Биосинтез на галантамин от растителни in vitro системи на Leucojum



Дата30.08.2016
Размер98.93 Kb.
#7911
РЕЦЕНЗИЯ
на дисертационен труд на тема „Биосинтез на галантамин от растителни in vitro системи на Leucojum aestivum L.”, представена за присъждане на образователна и научна степен „доктор” по научна специалност 02.11.11. Технология на биологично активните вещества (вкл. ензими, хормони и белтъчини), от Иван Георгиев Иванов – докторант в Институт по микробиология „Стефан Ангелов” при БАН, Лаборатория по приложни биотехнологии” – гр. Пловдив
от доц. д-р Дора Миленова Бешкова, Институт по микробиология „Стефан Ангелов” при БАН, Лаборатория по приложни биотехнологии” – гр. Пловдив, назначена за член на научното жури от Директора на Институт по микробиология „Стефан Ангелов” при БАН, със Заповед № І-153/20.07.2011 г.

Алкалоидите са продукти на вторичния метаболизъм и като биологично активни вещества са обект на непрекъснато изследване от научната общност. Разнообразието в структурите и механизмите на действие на алкалоидите ги превръщат в търсени съвременни средства в борбата срещу някои социално значими заболявания (болестта на Алцхаймер, на Хънтингтън и др.).

Растителните in vitro системи са перспективна алтернатива за запазване от изчезване на естествените източници за биосинтез на биологично активни вещества, от една страна и за задоволяване на растящите нужди от тези вещества за нуждите на медицината и фармацевтичната промишленост. Такова иновационно решение предлага натоящия дисертационен труд на докторант Иван Иванов. Предложена е in vitro система в качеството си на технологична матрица за получаване на биологично активното вещество – галантамин от сем. Amaryllidaceae.
Дисертационният труд е представен върху 256 страници, в които са включени 48 таблици и 61 фигури. Библиографска справката обхваща 306 лит. източника, от тях 302 от чужди автори и 4 – от български. Цитираната литературата е тясно свързана с темата на дисертационния труд, като 44 % от включените автори са през последните 10 години.
Литературният обзор е творчески структуриран в съответствие с темата, целта и задачите на дисертационния труд и включва добре балансирани раздели. Въз основа на анализа от литературната справка, относно структурата, биосинтетичния път на получаване и механизъм на инхибиращо действие дисертантът избира за обект на дисертационния труд алкалоидът галантамин, като най-ценния сред алкалоидите от сем. Amaryllidaceae. Аналитичен е и последващият избор на конкретен растителен вид за продуцент на галантамин – Leucojum aestivum L., подходящ за култивиране при in vitro условия. Задълбочена литературна осведоменост Иванов проявява и при избора на култивационна система за биосинтез на галантамин от Leucojum aestivum L.
Целта е ясно и точно формулирана и от нея са дефинирани 6 задачи.
Оценка на използваните методи и получени резултати:

Изхождайки от факта, че Leucojum aestivum G80 shoot културата синтезира едновременно три алкалоида (галантамин, норгалантамин и ликорин) и неприложимостта на съществуващите и описани в научната литература HPLC методи за количественото им определяне, докторантът си поставя за 1-ва цел да модифицира един от най-използваните методи, разработен и описан от Sellés и колектив (1999) за определяне на алкалоиди от сем. Amaryllidaceae. Тук трябва за отбележим високата ерудираност на Иванов в областта на естествените науки и личният му принос за създаването на нов HPLC метод (чрез моделиране на подвижната фаза и скоростта на потока) за количествено определяне на горе посочените алкалоидни комплекси, тъй като те са основна методична база за следващите изследвания в дисертационния труд, свързани с анализа на промяната на алкалоидния профил на Leucojum aestivum G80 shoot културата при различни условия на култивиране, както и за количествените анализи при оптимизиране на биосинтетичния процес при различни култивационни системи.

