[Ензими] Ензими Цел



страница5/6
Дата21.08.2017
Размер0.67 Mb.
#28443
1   2   3   4   5   6

Фиг. 4-26. Структура на някои антиметаболити: сулфаниламид - антиметаболит на р-аминобензоена киселина; алопуринол - антиметаболит на хипоксантин; 5-флуорурацил - антиметаболит на пиримидинови бази; 6-меркаптопурин - антиметаболит на пуринови бази.




Фиг. 4-27. Структура на метотрексат, антиметаболит на фолиева киселина.

Метотрексат (аметоптерин) се използува за лечение на детска левкемия (злокачествено делене на левкоцити), тъй като е близък структурен аналог на фолиева киселина. Инхибира редукцията на фолат до ФК.Н2 и ФК.Н4:

дихидрофолат редуктаза             дихидрофолат редуктаза
ФК -----------------------------> ФК.Н2 -----------------------------> ФК.Н4
Метотрексатът се свързва 1000 пъти по-здраво от ФК.Н2 и затова е мощен конкурентен инхибитор на ензима. Не се получава тетрахидрофолат (ФК.Н4), който е необходим за синтезата на ТМФ. Спира синтезата на ДНК, клетъчното делене и развитието на левкемията. Но бързо делящи се човешки клетки от костен мозък също са чувствителни към лекарството. Освен това продължителна употреба предизвиква амплификация на гена за ФК.Н2-редуктазата, увеличава се синтезата на ензима и растежът на резистентните клетки.

Особено интересен е примерът с алопуринол, използван при лечение на хиперурикемия и подагра. На фиг. 4-28 е сравнена структурата на алопуринол и хипоксантин. Разликата при тях е само в размяната на атомите 7 и 8. В началото алопуринол действа като субстрат на ксантин оксидазата, а после като неин инхибитор. Ензимът го превръща в алоксантин, който остава здраво свързан с активния център. Затова подобни инхибитори се наричат самоубийствени субстрати.








Фиг. 4-28. Структура и механизъм на действие на алопуринол върху ксантин оксидазата.

Като много близък структурен аналог на хипоксантин, алопуринол действа като неин "самоубийствен субстрат".

Фиг. 4-29 обобщава действието на алопуринол. Освен като инхибитор на ксантин оксидазата, алопуринол снижава общата скорост на образуване на пурини по пътя de novo, защото свързва част от ФРФФ, който е междинен метаболит и активатор на този път.
След въвеждане на алопуринол се прекратява образуването на пикочна киселина. Концентрацията на хипоксантин и ксантин (по-разтворими) в серума се увеличава, а тази на пикочната киселина се снижава. Намаленото образуване на пуринови нуклеотиди снижава образуването на пикочна киселина.







Фиг. 4-29. Действие на алопуринол при лечение на хиперурикемия и подагра:

1) инхибира ксантин оксидазата като структурен аналог на хипоксантин;


2) снижава скоростта на синтеза на пуринови нуклеотиди, тъй като свързва ФРФФ, който е метаболит и активатор на този път.

4.3.6 Активиране на ензимното действие

Активатори са вещества, които повишават скоростта на катализираната реакция. Могат да бъдат ензими, метаболити, метални йони. При металните йони е трудно да се разграничи точно дали йонът действа като активатор или кофактор.

Тук влизат и случаите на алостерично активиране (виж т.4.3.7) и на превръщане на неактивни ензимни предшественици (преензими или проензими) в активни ензими, разгледано по-долу.

Преензимите са предшественици на протеази, необходими за три важни типа процеси: храносмилане, кръвосъсирване и за разтваряне на съсиреците.
Секретирането им като неактивни предшественици предпазва от смилателното им протеолитично действие, и така осигурява защита за тъканта, която ги произвежда. Освен това улеснява бързата им мобилизация, без да е необходима нова белтъчна биосинтеза. При превръщането им в активни ензими става необратимо протеолитично откъсване на един или повече пептиди от веригата на преензима, при което се намалява молекулното тегло, отблокират се важни групи, необходими за формиране на активния център. Настъпват конформационни промени и оформяне на активния център. Обикновено откъсването на блокиращия пептид или пептиди става под действие на друг ензим или автокаталитично.- така трипсиногенът съдържа в амино-края хексапептид, който се отделя под действие на ентерокиназа (пептидаза от чревния сок), а също и на самия трипсин автокаталитично (фиг. 4-30).




Фиг. 4-30. Активиране на ензимния предшественик трипсиноген в активен ензим трипсин. По Т. Николов, с разрешение.

