Глава 2:Б Е Л Т Ъ Ц И 2.2. Структура на белтъци

Пептидната връзка е ковалентна връзка, която се получава при кондензация на -СООН група от една аминокиселина и амино-група от друга аминокиселина.

Резонансната стабилизация на пептидната връзка е представена на фиг. 2-8-I. Полудвойните връзки в пептидната група обуславят равнина на спрежение. Четирите атоми С, O, N, H, както съседните -C атоми, лежат в тази равнина и поради това свободно въртене около осите на полудвойните връзки не е позволено. Свободно въртене под определен ъгъл е позволено само около съседните на пептидната група прости връзки N-С_ (ъгъл ) и С_-С (ъгъл ). Тези ъгли  (phi) и  (psi) са въведени от Рамачандран. Радикалите, прикрепени към -С атоми, са в предпочитана транс-позиция спрямо равнината на пептидната връзка. Друго важно следствие от мезомерията на пептидната връзка е възможността да се образуват водородни връзки между близко разположени пептидни групи.

Фиг. 2-8-I. Резонансна стабилизация на пептидната връзка.

Наред с ковалентните пептидни и дисулфидни връзки, в белтъците има и голям брой други нековалентни взаимодействия, които, макар и значително по-слаби, са важни за структурата, свойствата и биологичната активност на белтъците (табл. 2-2).

Табл. 2-2. Видове връзки и взаимодействия в белтъчните молекули*

Водородни връзки възникват, когато Н атом е между два по-електроотрицателни атоми, с единия от които е ковалентно свързан. Напр. H, свързан към N от една пептидна група, се привлича от О на друга пептидна група. Водородните връзки са по-слаби от ковалентните връзки, но поради големия им брой между близко разположени пептидни групи, те имат значение за стабилизиране на вторичната структура. Водородни връзки има и между повърхностно разположени полярни радикали и водни молекули.

Теоретично ъглите на въртене  (около оста N-С_ ) и  (около оста С_-С) (фиг. 2-8-I) могат да заемат стойности от -180^о до +180^о, но на практика много от тези стойности са забранени поради пространствено пречене между радикалите. Т.е. само теоретично са възможни безброй конформации на полипептидната верига при различно завъртане на плоскостите на пептидните групи една спрямо друга. Поради възникването на голям брой водородни връзки между близко разположени пептидни групи и поради пространствено пречене между радикалите, тези ъгли  и  не могат да имат произволно значение и веригата в отделни участъци се огъва по определен начин - т.е. възниква вторична структура.

Вторичната структура се отнася до локалното нагъване на части от полипептидната верига под форма на -спирала (фиг. 2-8-II), -структура (фиг. 2-8-III) или друг тип спирала с определени параметри (табл. 2-3). Тези параметри са: ъгли на Рамачандран  и , брой остатъци на един оборот на спиралата (n), разстояние между -C атоми на съседни остатъци (d) и ход на спиралата (p = n x d). Термодинамично най-стабилни са -спиралата и -структурата. Различните видове структура се стабилизират от водородни връзки между близко разположени пептидни групи.

Фиг. 2-9. Теоретичен модел на Полинг за дясно-завита -спирала.  Във всеки оборот на спиралата участват 3.6 аминокиселинни остатъка, т.е n = 3.6; d - разстояние между -C атоми на съседни остатъци; d = 0.15 nm; p - ход на спиралата; p = n x d = 0.54 nm.

-Веригата е сравнително най-опънатата форма на полипептидната верига (n=2 - вж табл. 2-3). Водородни връзки се образуват между близко разположени пептидни групи от различни вериги или между различни участъци на една верига (фиг. 2-8-III и фиг. 2-11). Водородните връзки са приблизително перпендикулярни на осите на веригите. Сближените вериги образуват леко зигзаговидно нагъната повърхност (като мех на хармоника), която може да се идеализира като равнина. Страничните остатъци (R) са разположени почти перпендикулярно на мислената равнина, в която лежи "хармониката" и са алтернативно повтарящи се от двете й страни.

Възникващата система от паралелни (еднопосочни) или антипаралелни (разнопосочни) вериги се означава като мотив от типа -лист. Преобладават антипаралелните -листове (фиг. 2-11). Броят на -верижните участъци в -листа може да варира от 2 до 15. Вериги с обща формула (- Гли - Х) позволяват да бъдат плътно опаковани и имат висока механична стабилност - напр. като при фиброин от коприна.

Мотивът е повтаряща се комбинация от елементи на вторичната структура, напр. ,  (-лист),  (гривна), гръцки ключ и др.