Оптимизирането на растежните и биосинтетичните условията за max биосинтез на галантамин Иванов решава чрез прилагането на оригинален подход – използване на мултиметаболитния анализ като отговор за изясняване на връзките м/у условията на култивиране и вторичния метаболизъм на изследваната растителна in vitro система. Такъв подход е осъществен за първи път и няма подобни докладвани резултати в достъпната научна литература.

Изследван е процесът на биосинтез на галантамин от Leucojum aestivum G80 shoot култура в система с временно разбъркване тип RITA и в колонен биореактор с вътрешни секции.

За първи път са изследвани антиацетилхолинестеразните активности на външноклетъчни алкалоидни смеси, като най-висока инхибираща активност е установена при оптималните биосинтетични параметри за време на разбъркване и време на покой, но при температура по-ниска от оптималната за синтез на галантамин. За да даде отговор на това, докторантът насочва своите изследвания към масспектроскопски анализ на алкалоидните фракции, получени при различните условия на култивиране. Тук се проявява и новия подход за изследване на алкалоидния профил на екстрактите. На база получените експериментални данни Иванов задълбочено анализира влиянието на периода на разбъркване и температурата на култивиране в/у алкалоидния профил на Leucojum aestivum G80 shoot култура, развита в двете култивационни системи. Идентифицирани са 18 алкалоида, като 3 от тях са мажорни (галантамин, ликорин и хамаин), а останалите – в минорни количества. Докторантът интепретира значимостта на честотата на разбъркване по отношение на относителното съдържание на отделните алкалоиди спрямо общия йонен ток и стига до извода, че растителните shoot култури от Leucojum aestivum са добра биологична матрица както за биосинтез на галантамин, така и за изследване на ценни за медицината и фармацията алкалоиди, притежаващи различни биологични активности. От резултатите на масспектроскопдкия анализ Иванов прави и още едно заключение: съществува биосинтетична връзка м/у скелетната структура и фенол-окислителното присъединяване на общия им предшественик 4-О-метилнорбелаина, което дава основание идентифицираните алкалоиди да се групират в 4 типа –галантаминов, ликоринов, хомоликоринов и хемантадимов.

Иванов прави детайлен сравнителен анализ на резултатите при двете различни култивационни системи. Въпреки различията в култивационните системи, shoot културата показва стабилни растежни и морфологични характеристики и при двете системи. По-добри растежни и биосинтетични характеристики са получени в модифицирания колонен биореактор и безспорно го правят по-подходяща култивационна система за биосинтез на галантамин от Leucojum aestivum shoot линия G80. Постигнат е max добив от 1.7 mg/L галантамин, най-високият съобщаван понастоящем в научната литература. Установено е също, че Leucojum aestivum G80 shoot култура синтезира и значителни количества ликорин (8.32 mg/L) и норгалантамин (1.4 mg/L), алкалоиди с ценни биологични активности.

Всяка следваща стъпка в дисертационния труд на Иванов е следствие от задълбочено научно проучване и познания в дълбочина на пътищата на синтез на вторичните метаболити, продуцирани от сем. Amaryllidaceae и успешно ги манипулира за да насочи биосинтеза към целевия продукт.

Иванов включва успешно елиситирането като стратегия за оптимизиране процесите на биосинтез на алкалоиди от растителни in vitro системи. Изследвани са два вида абиотични елиситори. Резултатите от клетъчния отговор на елиситирането с метил жасмонат и жасмонова киселина показват различно и променящо се във времето индуциране на двата ключови ензима –фенилаланин амоняк лиаза и тирозин декарбоксилаза, катализиращи първото стъпало от метаболитния път на Amaryllidaceae алкалоидите, отговорни за синтеза на двата предшественика – канелена киселина и тирамин. За по-пълно и детайлно проучване на вида елиситор и точният момент на включването му в култивационната система, Иванов изследва динамиката на биосинтеза на фенолните киселини и при двата елиситора. Сравнителният анализ на получените резултати определя избора на елиситор – жасмоновата киселина, поради способността й да индуцира преимуществено активността на тирозин декарбоксилазата, водещо до по-високи концентрации тирамин, в резултат на което е постигната повишена концентрация на биосинтезирания галантамин. Убедително е доказателството, че добавянето на жасмонова киселина като елиситор не само индуцира и пренасочва вторичния метаболизъм на клетката към биосинтез на алкалоиди, но променя и съотношението на отделните алкалоиди на ниво вътре-/външноклетъчен екстракт.