От химотрипсиноген (245 аминокиселинни остатъци), под действие на трипсин и автокаталитично, се извършват следните промени:

1) разкъсва се пептидната връзка между 15 и 16 остатъци. Междинно се получават две вериги: 1-15 и 16-245.

2) От 1-15 се отделя дипептида 14-15, а от 16-245 се отделя дипептида 147-148.


Получават се три вериги 1-13, 16-146 и 149-245, които са свързани помежду си чрез дисулфидни връзки.

4.3.7 Алостерично повлияване

От биологична гледна точка най-важното неконкурентно инхибиране е алостеричното инхибиране. Всъщност по-общото понятие е повлияване. То включва инхибиране и активиране. Ефекторите биват отрицателни (инхибитори) и положителни (активатори). При него крайният продукт в метаболитната верига или друго съединение повлиява първия специфичен за веригата ензим, или скорост-определящия ензим, или и двата заедно, ако не съвпадат. Ефекторът няма структурна прилика със субстрата на повлиявания ензим. Алостеричният ефектор се залавя не за активния център, а за друг алостеричен център и предизвиква конформационна промяна, която повлиява и активния център - активността на ензима се инхибира или увеличава. При потискане на начален ензим от крайните продукти в дадена верига се използва и израза ретроинхибиране или потискане чрез обратна отрицателна връзка.

В ензимната молекула има един активен център, но няколко алостерични центрове, чрез които ензимът приема сигнали за разнообразни регулаторни въздействия. Алостеричните ензими са обикновено с четвъртична структура и за тях не е валидно уравнението на Michaelis-Menten. Вместо правоъгълна хипербола, зависимостта на V от [S] е сигмоидна крива. Алостеричното повлияване е застъпено при важни синтезни вериги - напр. синтеза на пуринови (фиг. 4-31 и пиримидинови нуклеотиди (фиг. 4-32).

На фиг. 4-31 се вижда, че получаващите се като крайни продукти пуринови нуклеотиди (АМФ и ГМФ) действат като алостерични инхибитори на първите два ензима в собствената си синтеза по пътя de novo. Тези ензими ФРФФ синтетаза и глутамин-ФРФФ амидотрансфераза са регулаторни и скорост-определящи. ИМФ, предшественик на АМФ и ГМФ, също действа като алостеричен инхибитор на тези ензими. ФРФФ е не само субстрат, но и алостеричен активатор на втория ензим.







Фиг. 4-31. Пример за алостерични повлиявания в синтезата на пуринови нуклеотиди (опростена схема).

С отрицателен знак е представено алостеричното инхибиране на двата регулаторни ензими от крайните продукти ИМФ, АМФ и ГМФ, а с положителен знак е представено алостеричното активиране на амидотрансферазата от ФРФФ.



Пиримидиновите, както и пуриновите нуклеотиди инхибират алостерично собствената си синтеза, но съществува и по-сложна регулация между двата вида нуклеотиди - напр. АТФ активира синтезата на пиримидинови нуклеотиди ( фиг. 4-32 в т.
т. 4.3.8.2.
Така се уеднаквява скоростта на образуване на двата вида нуклеотиди.

4.3.8 Примери за приложение на познанията върху алостерично повлияване в клиничната практика

4.3.8.1 Дефект в алостеричното повлияване на ФРФФ амидотрансфераза от крайните продукти - причинява подагра

Познанията върху алостерично повлияване позволяват да бъде обяснен и друг механизъм за възникване на подагра, освен разгледаните случаи в т. 4.2.10.1 (мутации в ензима, водещи до повишена Vmax или намалена Km). Подагра може да възникне и поради мутация, засягаща алостеричен център за потискане на главния регулаторен ензим ФРФФ амидотрансфераза от крайните продукти (пуриновите нуклеотиди) [11] - виж фиг. 4-31 в т. 4.3.7. Дефектният алостеричен център не "усеща", че има достатъчно пуринови нуклеотиди и ензимът не се инхибира. Увеличеното количество на пуринови нуклеотиди е причина за получаване на повече пикочна киселина, както бе вече показано.


4.3.8.2 Лечение на оротатурия чрез алостерични инхибитори

Познанията върху алостерично повлияване позволяват провеждане на лечение при оротатурия. Това е наследствено заболяване, свързано с нарушения в синтезата на пиримидинови нуклеотиди (фиг. 4-32). Има недостатъчност на два ензима в биосинтезната верига на пиримидинови нуклеотиди: оротат фосфорибозил трансфераза (Е5) и оротидин-5'-фосфат декарбоксилаза (Е6), което води до натрупване на междинния метаболит оротат в кръвта, а оттам той минава и в урината. Липсват крайните продукти пиримидинови нуклеотиди, а те са необходими за синтеза на НК, за клетъчното делене, особено за еритропоезата. Пациентите са бледи и отпаднали.







