Българска Академия на Науките Секция „Репродуктивни биотехнологии и криобилогия на гаметите



Дата11.02.2018
Размер95.06 Kb.
ИНСТИТУТ ПО БИОЛОГИЯ И ИМУНОЛОГИЯ НА РАЗМНОЖАВАНЕТО

„Акад. Кирил Братанов”

Българска Академия на Науките


Секция „Репродуктивни биотехнологии и криобилогия на гаметите”

БИОТЕХНОЛОГИЯ ЗА КРИОКОНСЕРВАЦИЯ НА СЕМЕННА ТЕЧНОСТ ОТ НЕРЕЗИ


Автори: Доцент д-р Мария Иванова, дссн

Професор Драгомир Загорски, двмн
Неделчо Бобадов, доктор

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ НА СПЕРМА ОТ НЕРЕЗИ

Нискотемпературното замразяване на сперма от нерези все още не намира широко приложение в практиката, поради незадоволителните резултати, които се получават от оплодителната способност на сперматозоидите след размразяване. Тези неудачи се обясняват с недостатъчно проучените морфофункционални и физико-химични особености на сперматозоидите от нерез, механизмите на криозащита и криоувреждане при криоконсервация, както и оскъдните теоретични разработки за режими на охлаждане, пригодени към специфичните особености на еякулатите от този вид. От друга страна криоконсервацията на сперма от нерези е трудоемък процес, поради значителната вариабилност относно криотолерантността на гаметите. Последни изследвания показват, че само при 25-30% от животните, спермата запазва до 50% оплодителна способност на сперматозоидите след размразяване.


Среди за криоконсервация на сперма от нерези

Все още не е решен въпросът за целесъобразността при замразяване на целия еякулат или фракционно, както и за ролята на спермалната плазма. От изследвания в секцията по „Репродуктивни биотехнологии и криобилогия на гаметите” - ИБИР, са установени по-добри резултати при криоконсервация на гъстата фракция сперматозоиди, без отстраняване на спермалната плазма. За понижаване отрицателното влияние на плазмата върху обменните процеси и подвижността на сперматозоидите се прилагат различни способи за инактивация на сперматозоидите преди криоконсервация чрез въвеждане на вещества, свързващи кислорода. Милованов и явтори (1974) предлагат към средите за криоконсервация да се въведе натриевата сол ЕДТА, която не извлича съдържащия се в спермата калций, но има способността да свързва йоните на двувалентни метали в по-устойчиви комплекси.



В средите за криоконсервация на сперма от нерез се добиват различни захари- глюкоза, захароза (Наук, Миланов), глицерин или ДМСО, orvus es pasta (Graham et al, Westendorf). При криоконсервация в паети и гранули се получават добри резултати при използване на средите на Белтсвил, Пърсел, Джонсън, Пагикнон, Загорски, Бобадов и др.
Състав на някои от средите за криоконсервация на сперма от нерези ( г/л)




















Компоненти

1

2

3

4

5

Захароза

120

60

46.5

84

84

Глюкоза

-

6

13.5

-

6

Na ЕДТА

-

12

13.5

4

3

Трис-HCl буфер

-

-

-

3

-

Na цитрат

-

-

-

3

-

Амониев сулфат

-

-

4.5

2

-

Глицерин

40

40

40

60

60

Жълтък

200

200

200

200

200


Роля на времето на еквилибрация и начина на добавяне на глицерина върху биологичните качества на сперматозоидите от нерез

Важна роля върху подвижността на сперматозоидите с нормални акрозоми оказва концентрацията на глицерина. Доказано е от редица автори, че по-високите концентрации на глицерина в криопротективните среди влияят негативно върху тези параметри и снижават оплодителната способност на сперматозоидите (Грахам, Пърсел, Рохлоф, Иванова-Кичева и др.). Също така е доказано, че двустепенното разреждане на спермата - първоначално в среда без глицерин при температура 30ºC и след това 2-5 часово охлаждане при 4 ºC в криопротективна среда с глицерин, съхранява оптимално структурата и функцията на сперматозоидите.

Влиянията на режима на обработката на спермата от нерези, времето на въвеждане на глицерина в разредителите, както и различните схеми за еквилибрация са изследвани от редица автори ( Грахам, Рой, Кунце, Загорски, Бадер, Левин Пърсел, Джонсън и други). Съществуват различни мнения по въпроса за продължителността на еквилибрацията, като някои автори предлагат по-дълга еквилибрация- от 8-12 ч., докато други автори постигат добри резултати с еквилибрация от 4-6 часа.