Разработен е протокол за получаване на нови shoot линии Leucojum aestivum от калус чрез използване на растежни регулатори (алфа-нафтилоцетна киселина (NAA) и бензиламинопурин (BAP)). След скрининг за определяне на растежните и биосинтетични характеристики от 160 линии е селекционирана линия LaR 28, с най-висок биосинтетичен потенциал по отношение на галантамина (5.5-6.0 пъти повече галантамин от контролна линия G80). Смисълът от непрекъснато селекциониране на нови високопродуктивни shoot линии Иванов доказва чрез серия експерименти в колонен биореактор с вътрешни секции:

По отношение на растежните и биосинтетични характеристики;



  • По отношение на усвояемост на хранителните компоненти;

По отношение биосинтеза на алкалоиди;

Ö По отношение на антиацетилхолинестеразната активност;

Ö Идентификация чрез GC-MS анализи

От получените експерименталните данни Иванов обобщава, че новоселекционираната линия LaR 28 при култивиране в колонен биореактор с вътрешни секции биосинтезира галантамин с висока чистота, позволява по-евтин и бърз процес на пречистване от съпътстващите го алкалоиди и е подходяща биологична матрица за разработване на технологична схема за получаване на галантамин – чрез разработване на двуфазен метод за биосинтез на галантамин. Анализирани са растежните параметри и биосинтетични характеристики на новата shoot линия LaR 28. Отчетена е висока продуктивност на системата по отношение биосинтеза на галантамин – 168.6 μg/L на ден, което е 1.78 пъти по-висока спрямо еднофазното култивиране и 3.5 пъти по-висока спрямо контролната shoot линия G80. Максимална антиацетилхолинестеразна активност на вътреклетъчните екстракти се отчита при включване на втората фаза на 21-ия ден, като екстрахираните алкалоидни фракции от втората фаза също проявяват висока антиацетилхолинестеразна активност. От газхроматографски-масспектралните анализи се установява, че галантаминът е единственият алкалоид в алкалоидните екстракти и при трите режима на включване на втората фаза (14-ия, 21-ия и 28-ия ден) в култивационната система и предложения от Иванов двуфазен метод за култивиране на shoot култури от Leucojum aestivum е добра база за промишлено in vitro получаване на галантамин.

Успешен завършек на дисертационния труд на Иванов е предложената технологична схема за получаване на галантамин от растителни in vitro системи на Leucojum aestivum L., включваща два нови и ефективни подхода по време на биосинтеза на целевия метаболитен продукт – елиситиране и in situ екстракция на галантамин чрез използване на йонообменната смола Амберлит XAD4. Чрез този интегриран подход е постигнат добив от 5.6 mg/L галантамин и продуктивност на системата 168.6 μg/L на ден, резултати, които са личен принос на докторанта Иванов. Такива високи добиви не са съобщавани в научната литература.

Дисертационният труд завършва с 13 извода, сред които се открояват както с научен, така и с научно-приложен принос. Приемам така оформените изводите, които отразяват напълно получените в дисертационния труд резултати.


Оценка на научните и научно-приложни приноси:
Към научните приноси отнасям следните:

  1. Разработен е нов метод за разделяне и анализ на галантамин, ликорин и норгалантамин в алкалоидни екстракти на shoot култури на L. aestivum, базиран на високоефективна течна хроматография. Методът за първи път предоставя възможност за разделяне на тези три алкалоида от съпътстващите ги Amaryllidaceae алкалоиди.

