СЕЛСКОСТОПАНСКА АКAДЕМИЯ
АГРОБИОИНСТИТУТ
Лилия Николова Георгиева
ИЗСЛЕДВАНЕ НА ВЗАИМООТНОШЕНИЕТО
РАСТЕНИЕ-ПАТОГЕН ПРИ БЛАТНОТО КОКИЧЕ (LEUCOJUM AESTIVUM L.)
АВТОРЕФЕРАТ
НА ДИСЕРТАЦИЯ ЗА ПРИДОБИВАНЕ НА ОБРАЗОВАТЕЛНА И НАУЧНА СТЕПЕН “ДОКТОР” ПО НАУЧНА СПЕЦИАЛНОСТ РАСТИТЕЛНА ЗАЩИТА
шифър 04.01.10
Научен ръководител: Доц. д-р Виолета Кондакова
София, 2012
Дисертационният труд съдържа 150 страници, съдържа 48 фигури и 20 таблици. Списъкът на използваната литература включва 258 заглавия, от които 235 на латиница и 23 на български език.
Защитата на дисертационния труд ще се състои на от часа в залата на АгроБиоИнститут (бул. “Драган Цанков” 8).
УВОД
Блатното кокиче (Leucojum aestivum L.) е един от най-интересните видове от биологична и стопанска гледна точка, тъй като е с установено високо съдържание на алкалоида галантамин (активното вещество на нивалина). Галантаминът намира широко приложение в индивидуални или комбинирани лекарствени форми като мощно антихолинестеразно средство. Използва се с успех при лечение на болестта на Алцхаймер.
Естествените находища на блатното кокиче в България са ценни заради високото съдържание на галантамин в тях в сравнение с популациите в други балкански страни. Почти липсват сведения за патогени при блатното кокиче като изключим няколко съобщения за гъбни болести в изкуствени насаждения преди повече от 10 години. Не е ясно дали има други и по какъв начин влияят на продуктивността на растенията. За да се отговири на тези въпроси са необходими значителни предварителни сведения за моментното състояние на естествените находища, както и да се получи достатъчно материал за изследвания. Тъй като растението е защитено от закона, а и се размножава бавно в естествени условия, най-добрият алтернативен начин е микроразмножаването му in vitro.
По тези причини целта на дисертационния труд е в малко по-широк смисъл от заглавието на разработката. Настоящата дисерация е разработена в 4 основни етапа:
-
Проучване състоянието на естествени находища на блатно кокиче
-
In vitro размножаване на блатно кокиче
-
Взаимодействие на блатно кокиче с патогени
-
Фитохимични изследвания, които се провеждат във връзка с всеки един от предходните етапи.
ЦЕЛ И ЗАДАЧИ
Целта на настоящия дисертационен труд е комплексно биологично характеризиране на естествени популации от блатно кокиче (Leucojum aestivum L) в България и проучвания върху факторите, определящи синтеза на галантамин и взаимодейтвието растение – патоген.
Реализирането на поставената цел се сведе до изпълнението на следните основни задачи:
-
Обследване на естествените популации от блатно кокиче (Leucojum aestivum L) в България и подготовка на проби (листа и луковици) за анализи.
-
Приложение и адаптиране на in vitro технологията за поддържане, размножение и съхранение на блатно кокиче.
-
Създаване на in vitro и ex situ колекции за съхранение на генетичен материал с автентичен произход.
-
Събиране на растителен материал с патогенни симптоми.
-
Идентифициране на патогени чрез електрономикроскопски и молекулярни методи.
-
Анализ на взаимодействието растение-патоген чрез изкуствени заразявания на in vitro луковици.
-
Фитохимичен анализ на алкалоидния състав на in vitro материал и на образци от естествени местообитания.
-
Метаболитен анализ на здрави и изкуствено заразени in vitro растения от блатно кокиче, посредством GC-MS анализ.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ
1. Обект на изследване –блатно кокиче (Leucojum aestivum L.) от 33 естествени находища на България. 2. In vitro техники, използвани за размножаване на Leucojum aestivum и създаване на in vitro колекция. 2.1 Стерилизация и въвеждане в in vitro култура - по twin-scaling метода (Popov and Cherkasov, 1984). 2.2 Основни хранителни среди, използвани в настоящата работата за растежа и развитието на блатното кокиче in vitro – табл. 1
Табл.1. Варианти на хранителни среди за култивиране на блатно кокиче при in vitro условия
2.3 Съхранение на in vitro култури при ниски положителни температури.- една година при температура +4 Со
3. Взаимодействие между блатно кокиче и бактериални патогени
3.1. Сканираща електронна микроскопия – използван е необработен свеж in vitro материал, сканиращ микроскоп (модел “JEOL 5510”).