Фиг. 4-32. Лечение при оротатемия чрез пиримидинови нуклеотиди, които като крайни продукти алостерично инхибират ендогенната синтеза.

На фиг. 4-32 е показано мястото на действие на пиримидиновите нуклеотиди като алостерични инхибитори върху началните регулаторни ензими в тяхната синтеза. УТФ и ЦТФ инхибират двата начални ензима, а ТДФ снема активиращия ефект на ФРФФ.

Приемането на липсващите нуклеотиди (а дори и нуклеозиди) подобрява състоянието. Изчезва оротат в урината. Това става, тъй като добавените нуклеотиди потискат чрез обратна връзка началните ключови ензими карбамилфосфат синтетаза и аспартат транскарбамилаза.


4.3.9 Регулация на ензимите чрез обратимо ковалентно фосфорилиране-дефосфорилиране. Пример - каскада за повлияване на гликогенфосфорилаза и гликогенсинтаза

4.3.9.1 Общи принципи

Известни са различни случаи на регулиране на ензимната активност чрез обратима ковалентна модификация като метилиране, аденилиране, фосфорилиране и др.


Сред тях обратимото ковалентно фосфорилиране-дефосфорилиране на ензими е най-широко застъпеният и съществен регулаторен механизъм. Селективното фосфорилиране се катализира от протеин кинази, а последващото дефосфорилиране - от протеин фосфатази.

Протеин киназите фосфорилират специфични остатъци в регулаторни ензими (хидроксилни групи от серин и треонин, фенолна група от тирозин и хистидинови остатъци) като пренасят върху тях -фосфатна група от АТФ. Фосфатазите катализират хидролитното отделяне на фосфатната група от тези остатъци.

За някои от повлияваните ензими активна е фосфорилираната форма - напр. гликоген фосфорилаза. При други ензими активна е дефосфорилираната форма - напр. гликоген синтаза.

Протеин киназите и протеин фосфатазите се означават като конверторни ензими. Ензимите, повлиявани чрез фосфорилиране-дефосфорилиране се наричат интерконвертируеми ензими. Самите протеин кинази и протеин фосфатази могат да бъдат и интерконвертируеми - т. е. също да бъдат регулирани чрез фосфорилиране-дефосфорилиране. Конверторните ензими и интерконвертируемите ензими са част от регулаторни каскади, всяка от които реагира на сигнал, пренасян от хормон или вторичен посредник.


4.3.9.2 Сравнение с ретроинхибиране

Обратимото ковалентно фосфорилиране-дефосфорилиране на ензими прилича на алостеричното инхибиране (ретроинхибиране - виж т. 4.3.7. със следните особености:
1) осигурява бърза регулация на ензимното действие в отговор на специфични физиологични сигнали.
2) действа в ранен етап на метаболитната верига, като обикновено се повлиява първият специфичен за веригата регулаторен ензим.
3) Въздейства върху алостерични центрове, а не върху каталитичния център.

Различава се от ретроинхибирането по това, че при ретроинхибирането се повлиява единичен ензим и не участват хормонални и нервни въздействия. Регулацията чрез фосфорилиране-дефосфорилиране включва няколко ензима и е под директен нервен и хормонален контрол. Освен това се изисква АТФ като донатор на фосфатна група.

Ретроинхибирането действа, без да променя генната експресия, като повлиява активирането на наличен ензим. При фосфорилиране-дефосфорилирането в едни случаи генната експресия не се променя (напр. при описаната в т. 4.3.9.3. каскада, включваща протеин киназа А). Чрез фосфорилиране обаче могат да се задвижат и други пътища, водещи до промяна в генната експресия.
Много рецептори за хормони (напр. инсулин) и растежни фактори имат тирозин киназна или автотирозин киназна активност. (виж т. 16.7.4). Фосфорилират се тирозинови остатъци в самия рецептор и в други цитоплазмени ензимни и неензимни белтъци. Това фосфорилиране на свой ред активира различни каскади, повлияващи генната експресия, т.е. синтезата на нов ензим.

