Цел целта на тази стандартна оперативна процедура е да опише методът на изследване за откриване на специфични антитела срещу говеждия пестивирус (bvdv) в проби от серум или мляко. Обхват



Дата01.08.2018
Размер80.42 Kb.


Институт за контрол на ветеринарномедицински продукти

Версия: 02/ 11.06.2009г.

Лист


Стандартна оперативна процедура 022
ИЗВЪРШВАНЕ НА РЕАКЦИЯ ELISA ЗА ОТКРИВАНЕ НА АНТИТЕЛА СРЕЩУ МУКОЗНА БОЛЕСТ – ВИРУСНА ДИАРИЯ

Изменение ......./……………






  1. ЦЕЛ

Целта на тази стандартна оперативна процедура е да опише методът на изследване за откриване на специфични антитела срещу говеждия пестивирус (BVDV) в проби от серум или мляко.



  1. ОБХВАТ

Процедурата се основава на твърдофазен индиректен имуносорбентен анализ с ензимен индикатор. Резултатът се отчита чрез ELISA ридер, където оптичната плътност се измерва при дължина на вълната 450 нанометра



  1. ЧЕСТОТА НА ПРИЛОЖЕНИЕ

При постъпване на заявление за издаване/подновяване на лиценз за употреба на ВМП, както и при текущ анализ на ВМПл



  1. АПАРАТУРА, ПОМОЩНИ МАТЕРИАЛИ И КОНСУМАТИВИ

4.1. Апаратура:

    • ELISA ридер с филтър за 450 нанометра

4.2. Консумативи

    • Серумни и млечни проби за изследване

    • ELISA кит, съдържащ микротитърни плаки покрити с антиген;

    • лиофилизиран конюгат (анти- говежди моноклонални антитела от клас IgG, маркирани с пероксидаза /HRP/);

    • 20х концентриран разтвор на PBS-Tween;

    • субстратен разтвор (тетраметилбензидин в субстратен буфер, съдържащ Н2О2);

    • блокиращ разтвор;

    • серумни и млечни положителни и отрицателни контроли;

    • Дестилирана вода

4.3. Помощни материали:

  • Прецизни пипети (обхват от 4 до 200 микролитра)

  • Накрайници за еднократна употреба за пипетите

  • Стъкло или колба за приготвяне на промиващия PBS-Tween разтвор



  1. ОТГОВОРНОСТИ

Завеждащ вирусологичната лаборатория при отдел „Контрол на ИВМП”, гр. София.

  1. ПРОЦЕСНА КАРТА






  1. ПРОЦЕДУРА

Действие

От кого се извършва

Кога се извършва

Как се извършва

1. Подготовка на серумни проби


лаборант

В началото на реакцията

За всяка ямка за проба са необходими 4 μl кръвен серум. Може да се тества пресен, охладен или замразен по-рано серум.

2. Подготовка на млечни проби





В началото на реакцията

За всяка ямка за проба са необходими 100 μl обезмаслено мляко. Пробите от мляко трябва да се центрофугират в продължание на 15 минути при 2000 об/ мин за отстраняване на липидния слой.


3. Подготовка на PBS- Tween буфер





В началото на реакцията

20х концентриран разтвор на PBS-Tween се разрежда 1:20 в дестилирана вода.

За една плака са необходими 500 мл разтвор, който се получава чрез прибавяне на 25 мл концентриран PBS-Tween разтвор към 475 мл дестилирана вода и внимателно разбъркване.

Ако в стъклото с 20х концентриран разтвор на PBS-Tween има кристали, то се затопля и се разклаща добре до разтварянето им.


4. Разтваряне на HRP- конюгат





Приготвя се непосредствено преди употреба

Лиофилизираният HRP конюгат се разтваря с 11,5 мл PBS-Tween буфер. Оставя се за 1 мин и се разбърква внимателно.

Ако остане неупотребен разтворен конюгат, може да се съхранява при -20 оС и да се замразява и размрaзява отново до 3 пъти.