  2. За първи път е приложен мултиметаболитен анализ на алкалоидните смеси, от shoot култури на L. aestivum, като елемент от интегриран подход за оптимизиране на биосинтетичния процес..

  3. Разработен е алгоритъм за селекция на shoot тип линии L. aestivum, базиран на вътреклетъчната изменчивост на вторичния метаболизъм на растителните клетки в калусната система.

  4. Идентифициран е нов за вида L. aestivum L. алкалоид при двуфазно култивиране – 3-О-метилгалантамин.


Към научно-приложните приноси отнасям:

  1. Разработен е нов двуфазен метод за култивиране на растителни in vitro системи, биосинтезиращи галантамин.

  2. За първи път е използвана „технологията” с временно разбъркване за биосинтез на Amaryllidaceae алкалоиди от диференцирани растителни in vitro системи.

  3. Разработена е технологична схема за получаване на галантамин от растителни in vitro системи на L. aestivum L.


Оценка на публикационната дейност:


    • Две статии са публикувани в списания с импакт фактор (Appl. Biochem. & Biotechnol., IF-1.88; Biotechnol. & Biotechnol. Eq., IF - 0.29) и две - са подадени за печат;

    • Една статия е публикувана в български сборник (Научни трудове, УХТ);

    • Два материала са докладвани на конференции в чужбина (Германия и Гърция);

    • Пет материала са докладвани на конференции и конгреси у нас.

С изключение в една публикация, във всичките останали публикации и доклади на конференции и конгреси у нас и в чужбина Иванов е водещ автор, което е доказателство за личния принос на докторанта в представените научни публикации.
Критични бележки:

Към дисертационния труд нямам съществени критични забележки. Докторантът се е съобразил с направените от мен препоръки и е отговорил на зададените му въпроси на предварителната апробация. Искам да изкажа своето възхищение от аналитичния стил на представяне на резултатите, както и доброто им графично и таблично оформяне.

В представения проект на автореферат на дисертацията са включени както всичките основни раздели на дисертационния труд, така и получените съществени резултати. Подтвърждавам достоверността на представените резултати в него и давам съгласието си да бъде отпечатан като оригинален автореферат.

Декларирам, че нямам конфликт на интереси с докторанта и общи научни публикации.


В заключение: Представеният дисертационен материал за защита представлява цялостна, прецизно изпълнена научна разработка по актуален проблем, с убедителен научен и приложен характер в областта на биологично активните вещества от растителни in vitro системи. Материалът отговаря на изискванията на закона за развитие на академичния състав в РБ за дисертация за придобиване на образователна и научна степен „доктор”. Всичко това ми дава основание да препоръчам на уважаемите членове на научното жури, назначено със заповед № І-153/20.07.2011 г. от Директора на Института по микробиология «Стефан Ангелов» при БАН да присъди на Иван Георгиев Иванов образователната и научна степен «Доктор» по научна специалност “Технология на биологично активните вещества” – 02.11.11.

26.09.2011 г. Рецензент:



/доц. д-р Д. Бешкова/





Каталог: IMB%20web%20page -> pzrasrb -> Doctor -> Dokumenti zashtita Ivan Ivanov -> failove
failove -> Статии, публикувани в международни списания: Ivanov I., Georgiev V., Georgiev M., Ilieva M., Pavlov A. (2011)
failove -> Лекция на shoot тип линии Leucojum aestivum
failove -> Асистент Иван Георгиев Иванов, докторант в Института по микробиология „Стефан Ангелов”
failove -> Председателя на Научното жури определено със заповед
pzrasrb -> На статиите на д-р Милка Милчева Милева, представени при кандидатстване за хабилитация I. Публикации, свързани с дисертационната
pzrasrb -> Чл кор проф д-р Мила Власковска, дф., дмн., Университетската
pzrasrb -> Публикации в научни списания
failove -> Иван Георгиев Иванов биосинтез на галантамин от растителни in vitro


Сподели с приятели:




©obuch.info 2024
отнасят до администрацията

    Начална страница