4.3.9.3 Пример - каскада за повлияване на гликоген фосфорилаза и гликоген синтаза чрез фосфорилиране-дефосфорилиране

На фиг. 4-33 е представена опростена схема за активиране на гликоген фосфорилазата и инхибиране на гликоген синтазата чрез каскада от реакции на фосфорилиране, задвижена от хормона адреналин, отделящ се при стрес. Свързването на този хормон към специфичен мембранен рецептор (разгледано подробно в гл. 17) води до активиране на ензима аденилат циклаза. Аденилат циклазата превръща АТФ в цикличен АМФ, който активира протеин киназа А. Оттук започват няколко реакции на фосфорилиране.

Протеинкиназа А фосфорилира и активира киназата на фосфорилазата, а тя фосфорилира неактивната гликоген фосфорилаза b и я превръща в активна гликоген фосфорилаза a, необходима за разграждане на резервното гориво гликоген.






Фиг. 4-33. Пример за регулация на ензими чрез фосфорилиране-дефосфорилиране - активиране на гликоген фосфорилаза и инхибиране на гликоген синтаза чрез каскада от реакции на фосфорилиране, задвижена от хормона адреналин. Дефосфорилирането инхибира фосфорилазата и активира гликоген синтазата.

Протеин киназа А фосфорилира и гликоген синтаза a, но с това я инактивира - превръща я в неактивна гликоген синтаза b.

Така координирано и реципрочно се регулират регулаторните ензими на двата противоположни пътя - разграждане и синтеза на гликоген. Когато фосфорилазата е в активната си фосфорилирана форма, фосфорилираната гликоген синтаза е неактивна и обратно. Активната форма на фосфорилирания ензим се означава с буквата "а", а неактивната форма - с буквата "b". Дефосфорилирането чрез фосфопротеин фосфатаза 1 инхибира гликоген фосфорилазата и активира гликоген синтазата (фиг. 4-34).
Активните форми на ензимите са дадени на зелен фон, а неактивните - на червен. Мембранно-разположеният рецептор на адреналин и предаването на хормоналния сигнал са описани в глава 17.



Фиг. 4-34. Фосфорилиране на гликоген фосфорилаза и гликоген синтаза под действие на протеин киназа А и дефосфорилиране под действие на фосфопротеин фосфатаза 1.

4.4 Клинично значение на ензимите

4.4.1 Резюме

Познанията върху ензими намират широко приложение в клиничната практика. Голям брой заболявания са пряко свързани с промени в ензимна активност и нейното определяне дава ценна информация за протичащите в организма процеси. Определянето на ензимни активности в кръв и други биологични течности се използва в диагностиката на различни заболявания. Важно е спазването на определени правила, както при вземане на кръвни и други проби, така и при определяне на ензимната активност.

Съвременните направления в ензимната диагностика се основават на:

1)Доказване на нехарактерни за серума вътреклетъчни ензими;

Специфични маркери за заболяване на даден орган са напр.увеличението на кисела фосфатаза при карцином на простатата; на трансаминази при вирусен хепатит и др. При инфаркт се следят промените в креатинфосфокиназа, глутамат-оксалацетат трансаминаза и лактат дехидрогеназа. Особено ценни са изоензимите, специфични за даден орган - напр. МВ-изоензимът на креатинфосфокиназата произхожда само от миокарда, затова при сърдечен инфаркт винаги се следи този изоензим. Електрофореграми и денситограми на изоензими на лактат дехидрогеназата се използват за диагностика на сърдечни и чернодробни увреждания.
2) Установяване на промени в типичните за серума функционални ензими;
Диагностично значение има намаляване на активността им, което е признак за нарушение във функцията на органа, който ги произвежда.

3)Доказване на генетично обусловени ензимопатии.


Това са наследствени заболявания, при които поради мутация в гена, се синтезира ензим с променена първична структура и пространствена организация, който не упражнява своята биологична функция. При блокиране на ензимното действие се натрупва субстратът на реакцията, който обикновено се насочва в страничен път и там се получават вредни съединения. Не се получава нормалният продукт и това допълнително оказва неблагоприятни ефекти.

4) Използване на специфични рестриктази за директно изследване секвенцията на ДНК и установяване дефекти в гените.

Ензимите намират приложение и за терапия на някои заболявания. Напр. стрептокиназа и алтеплаза се използват при инфаркт като тромболитични агенти, тъй като превръщат плазминоген в активен плазмин, който разтваря фибринови съсиреци. Аспарагиназа се използва при лечение на някои форми на левкемия, тъй като разграждайки аспарагин в плазмата, снижава нивото му под необходимото за туморните клетки.