3.2. Изолиране и идентифициране на бактериални патогени
3.2.1. Изолиране на бактериални патогени от луковици на блатно кокиче - Направени са изолации по метода на Rudolph et al. (1990) в Институт за защита на растенията, Костинброд. Бактериалните изолати са подържани на хранителни среди:LB (Bertani, 1951) и КВ (King, 1954)
3.2.2. Определяне на основни характеристики на бактериалните изолати
А) Макроморфологични характеристики – Определени са макроморфологичните им характеристики, чрез наблюдение на колониите на светлинен микроскоп (увел.4х, 8х).
Б) Патогенитет - За определяне патогенитета на бактериите са подбрани тест растения, като тютюн, който не е гостоприемник; лук - универсален гостоприемник;
В) Реакция на свръхчувствителност - определна върху листа от тютюн по метода на Klement, 1963.
Г) Симптоми при различни гостоприемници - Симптомите се предизвикват след изкуствено заразяване чрез набождане на люспи от луковици на блатно кокиче, зюмбюл, лале, нарцис и минзухар.
Д) Определяне реакцията на изолатите по Грам: според Ризванов и др., 1977.
Е) Секвенционен анализ - Изолирана е тотална ДНК от бактериалните изолат чрез GFX Genomic Blood DNA Purification Kit (AMERSHAM BIOSCIENCES). От нея се амплифицира гена за 16s рибозомна РНК, като се използва универсална двойка праймери F1- 5’- GGAGAGTTAGATCTTGGCTCAG и F2 - 5’-AAGGAGGGGATCCAGCCGCA - (Ponsonnet аnd Nesme, 1994) (http://www.microsynth.ch/). При амплификацията се получава продукт с големина 1479 бд . PCR програмата е: 5min-94 oC, 35 цикъла (1 min-94 oC, 1 min-55 oC, 2 min-72 oC); 15 min -72oC.
PCR продуктите се разделят в 0.8 % агарозен гел в 1х ТВЕ буфер, 100 V, за 1h. За пречистване се използва кит (GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit, AMERSHAM BIOSCIENCES), а секвенирането е проведено в лабораторията на Института по молекулярна биология на университета Zurich-Irchel, Швейцария.
3.3. Анализ на взаимодействието растение –патоген чрез изкуствени заразявания на in vitro луковици
При изкуствените заразвявания са използвани in vitro луковички от 7 клона с произход: Присад, Свиленград, Виница 1, Виница 2, Палаузово, Ямбол, и Кочово, Блатец във фаза първи лист, нарязани на половинки.
Избрани са 4 бактериални изолата, чиито вид е определен чрез секвенционния анализ. Това са:
-
Изолат 1 - Serratia plymuthica , Изолат 3 - Serratia plymuthica,Изолат 5 - Rahnella aquatilis,Изолат 6 - Bacillus subtilis
Начин на заразяване: За всеки вариант сa използвани по 12 половинки от луковички (надлъжно срязани). Нарязаните половнки се поставят в петрита със стерилна филтърна хартия, напоена с МS макросоли. Накапват се с по 10-20 µl бактериална суспензия. Контрола: накапани със стерилен разтвор на МS макросоли.
Култивиране на заразените експланти: Вариантите от изкуствените заразявания (растение–бактерия) се поддържат в култивационно помещение за 9 дни. Развитието на инфекциозния процес се отчита на всеки 3 дни (3, 6 и 9-ти ден след заразяването).
3.4 Определяне въздействието на бактериалните изолати върху метаболитите на растенията - изкуствено заразяване на in vitro луковички с произход Блатец, заразени по същия начин и със същите изолати, описани в предходния абзац. За всеки вариант са използвани по 15 половинки от луковички. След 9 дни инокулация пробите са обработени за анализ на метаболитите им чрез GC-MS .
За паралелен метаболитен анализ и на бактериалните изолати, бактериалната маса е лиофилизирана и обработена по същия начин, както заразените луковички.
За краткост пробите от различните варианти са означени със следните кодове:
Вариант
|
Брой проби/вар.
|
Код
|
Контрола (незаразени луковици)
|
5
|
К
|
Луковици, заразени с изолат 1
|
5
|
1bk
|
Луковици, заразени с изолат 3
|
5
|
3bk
|
Луковици, заразени с изолат 5
|
5
|
5bk
|
Луковици, заразени с изолат 6
|
5
|
6bk
|
Лиофилизиран бактериален изолат 1
|
2
|
1
|
Лиофилизиран бактериален изолат 1
|
2
|
3
|
Лиофилизиран бактериален изолат 1
|
2
|
5
|
Лиофилизиран бактериален изолат 1
|
2
|
6
|
Сподели с приятели: |