Доц д-р Божин Димитров Камаринчев, дмн, вма член на научното жури за защита на дисертационния труд, определен със заповед на Началника на вма №828 от 04. 06. 2015

Диагностиката на тези респираторни агенти се развива с бързи темпове през периода, в който се разработва тази дисертация. В началото на проучването дисертанта проучва респираторните инфекции с помощта на класически серологични методи като: РСК,РХА,РЗХА, ИФМ, изолиране върху кокоши ембриони, както и пряко търсене на вирусен антиген от носо-гърлени отпечатъци и смивове. Следващ етап от проучването включва ELISA системите за ИгГ антитела в две серумни проби, както и за ИгМ антитела в една серумна проба. От 2004 г. до 2009 г. дисертантът разработва PCR системи за откриване на специфични участъци на ДНК на Coxiella burnetii. Усилията му продължават и до сега разработвайки метод за изотермична амплификация- LAMP.

В представения дисертационен труд автора си е поставил за цел да разработи, въведе и оптимизира съвременни диагностични методи за тази разнообразна в номенклатурно отношение група човешки патогени, и ги приложи в лабораторната практика за вирусологична и серологична диагноза на нововъзникнали заболявания, както и да проведе епидемиологични и молекулярно – генетични проучвания.

Тази цел автора разрешава с изпълнението на следните задачи:

Дисертацията е оформена в 4 раздела, които касаят проучването на автора в ретроспекцията на респираторните заболявания, регистрирани във ВМА, разработване на PCR системи за Coxiella burnetii , проучване върху полиомния респираторен вирус с PCR, както и LAMP система за детекция генома на Coxiella burnetii

Дисертационният труд е написан на 347 стр. от които 1 стр. Заглавие, 2 стр. Съдържание, 2 стр. Използвани съкращения, 5 стр. Въведение, общо 100 стр. обзор на литературата в 4-те раздела, 1 стр. цел и задачи, общо 67 стр. Материали и методи, 198 стр. резултати и обсъждане, 3 стр. резюме на резултатите и изводи, 5 стр. Заключение, 53 стр. използвана литература общо 644 автора, от които 49 на кирилица и 595 на латиница, 3 стр. списък на публикациите във връзка с дисертацията - 22 публикации, цитирани в 32 международни и български издания (с импакт фактор на цитиранията 21,003). Онагледена е с 79 таблици и 77 фигури.

Литературният обзор е представен в 4 части, предхождащ всеки от разделите на дисертационния труд. В обзора последователно се представят най-съвременни данни относно: класификацията/ таксономията/, основни микробиологични/вирусологични/ характеристики, генетични особености, наличието на плазмиди, филогенетично дърво, антигени и антигенни взаимоотношения, гени кодиращи различните антигени и тяхната експресия, имунен отговор, клинично протичане, диагностика- включваща методи за директна детекция, култивиране на хранителни среди, клетъчни култури, опитни животни, молекулярно генетични методи за диагностика /PCR и свързани с нея/, серологични/имунологични методи за диагностика-РСК, ИФМ, ЕЛАЙСА и пр. с всичките им разновидности, епидемиологията на заболяванията-начин на заразяване, резервоари на инфекцията. Всеки един от тези части на обзора завършва с изводи и набелязване на възможности за оригинални проучвания.

Във всяка една от 4-те части са надлежно описани използваните материали и методи, използвани при разработката на дисертационния труд. Описани са всички търговски набори / китове/ за всички използвани генетични и серологични тестове. Изброени са контролните бактериални ДНК, молекулярни маркери и протеинови стандарти участващи в тестовете.

Надлежно са описани всички използвани методи за екстракция на ДНК както от органи на заразени опитни животни, така и от кръвни и респираторни проби на пациенти. Подробно са описани PCR системите за всяка една от проучваните на вирусни и рикетсиални инфекции, включващо праймерни двойки фланкиращи определени участъци от гени или определени гени, условия за амплификация на всяка една от провежданите PCR реакции.

В първата част, в която дисертантът прави ретроспективни проучвания на респираторните заболявания във ВМА за период от 20 г., тестовете, с които си служи са: РСК, РЗХА, ИФМ и др. Дисертантът си служи и с комплекс статистически методи за оценка на получените резултати-средни величини, стандартно отклонение, максимална грешка, доверителен интервал, статистическа значимост на наблюдавани разлики,и пр.

В направения ретроспективен анализ на над 24 000 серологични изследвания на пациенти с респираторни заболявания, контингент на ВМА са установени най-честите причинители на респираторни инфекции за период от 20 г. (1991-2010г.). Оценена е тяхната роля и значение за периодите. 1991-2000 г. с най-голямо значение са: Adenovirus , C.burnetii- Influenza A, а за периода 2001-2010 г.: Adeno virus, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae. Установено е, че през годините етиологичната роля на някои вируси, например Adeno virus намалява, а при други респираторни агенти Chlamydia pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae се увеличава като в момента са основни водещи причинители за респираторните заболявания.Тези промени в етиологичната структура на респираторните заболявания корелират преди всичко с промяната на изследвания контингент, вследствие на социализацията и структурните промени в БА.