Имобилизираните ензими (ензими, свързани към неразтворима мембрана) са по-стабилни спрямо денатуриращи фактори и поради това работят с висок капацитет продължително време. Прилагат се за бързи скриниращи изследвания на населението - напр. за определяне на холестерол с имобилизирана холестерол оксидаза. Използват се и във фармацевтичната промишленост за производство на някои лекарства.

Ролята на комплекси "ензим-антитяло" в клиничния анализ е разгледана чрез примера за определяне белтъците на вируса на СПИН по метода ELISA.

4.4.2 Изисквания при определяне активността на ензими в клиничната практика

При вземане на кръвни проби за ензимни определения трябва да се избегне възможността за денатурация на интересуващите ни ензими. Недопустимо е интензивно разклащане и нагряване на кръвните проби. Трябва да се внимава и с използваните антикоагуланти или консерванти, тъй като някои от тях могат да действат инхибиращо върху някои ензими. Определенията за ензимна активност не трябва да се правят с хемолизирала кръв. Това е особено важно, тъй като освободените от еритроцитите ензими биха завишили резултатите.

Ензимната активност зависи от температурата и рН, така че за да се сравняват резултатите с нормалните стойности, необходимо е ензимните определения да се извършват при стандартни условия и излишък от субстрат. Въпреки старанията, обикновено има известни вариации в ензимната активност при различни лаборатории.


4.4.3 Роля на нехарактерни за серума вътреклетъчни ензими за диагностиката на различни заболявания

Появата на неспецифични за плазмата вътреклетъчни ензими е ценно от диагностична гледна точка. Обикновено плазмените нива на тези ензими са ниски или нулеви. Увреждането на тъкани променя клетъчната мембранна пропускливост или предизвиква смърт на клетки, което води до освобождаване на вътреклетъчни ензими в плазмата. Когато има промени в пропускливостта, по-нискомолекулните ензими ще се появят първи в плазмата. Колкото е по-голям концентрационният градиент между клетъчните и извънклетъчните нива, толкова по-бързо ще дифундира ензимът навън. Цитозолните ензими се появяват преди митохондрийните. Колкото по-голяма част от тъканта е увредена, толкова е по-голямо увеличението в плазменото ниво. Неспецифичните за плазмата вътреклетъчни ензими се отстраняват от плазмата с различни скорости, което зависи от стабилността на ензима и поемането му от ретикулоендотелната система.

Има ензими, които са специфични маркери за заболяване на даден орган,. Напр. киселата фосфатаза от простатната жлеза се увеличава при карцином на простатата. При остър панкреатит се увеличават липаза и амилаза. При вирусен хепатит е увеличена глутаматпируват трансаминаза (синоним аланинаминотрансфераза).

На фиг. 4-35 са дадени ензимите, които най-често се използват за диагностика на инфаркт. Първи в серума (още след 4-я час) се увеличава ензимът креатинфосфокиназа. Обикновено между 12-ия и 14-ия час активността му е максимална. Стойностите му се нормализират между 48-ия и 60-ия час.

Малко по-късно, след 6-ия час, се повишава и глутамат-оксалацетат трансаминаза (синоним аспартат аминотрансфераза) и достига максимум между 12-ия и 14-ия час. Стойностите се нормализират след 4-ия ден.

Най-късно (след 24-ия до 48-ия час) се наблюдават увеличени нива на лактатдехидрогеназата. Активността е максимална между 4-ия и 6-ия ден. Стойностите обикновено се нормализират след 8-ия ден.








Фиг. 4-35. Ензимни профили след инфаркт на миокарда.
1 - креатинфосфокиназа;
2 - глутамат-оксалацетат трансаминаза (синоним аспартат аминотрансфераза);
3 - лактатдехидрогеназа.


Каталог: wp-content -> uploads -> 2016
2016 -> Цдг №3 „Пролет Списък на приетите деца
2016 -> Българска федерация по тенис на маса „В”-1” рг мъже – Югоизточна България мъже временно класиране
2016 -> Национален кръг на олимпиадата по физика 05. 04. 2016 г., гр. Ловеч Възрастова група клас
2016 -> Българска федерация по тенис на маса „А” рг мъже – Южна България мъже временно класиране
2016 -> Конкурс за изписване на великденски яйце по традиционната техника съвместно с одк велинград 27 април
2016 -> Министерство на образованието и науката регионален инспекторат по образованието – софия-град


Сподели с приятели:
1   2   3   4   5   6




©obuch.info 2024
отнасят до администрацията

    Начална страница