N-краят е в лeвия горен край и е в син цвят. Водородните връзки (представени с пунктири) между остатъците в двата антипаралелни -участъци стабилизират -структурата.

Далечните нековалентни взаимодействия между аминокиселинните остатъци определят по-висшата третична структура на белтъчната молекула - т. е. начинът на пространствено нагъване на цялата верига, която може да съдържа -спирални и/или -структурни участъци. На фиг. 2-12 са дадени примери за нековалентни взаимодействия между отдалечени радикали. Те могат да бъдат:

1) хидрофобни взаимодействия - между неполярни аминокиселинни остатъци;

2) полярни взаимодействия между полярни остатъци:

В белтъците, които съдържат цистеинови остатъци или пролин, има още две причини, които обуславят и поддържат третичната структура:

Фиг. 2-12. Нековалентни взаимодействия между отдалечени по веригата радикали.  1 - хидрофобни взаимодействия; 2 - електростатични взаимодействия; 3 - водородни връзки.

 Фиг. 2-13. Третична структура на белтъци. .

Фигурите са приготвени с програмата Raswin [7], ползвайки данните за съответните атомни координати от Protein Data Bank [10].

На фиг. 2-13-1 е дадена третичната структура на ₁-субединица на хемоглобин [9 ]. Около 75 % от нея се състои от 8 -спирални участъка, съединени с къси неструктурирани участъци. Освен -спиралните участъци, представен е и хемът (небелтъчна лиганда, необходима за свързване на кислород). Тези осем участъци се означават с латинските букви от A до H, а остатъците във всеки от тях се означават с съответната буква на участъка и номера, който те заемат в него. Например F8 и F7 са двата хистидинови остатъци, разположени от двете страни на хема. Останалата част от веригата е под форма на къси участъци, свързващи спиралните участъци. Освен водно-разтворими белтъци като хемоглобин, и някои мембранно разположени белтъци съдържат -спирални участъци. Такъв е бактериородопсинът (фиг. 2-13-2). Седемте -спирални участъци са в по-тъмен цвят. С пунктир са представени водородните връзки, стабилизиращи спиралните участъци. С по-светъл цвят и чрез пълния пространствен модел е представена небелтъчната лиганда 11-цис-ретинал.

Други белтъци съдържат предимно -структурни участъци, най-често антипаралелни, съединени с къси участъци. Такива има напр. в Cu, Zn-супероксид дисмутаза, конканавалин А, в тежките вериги на имуноглобулини (фиг. 2-13-3), в химотрипсин (фиг. 2-13-4) и много други. На фиг. 2-13-3 с пунктир са дадени водородните връзки между антипаралелни -верижни участъци, групирани в -лист.

Някои белтъци съдържат както -спирални, така и -структурни участъци. Такива са напр. триозофосфат изомераза, пируват киназа, лактат дехидрогеназа, химотрипсиноген (фиг. 2-13-5), алдолаза (фиг. 2-13-6) и много други.

Третичната структура е високоспецифична - полипептидната верига се нагъва по строго определен начин - в резултат на което възниква уникална пространствена (3D) структура. Всяко изменение на тази структура, дори минимално, се отразява на биологичните функции и свойства. Следователно, на ниво третична структура белтъците имат определена форма и големина в пространството.

Дотук разгледаните белтъци спадат към глобуларните белтъци, тъй като молекулате им имат сферична или леко удължена форма (съотношението на дългата към късата ос е под 10:1). Във вътрешността на глобулата се ориентират хидрофобните остатъци, а по повърхността – хидрофилните остатъци. Около последните се ориентират водни диполи (хидратационна обвивка). По повърхността, обаче, може да има и зони от хидрофобни аминокиселини, често от значение за активността на белтъка. Глобуларните белтъци имат обикновено каталитична или регулаторна роля. Обикновено по повърхността или близо до нея при каталитичните белтъци се разполагат активният център и други регулаторни центрове.

Белтъци, при които дългата ос е много по-дълга от късата ос, се наричат фибриларни. Те имат структуро-образуваща функция. Изграждат разнообразни структури – кости, кожа, сухожилия. Те са неразтворими във вода. Примери за фибриларни белтъци са еластин (изграждащ сухожилия), фибрин (изграждащ кръвния съсирек), кератин, колаген и др. Кератинът участва в изграждане на епидермиса и роговите образувания - косми, нокти, рога и копита). При кератина три -спирализирани вериги с десен ход се усукват в суперспирала с ляв ход (фибрила). Между веригите възникват напречни киселинно-амидни връзки между -COOH на Глу и -амино-групата на Лиз. Такива връзки са характерни за кератини в рогови образувания, но са по-редки в кератин от епидермис. Колаген (главният компонент на съединителната тъкан, наричана още екстрацелуларен матрикс), ще бъде разгледан в т. 2.3.4.