При спермата от нерез важна роля влияе присъствието на антиоксиданти в разредителите, с което се снижава негативното влияние на продуктите от прекисното окисление на липидите. Такива компоненти са унитиола, бутилкситолуол, бутилксианиол и др. (Пърсел, Загорски, Коканов).


Методи и разфасовки за замразяване на сперма от нерези

Важен момент при замразяването на спермата от нерез е ходът на кристализация на течната фаза, при което настъпва фазов преход на водата в лед (Белоус, Осташко, Рове, Иванова-Кичева и др). В опитни постановки е установено, че електрическото съпротивление на сперматозоиди се променя, като първоначално то се увеличава слабо, което обуславя затормозеното движение на йоните и води до преохлаждане на сперматозоидите и в последствие нараства постепенно до момента на образуване на първите кристалчета лед. Тази фаза определя така наречената криоскопска точка, която оказва особено важна роля в процеса криоконсервация. Именно този начален етап играе особено важна роля върху преживаемостта на сперматозоидите и тяхната оплодителна способност след размразяване. Също така е необходимо оптимално съотношение на неелектролити и електролити в разредителите, което оказва особено голяма роля върху криоустойчивостта на сперматозоидите от нерез в процеса криоконсервация.

Имайки предвид, че минималната доза за едно осеменяване е 60-100 мл. повечето изследователи са разработвали методи за криоконсервация на спермата от нерез в по-големи обеми. Ильинская предлага криоконсервация в полиетиленови пликчета от 20-25 мл., Уестендорф предлага Хюлзенбергската на Нагазе-Нива под формата на гранули, Ларсон и Джонсон замразяват сперма в гранули и макситръбички, при понижаване на температурата 15-20 ºC в минута. Подобен е методът на Ходсон, който замразява сперма в тръби от 15 мл., като преди еквилибрация температурата се снижава с 5 ºC в минута за 45 минути, след което се разрежда с жълтъчно-лактозен разредител, съдържащ глицерин. Замразяването е с 5 ºC в минута до -110 ºC, след което тръбичките се потапят в течен азот. Пърсел, Джианчи и др. предлагат замразяване в паети при температурен режим 16 ºC в минута до -110 ºC и потапяне в течен азот.

Загорски, Бобадов замразяват в UMV тюбети и алуминиеви туби от 20 мл., върху парите на течен азот при -140 ºC за 20 минути.


Роля на температурните режими за размразяване върху биологичните качества на сперматозоиди от нерез

Размразяването на спермата е процес, свързан с различни физикохимични и биохимични промени, рекристализация на водната фаза, хидратация на протоплазмата на сперматозоидите, промени в осмотичното налягане, възникване на процесите дифузия и осмоза, които от своя страна могат да увредят морфологичната организация на клетките.

При размразяването на спермата от нерез трудностите се изразяват в това, че при замразяване за разлика от другите видове животни се използват големи обеми, което налага един бърз режим на размразяване. В тази връзка, Семаков, Милованов и сътр., Максуел и др., правят едновременно размразяване на 35 гранули с обем 0.5 мл всяка в 25 мл. затоплен до 95 ºC разредител. Пърсел и Джонсън предлагат след изваждане от течния азот гранулите да престоят 3 минути на стайна температура и след това да се размразят в затоплен до 55ºC разредител Белтсвил. Максуел, Ходсън размразяват туби от 30 мл. при 38 ºC. Ларсон размразява тръбички при 52 ºC за 52 секунди, при доза за осеменяване 80 мл. Осеменяването се извършва до 15-30 минути след размразяването. Други температурни режими за деконсервация са 90ºC на полиетиленови разфасовки от 25-30 мл. по метода на Ильинская. 50 ºC за 60 секунди на сперма замразена в алуминиеви туби от 14 мл. по метода на Стежежек.

В секцията по в секцията по „Репродуктивни биотехнологии и криобилогия на гаметите” – ИБИР, БАН от Загорски, Бобадов и Иванова-Кичева са проучвани различни режими на размразяване и е разработен метод за размразяване на алуминиеви туби от 20 мл. при температури 60 ºC, 65 ºC и 70 ºC. Критериите за получаване на добри резултати от ИО със замразена сперма според Мороз и сътр. са май-малко 35% подвижни сперматозоиди след размразяване и преживяемост при 37 ºC най-малко до 270-тата минута. Сердюк и сътр, Хартвинг и сътр. Са установили корелационни зависимости между преживяемостта на сперматозоидите след размразяване и тяхната оплодителна способност.