Във втора част на дисертацията, авторът разработва, оптимизира и внедрява PCR диагностика на респираторния полиомен вирус KI. Проучването е направено върху носо-гърлени секрети, взети от 123 деца, 134 възрастни с клинично проявени респираторни заболявания, както и на 40 пациенти с ХИВ и 27 трансплантирани пациенти. Като контроли са използвани носо-гърлени секрети от 37 здрави деца и 48 здрави възрастни. Проучването показва, че няма разлика в честотата на откриване на полиомния вирус в болните с ОРЗ и контролната група деца и възрастни, което означава, че KI не е етиологична причина за РЗ.

В групата на ХИВ-позитивните и трансплантирани пациенти, обаче, авторът открива KI в много по-висок процент, което означава, че у лица с имунен дефицит етиологичната роля на вируса е много по-вероятна.

Авторът прави секвенционен анализ на амплифицирания генен участък на PCR продукта и намира 97% хомоложност с оригиналния щам на KI. Амплификационният продукт е регистриран в световната генна банка.

В трета част на дисертацията, авторът разработва, оптимизира изпитва, внедрява и прилага PCR системи за диагностика на Q треска. В резултат на лабораторни и клинични експерименти авторът внедрява в практиката различни PCR системи: конвенционален PCR с 2 праймерни двойки, nested PCR система с други 2 праймерни двойки и real-time PCR с 2 оригинални варианта: SYBRGreen и LUX. С така разработените PCR системи, авторът проучва експериментална инфекция с Coxiella burnetii на опитни животни като проследява динамиката на инфекцията в условията на нетретирани и третирани с антибиотик животни. В отделни експерименти с кръвни проби от пациенти с Q-треска, авторът намира, че трябва да се изследва цяла кръв на пациента в първите 2 седмици от заболяването. В процеса на лечението на Ку-треската с антибиотици, както и с нарастване на титъра на антителата ИгМ и ИгГ, авторът намира,че след 2-3 седмици в същите пациенти процентът на PCR положителните намалява.

В четвъртата част на дисертацията, авторът представя резултатите от ново поколение амплификационна система в изотермични условия – LAMP за диагностика на Q треска, която въвежда за първи път в България и за втори път в световната практика. За тази цел авторът проучва системата на различни експериментални модели: екстрахирана ДНК от различни серии корпускулярен антиген, органи и кръв от заразени животни, както и жълтъчни торбички от кокоши ембриони, заразени с Q треска. Авторът сравнява чувствителността на LAMP системата с конвенционалната PCR и намира първата за по-чувствителна, като определя и границата на откриваемост на двете системи.

Представеният дисертационен труд съдържа оригинални разработки на молекулярно генетични методи за диагностика и генетичен анализ на KI и C.burnetii, даващи възможност за оценка на етиологичната им роля в респираторните заболявания. От друга страна широко се използват класически серологични методи и ELISA- системи за доказване на голям брой респираторни патогени. С този набор от методи авторът установява значението на различните респираторни патогени за българската армия. В началните години на изследването за армията значение имат аденовирусната и коксиелната инфекция, като към момента най-голямо значение имат хламидия пневмоние и микоплазма пневмоние. Проучванията, които прави върху Ку-треската имат значение не само за текущата патология, но въоръжават армията с методи и средства за бърза диагностика на една особено опасна инфекция, която може да се употреби като биологично оръжие по време на война или тероризъм.

Напълно съм съгласен с декларацията на автора за научни приноси, като искам да посоча някои от тях:

С оригинален характер са:

Извършеното изследване за респираторния полиомавирус KI с помощта на PCR, както и секвенирането на получения амплификат, което показва, че циркулиращият в България вирус се различава от първооткрития вирус с 3 %.

Разработените и оптимизирани системи за идентифициране на C.burnetii : SYBRGreen, както и LUX PCR са изпитани експериментално на опитни животни и въведени в клиничната практика.

Разработена е PCR система за откриване на специфичен участък в плазмида на C.burnetii, отговорен за нейната инфекциозност.

Проследената динамика на коксиелната инфекция в опитни животни, третирани и нетретирани с антибиотик в изпитание на различните системи C.burnetii.

Въведената LAMP система за изотермична амплификация на генома на Q треската и изпитанието му на опитни животни и клинични материали, както и определяне границата на чувствителност на метода.

Направеният ретроспективен анализ на етиологията на респираторните заболявания, изследвани във вирусологичната лаборатория на ВМА.

Научно-приложните приноси са:

Въведените PCR системи за диагностика на респираторния полиомавирус, за C.burnetii.

Приложението на PCR системите, както и LAMP системата за откриване на генома на C.burnetii в цялостна кръв от пациенти.

Комбинираният подход в диагностиката на Q треската с помощта на PCR или LAMP системите в началото на заболяването и ELISA системите за ИгМ и ИгГ антитела в по-късен етап.

Авторефератът в обем 107 стр. съответства на изискванията и отразява точно съдържанието и приносите на дисертацията. В декларацията на приносите дисертантът посочва общо 19 приноса, от които 10 научно-теоретични приноса, оригинални за България, 4 научно-приложни приноси, и 5 с потвърдителен характер, с които съм съгласен безусловно.