5. Темпериране





Преди употреба

Всички реактиви трябва да се темперират до стайна температура, 18-25оС

6. Прибавяне на PBS- Tween буфер





След темпериране

Прибавят се по 100 μl PBS-Tween буфер във всяка ямка, която ще се използва за серумни проби и серумни контроли

7. Прибавяне на серумни контроли





След прибавяне на PBS- Tween буфер


Прибавят се по 4 μl серумна положителна контрола и по 4 μl серумна отрицателна контрола в съответните избрани ямки, покрити с антиген BVDV. С цел потвърждение се препоръчва серумните контроли да се тестват в по две ямки


8. Прибавяне на серумна проба





След прибавяне на серумни контроли

Прибавят се 4 μl серумна проба в избрана ямка покрита с антиген BVDV. С цел потвърждение се препоръчва серумните проби да се тестват в по две ямки.


9. Прибавяне на млечни контроли





След прибавяне на серумна проба

Прибавят се по 100 μl млечна положителна контрола и по 100 μl млечна отрицателна контрола в съответните избрани ямки, покрити с антиген BVDV. С цел потвърждение се препоръчва млечните контроли да се тестват в по две ямки


10. Прибавяне на обезмаслено мляко





След прибавяне на млечни контроли

Прибавят се 100 μl проба от обезмаслено мляко в избрана ямка покрита с антиген BVDV. С цел потвърждение се препоръчва пробите да се тестват в по две ямки


11. Разклащане





След прибавяне на мляко

Старателно се разклаща и се покрива

12. Инкубиране





След разклащане

Инкубира при 37оС в продължение на 1 час.

13. Промиване





След инкубиране

Следва трикратно промиване с PBS-Tween буфер и внимателно се отстраняване на всички остатъци от течността чрез почукване на плаката


14. Прибавяне на HRP- конюгат





След промиване

Прибавят се във всички ямки по 100 μl HRP конюгат

15. Инкубиране





След прибавяне на HRP конюгат


Плаката се инкубира при 37оС в продължение на 1 час

16. Промиване





След инкубиране

Трикратно промиване с PBS-Tween буфер и внимателно се отстраняване на всички остатъци от течността чрез почукване на плаката


17. Прибавяне на субстратен разтвор





След промиване

Прибавят се по 1000 μl субстратен разтвор във всяка ямка

18. Инкубиране





След прибавяне на субстратен разтвор

При стайна температура в продължение на 10 минути. Времето започва да се отчита след напълването на първата ямка.


19. Стопиране на реакцията





След инкубиране

Реакцията се стопира чрез прибавяне по 50 μl блокиращ разтвор във всички ямки и внимателно разбъркване.


20. Измерване на оптична плътност





След стопиране на реакцията

Оптичната плътност (OD) на контролите и пробите се измерва с ELISA ридер с дължина на вълната 450 nm в рамките на 15 минути, след добавяне на блокиращия разтвор.


21. Оценяване на резултатите




След измерване на OD

Критерии за валидност на серумния тест- За да се гарантира валидността, серумната положителна контрола трябва да има стойност на OD > 0,6, а серумната отрицателна контрола трябва да има стойност на OD < 0.2. При невалидни тестове, анализите се повтарят.
Изчисляване на кътоф стойността при серумни проби

А= ОD стойност на отриц. контрола х 2.0

Ако А > 0.2, то А се използва за кътоф стойност

Ако А < 0.2, то 0.2 се използва за кътоф стойност



Критерии за валидност на млечния тест- За да се гарантира валидността, млечната положителна контрола трябва да има стойност на OD > 0,3, а млечната отрицателна контрола трябва да има стойност на OD < 0,15. При невалидни тестове, анализите се повтарят
Изчисляване на кътоф стйността при млечни проби

А= ОD стойност на отриц. контрола х 2.0

Ако А >0.1, то А се използва за кътоф стойност

Ако А < 0.1, то 0.1 се използва за кътоф стойност


Тълкуване на резултатите

  • всички проби с OD стойност > кътоф стойността се смятат за положителни;

  • всички проби с OD стойност < кътоф стойността, се смятат за отрицателни.







Разработил:
ИННОВА ЕООД

Утвърдил:
(име, подпис)

01/06/2009 г.


11/06/2009 г.







База данных защищена авторским правом ©obuch.info 2016
отнасят до администрацията

    Начална страница