Среди за размразяване на сперма от нерези

Непосредствено след размразяване семенната течност представлява наситен глицерино-въглеродо-водно-солев разтвор, който би могъл да предизвика необратими увреждания в структурата на сперматозоидите. Общите принципи на размразителните среди е да имат сродни на спермалната плазма физико-химични качества. Такава среда е OLEP , която съдържа фруктоза, пируват натрий, CaCl2, MgCl2, KCl, NaCl и NaNCO3 . При размразяване се използва изотоничен разтвор на глюкоза, но резултатите са незадоволителни. Друга размразителна среда е средата BTS, която съдържа глюкоза, натриев цитрат, натриев бикарбонат, хелатон и калиев хлорид. В последните години се прилагат различни техники за сепариране на сперматозоидите и добавянето на инхибитори на фосфомонодиестеразите, които активират допълнително мотилитета на сперматозоидите след размразяване.


ТЕХНОЛОГИЯ ЗА КРИОКОНСЕРВАЦИЯ НА СПЕРМА ОТ НЕРЕЗИ РЕЗРАБОТЕНА В СЕКЦИЯТА ПО „КРИОБИОЛОГИЯ НА ГАМЕТИТЕ” ПРИ ИБИР-БАН
За работа се използват еякулати от нерези имащи подвижни сперматозоиди с активно настъпателни движения не по-малко от 70%, не повече от 20% аглутинация, до 20% мъртви и патологични сперматозоиди, концентрация на сперматозоидите от 7-10x 107 сперматозоида в милилитър.
Среди и пакетиращи техники за криоконсервация на сперма от нерез

След получаване и преценка семенната течност се оставя да престои 60-90 минути на стайна температура. За работа могат да се използват следните криопротективни среди: Сердика (Загорски, Бобадов) или модифициран вариант на „Сердика” с понижено съдържание на глицерин и добавен EPG20 (Иванова-Кичева, Загорски, Бобадов). От проведени проучвания е разработен метод на двустепенно разреждане (Загорски, Бобадов).

Спермата се разрежда 1+1 с първата част на разредителите, в която не е включен глицерин, след което така разредената сперма се еквилибрира при 4ºC за 210 минути. Непосредствено преди замразяване така разредената сперма се доразрежда 1+2 с предварително охладената втора част от криопротективната среда. При замразяване могат да се използват две пакетиращи технологии: замразяване в гранули върху сух лед по метода на Нагазе-Нива и разработената в секцията по „Криобиология на гаметите”- технология на замразяване в алуминиеви туби от 20.8 мл, разработена от Бобадов, Загорски. Замразяването в алуминиеви туби се извършва върху парите на течен азот при температура -140 ºC за 15 минути, след което тубите се потапят в течния азот.
Среди и температурни режими за размразяване на сперма от нерез

Размразяването на спермата, замразена под формата на гранули се извършва в разредител „Средец 13” (Загорски, Бобадов). За целта всяка една гранула се потапя за 5 секунди в 0.5 мл. предварително затоплен до 55 ºC разредител „Средец 13”, след което пробите се съхраняват във водна баня при 39 ºC. Размразяването на алуминиевите туби става при температура 60-65 ºC за 45-60 секунди, като тубите предварително са отворени и по време на размразяването се разклащат усилено. Така размразената сперма се съхранява в подходяща опаковка до момента на приложение при 39 ºC, без да се доразрежда допълнително.

Качествените показатели на спермата след рамразяване са: % подвижни сперматозоиди 35-40%, преживяемост при съхранение при 39 ºC 309-315 минути, процент сперматозоиди реагиращи на теста за АПА-64-65%, сперматозоиди със съхранена структура след размразяване 60-65%, сперматозоиди с променен акрозоми около 15-25%, сперматозоиди с промени в шийка, тяло и опашка около 7-15%.

При използване на разработените разредители, технологии за пакетиране и метод на размразяване при изкуствено осеменяване на свине се постига оплодотворяемост, отчетена по опрасванията 50-52.50%.



Изготвил: Доцент д-р Мария Георгиева Иванова - Кичева, дссн,

Секция „Репродуктивни биотехнологии и криобилогия на гаметите”


База данных защищена авторским правом ©obuch.info 2016
отнасят до администрацията

    Начална страница