Доказване на ДНК от дрожди, E. coli или човек чрез pcr и гел-електрофореза



Дата03.02.2017
Размер49.82 Kb.
Доказване на ДНК от дрожди, E.coli или човек чрез PCR и гел-електрофореза

в Молекулярно-биологична лаборатория
Дата: 07.11.2014 г

Доказване на екстрахирана ДНК;


Източник на ДНК:

E. coli щам от национална микробиологична сбирка

Saccharomyces (Дрожди) от търговска мая за хляб

Епителни клетки от устна кухина на човек
Клетъчна суспензия

От всеки от източниците на ДНК се взема проба чрез стерилен памучен тампон. С тампона се обтрива изследваната повърхност, като целта е да се получи максимално количество от клетъчната проба. В микро епруветка 1,5 ml тип Епендорф се поставя 0,5  ml екстрахиращ разтвор. Епруветката се надписва с номер и дата. Тампона се потапя до дъното на епруветката и се въртеливи движения се размива пробата в разтвора. Получава се мътнина от разтворените клетки, което е изходната клетъчна суспензия.



Екстрахиращия разтвор съдържа 15% SDS, Tris-HCL, NaOH, дестилирана вода.
Проби, номерация и изследващ студент




проба

Лаб. номер

Име Фамилия

Концентрация на ДНК, ng/ml

Чистота на ДНК

1

E.coli

1

Велик Георгиев







2

Епителни клетки

2

Якоб Петров







3

Епителни клетки

3

Марин Стоев







4

Дрожди

4

Мартин Тодоров







5

Дрожди

5

Виктория Караманова







6

Епителни клетки

6

Стефка Димитрова







7

E.coli

7

Виржиния Вилхемова







8

E.coli

8

Петя Венкова







9

Епителни клетки

9

Радостина Карадиманова







10

Епителни клетки

10

Ваня Тодорова







11

E.coli

11

Антония Джон







12

Епителни клетки

12

Женя Димова

























Протокол за екстрахиране на ДНК

Клетъчната суспензия в микроепруветките се използва за Екстрахиране на ДНК по следния метод:




  1. поставяне на микроепруветките в ямките на плуващ статив

  2. поставяне на кипяща водна баня за 15 минути за клетъчен лизис

  3. центофугиране при 14 000 rpm-1 за 10 минути за утаяване на клетъчните стени и други частици

  4. от супернатанта съдържащ разтворената ДНК се прехвърлят 10 μl в микро епруветка от 200μl


Доказване на изолираната ДНК чрез гел електрофореза

  1. Приготвяне на агарозен гел с концентрация 1% и добавка на ДНК оцветител (етидиев бромид)

  2. Сглобяване на камера за изливане на гел-формата с 16 ямки

  3. Изливане на гел-формата и охлаждане

  4. Заливане на формата с буферен разтвор за електрофореза

  5. Поставяне на 10 μl от екстрахираната ДНК с GelLoading разтвор във всяка от 16-те ямки на гела

  6. Настройване на апарата за екелтрофореза90V, 90A за 30 минути

  7. Включване на апарата и провеждане на изследването

  8. Доказване на ДНК при UV-светлина в камера и снимка на видимия образ



Провеждане на PCR и доказване на амплификата (намножената ДНК)

  1. отделяне на само на епруветките с положителни резултати за ДНК

  2. приготвяне на PCR-mix в 9 обема (по 2μl) в обща микро епруветка

1xPCRbuffer, 1.5mM MgCl2; 200 μM от всеки dNTP, 0.5μM от всеки праймер; 2.0 U Taq polymerase .

  1. добавяне на 1 μl ДНК екстракт към всеки обем в отделна епруветка

  2. поставяне на всички микроепруветки в PCR апарат (термосайклър)

  3. програмиране на PCR апарата за ампилификация при следните условия:

94°С 94°С 60°С 72°С 72°С 4°С

3` 1` 1.5` 1.5` 7` ∞


  1. след края на програмата се провежда гел-електрофореза в 1,5% агарозен гел, при 120V, 90A за 40 минути.



Резултати:
Резултати от ДНК екстракция и гел-електрофореза
от модулна група A (07.Nov. 2014)

Легенда:

1 – положителна контрола

2 – отрицателна контрола

3 – В. Георгиев - Е.coli

4 – М. Стоев– епит . кл.

5 – Я. Петров - епит . кл.

6 – М. Тодоров - дрожди

7 – В. Караманова - дрожди

8 - С. Димитрова- епит . кл.

9 – В. Вилхемова - Е.coli

10 – П. Венкова - Е.coli

11 – Р. Карадиманова - епит . кл

12 – В. Тодорова - епит . кл

13 – А. Джон - Е.coli

14 – Ж. Димова - епит . кл.

.

При всички проби (без отрицателната контрола) се отчита наличие на екстрахирана ДНК. Единствено при проба 13, липсва банд на ДНК, поради неправилно пипетиране и изтичане от ямката на гела.






Каталог: truni6 -> wp-content -> uploads -> vmf -> file
file -> Молекулярно-биологичен анализ на суровини и храни доказване на ДНК от хранителни продукти, дрожди, E. coli или човек
file -> Ветеринарномедицински факултет стара загора Правилник
file -> Акушерство, гинекология и андрология
file -> Доклад за живота и творчеството му от Декана на вмф проф. М. Люцканов зала №6
file -> Програма " ветеринарна администрация"
file -> С п и с ъ к на студентите по ветеринарна медицина v-ти курс, 1 група, учебна 2016/2017година
file -> С п и с ъ к на студентите по ветеринарна медицина vi-ти курс, 1 група, учебна 2017/2018година
file -> Списък на студентите от ІV курс, които ще проведат клиничния си стаж в клиниката на вмф


Поделитесь с Вашими друзьями:


База данных защищена авторским правом ©obuch.info 2019
отнасят до администрацията

    Начална страница