Четвъртичната структура се определя от пространственото разположение на две или повече полипептидни вериги (наричани субединици или протомери), образуващи общ комплекс. Всяка субединица има своя първична, вторична и третична структура. Първичната структура на субединиците може да бъде еднаква, или различна и съответно белтъците биват хомо- или хетеро-олигомери. Субединиците са свързани чред нековалентни взаимодействия (водородни връзки, хидрофобни и електростатични взаимодействия). Едни от субединиците изпълняват каталитична функция, а други разпознавателна и регулаторна функции. Промяната в пространственото разположение на субединиците променя свойствата на молекулата. Затова белтъците с четвъртична структура имат важна роля за регулацията на вътреклетъчните процеси.

За белтъци, изградени от няколко полипептидни вериги, които са свързани чрез ковалентни дисулфидни връзки (напр. имуноглобулини) или за белтъци, съдържащи само една полипептидна верига, не може да се говори, че имат четвъртична структура. Ако все пак между субединиците на даден белтък са налице ковалентни връзки, то те са резултат от следсинтетична модификация.

Белтък с четвъртична структура е хемоглобин (фиг. 2-14). Той е изграден от четири субединици - две - и две -вериги, всяка с 141 и 146 остатъка съответно. Означенията - и - тук се отнасят до различия в първичната структура. Всяка от субединиците е глобуларен белтък и в съвкупност комплексът от 4 субединици също има форма на глобула. Всяка от веригите носи хем (Fe-порфиринов комплекс). Връзките между четирите вериги на хемоглобина са слаби, нековалентни: хидрофобни, полярни (йонни, йон-диполни, дипол-диполни) и водородни. Полученият тетрамер има биологична активност, а при разграждането му до субединици, се намалява афинитетът към кислород.

Фиг. 2-14. Хемоглобин - пример за белтък с четвъртична структура. Четирите субединици, както и четирите хемове са представени с различен цвят. Фигурата е приготвена с програмата Raswin [7], ползвайки атомните координати на файл 1hba [9] в PDB [10].

Денатурацията е процес, при който под въздействия на различни химични и физични агенти (висока температура, киселини, основи, детергенти, лъчения) се нарушава конформацията на молекулата, променят се физикохимичните свойства и се губи биологичната активност. Тя може да бъде обратима или необратима. При обратимата денатурация след отстраняване на денатуриращото въздействие молекулата отново приема нативна конформация (ренатурация). На фиг. 2-15 е показана денатурация и ренатурация на рибонуклеаза. Тя има осем цистеинови остатъка, образуващи 4 дисулфидни връзки. При комбиниране на тези осем остатъци са възможни 105 конформации и само една от тях е нативна. Останалите 104 се означават като "разбъркана" конформация. В последно време се знае, че има специални ензими (протеин дисулфид измерази), които улесняват образуване на правилните дисулфидни връзки.

Възможността за ренатурация на рибонуклеаза и примерът с Hb S доказват, че първичната структура е определяща за структурата и свойствата на белтъчната молекула.

В клетките има специални белтъци, които улесняват процеса на нагъване. Наред със споменатите протеин дисулфид измерази, които катализират преместване на дисулфидни връзки, това са шапероните и ензимите от групата на цис-транс пролил изомеразите.

Шапероните (70 kDa) са семейство белтъци, които при физиологични условия предотвратяват неправилното огъване и "нежеланите" взаимодействия между аминокиселинните радикали в новосинтезиращи се полипептидни вериги.

Първичната структура на белтъка детерминира неговите по-висши структури, но шапероните улесняват достигането на термодинамично най-стабилната белтъчна конформация. За правилното нагъване на новообразуващата се полипептидна верига шапероните се свързват временно с хидрофобните участъци на новообразуващата се верига, защитавайки ги от въздействието на разтворителя. За осъществяване на дейността си шапероните изискват енергия под форма на АТФ.

Шапероните се наричат още топлинно-шокови или стресови белтъци, тъй като се синтезират усилено при топлинен шок вероятно с цел да противодействат на денатурацията на клетъчните белтъци.

Освен това система от шаперони улеснява транспорта на белтъци в различни клетъчни отделения. Напр. един шаперон поддържа новосинтезирания белтък в разгънато състояние докато мине през митохондрийната мембрана, а друг шаперон в матрикса улеснява нагъването на белтъка.

За оформяне конформацията на новосинтезираните белтъчни молекули, пролил рацемазата катализира изоергичното цис-транс-превръщане на вече включен в полипептидната верига пролин.