агарозен гел обикновено се използва буфер с рН = или > 8.6. Изоелектричните точки на плазмените белтъци са между 5 и 7. При рН = или > 8.6 и над него те са заредени отрицателно и движейки се към анода с различна скорост, изминават различно разстояние и се разделят на следните фракции: албумин, 1-, 2- и -глобулини, фибриноген и -глобулини (фиг. 2-20). В клиничната практика се предпочита използването на серум вместо плазма, тъй като фибриногенът на плазмата може да бъде взет погрешно за парапротеин. При сканиране на електрофореграмата се получава т.н. денситограма, в която на всяка фракция съответства пик с определена ширина и височина. От площта под всеки пик може количествено да се определи даден белтък. Тези фракции са сумарни и съдържат множество индивидуални белтъци, които могат да бъдат допълнително разделени и пречистени чрез по-прецизни техники, напр. полиакриламидна електрофореза, имуноелектрофореза или други. Въпреки това, поради наличие на главен белтък във всяка от тях, електрофоретичният анализ на плазмени или серумни белтъци върху агарозен гел е полезен и често използван метод в диагностиката (виж т. 2.5.2).





Фиг. 2-20. Електрофореза на серумни белтъци от здрав човек върху агарозен гел, трис-вероналов буфер, рН 9.2. Горе - електрофореграма, долу денситограма. В посока към анода най-бързо се движи албумин, следван от 1, 2, , -глобулини.

Електрофореграмата и денситограмата са любезно предоставени от доц. Н. Койчева и гл. ас. Н. Деникова от Катедра по клинична лаборатория и имунология, Медицински Университет-София.



2.4.2.3. Други електрофоретични техники



При изоелектрично фокусиране се създава рН градиент в електрично поле с помощта на полиамино-поликарбоксилови киселини с известни рI, наречени амфолини. Всеки белтък от сместа се движи до такъв участък от градиента, който има рI, еднакво с това на белтъка. Поради високата разделителна способност и непредвидено свързване на амфолините с белтъци от пробата са възможни артефакти, т.е да се открият повече фракции от действително наличните.

SDS-полиакриламидната електрофореза разделя белтъците въз основа нa техния размер. SDS е съкращение от английското название на натриев додецил сулфат (Sodium Dodecyl Sulfate). Белтъците се нагряват в присъствие на SDS и редуциращ агент (меркаптоетанол), което води до разкъсване и редуциране на дисулфидните връзки и топлинна денатурация. С това към разтвора се експонират хидрофобни групи, скрити преди това в нативната структура. Те свързват додециловия радикал и около белтъка се образуват отрицателно заредени мицели от SDS-молекули. При полиакриламидна електрофореза всички белтъци, обградени от тези мицели, се движат към анода, като по-големите молекули се движат по-бавно от по-малките поради ситовия ефект на гела.

Капилярната електрофореза се използва засилено напоследък за диагностика поради високата скорост на разделяне (за няколко минути) и поради това, че са нужни много малки количества от изследваните вещества. При този метод се провежда свободна електрофореза в капилярни тръбички с диаметър 0.05-0.3 mm. Около отрицателно заредените стени на капилярките се движи поток от катиони към катода, увличайки със себе си разделяните молекули, независимо от техния заряд. Положително заредените молекули се движат с този поток най-бързо, последвани от неутралните и отрицателно-заредените молекули.

2.4.3. Хроматографски методи

При хроматографските техники веществата се разпределят между статична и подвижна фаза. Разделянето зависи от относителната способност на веществата да се свързват по-силно с едната или другата фаза.

2.4.3.1.Разпределителна хроматография

Чрез този метод аминокиселините се разделят въз основа на различната им разтворимост в два несмесващи се разтворителя. Единият разтворител е полярен - обикновено вода, фиксирана неподвижно чрез водородни връзки върху твърд носител (напр. хартия). Другият разтворител е органичен. Подходящ неполярен разтворител за аминокиселините е n-бутанол. Този неполярен разтворител се всмуква от твърдия носител, пълзи по него и затова се нарича подвижна фаза. Хидрофобните аминокиселини се разтварят в различна степен в органичния n-бутанол и заедно с него пълзят по хартията с различна скорост. Водноразтворимите аминокиселини изостават в своето движение. След време сместа се разделя на отделни аминокиселини, които се проявяват (стават забележими по хартията) след оцветяване с нинхидрин или флуорескамин. Оцветяването на аминокиселинните петна с нинхидрин позволява количественото им определяне при наличие на дори само на 1 g от тях. Флуорескамин е хиляда пъти по-чувствителен и улавя количества от аминокиселини от порядъка на 1 ng. Идентифицирането на неизвестните петна става чрез сравняване на техните Rf-стойности с тези на стандартните двадесет аминокиселини (свидетели). Rf-стойността е отношението между пътя, изминат от аминокиселината, и пътя, изминат от разтворителя.

2.4.3.2. Йонообменна хроматография

При този метод аминокиселините, пептидите и белтъците се разделят въз основа на зарядови различия. Това е най-използваният съвременен метод за разделяне, доказване и определяне на аминокиселини в белтъчен хидролизат. При нея хидролизатът се пропуска през колона, съдържаща йонообменна смола със заредени групи, които свързват противоположно заредени аминокиселини. Чрез създаване на градиент за рН и солевата концентрация на елуентите, отделните аминокиселини се отмиват постепенно от колоната и се разделят.

В съвременния вариант йонообменната хроматография се прилага в специални апарати под високо налягане (HPLC-техника - англ. High Pressure Liquid Chromatography), осигуряващо изключително висока разделителна способност и повторимост на резултатите. При обратно-фазовата HPLC-техника смолата съдържа хидрофобни групи, за да се свържат и забавят хидрофобните молекули. В този случай елуирането от колоната става с органични разтворители. Колкото е по-висок процентът на органичния разтворител, толкова по-бързо се извличат неполярните компоненти. Цялата процедура в аминокиселинните анализатори (елуиране, събиране на отделни фракции, анализ на всяка фракция, записване и отпечатване на резултатите) е напълно автоматизирана. В съвременните клинични лаборатории така се разделят аминокиселини от плазма на пациенти с диагностична цел (фиг. 2-21).



Каталог: docs -> biohimia
biohimia -> След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели: А. Знания
biohimia -> Захарен диабет Цели Цели на преподавателя
biohimia -> След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели: А. Знания
biohimia -> Ензими Цели Цели на преподавателя
biohimia -> След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели: А. Знания
biohimia -> Биоенергетика Цели Цели на преподавателя
biohimia -> След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели: А. Знания
biohimia -> След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели: А. Знания
biohimia -> След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели: А. Знания


Сподели с приятели:
1   2   3   4   5




©obuch.info 2024
отнасят до администрацията

    Начална страница