Медицинска генетика
Изтегляне 466.91 Kb.
|
2, разпределена в самостоятелно обособени помещения:4.1.1. За приемане, регистриране и разпределяне на материалите.4.1.2. За документиране, разпечатване на резултати, архивиране и съхранение на документацията. 4.1.3. Работното лабораторно пространство трябва да има 5 основни физически разделени помещения: за изолирането на ДНК или РНК от биологичен материал; за приготвяне на реактиви и добив на дестилирана и дейонизирана вода; за подготовка на пробите за амплификация; за амплификация; за анализ на продуктите от амплификацията.4.2. Лабораторията може да разкрива манипулационна и към нея следните задължителни помещения:4.2.1. Чакалня с достатъчно седящи места.4.2.2. Тоалетна за пациенти. 4.2.3. Помещение за вземане на кръв и кожни биопсии.4.3. Помещение за хладилниците, камерите за дълбоко замразяване и съдовете за течен азот (в случаите на ДНК банка) трябва да бъдат следени ежедневно. 4.3.1. Записващи термометри са препоръчителни за механичните камери за дълбоко замразяване и хладилници. Препоръчва се те да бъдат свързани с алармена система, инсталирана на място, където може да се чува 24 часа в денонощието. 4.3.2. В лабораториите, използващи течен азот за съхранение на замразени клетки, нивото на течния азот трябва да бъде следено на интервали с цел осигуряване на адекватното му подаване през цялото време.4.3.3. Температурата на околната среда и/или температурата в инкубаторите, в които се извършват отделните етапи на изследванията, трябва да бъдат следени ежедневно и да съответстват на температурните интервали, посочени в работните инструкции. 5. Задължителен обем от дейности, които трябва да извършва молекулярно-генетична диагностична лаборатория5.1. Изолиране на ДНК/РНК от биологичен материал. 5.2. Амплификация на специфични генетични локуси с полимеразно-верижна реакция. 5.3. Електрофоретично разделяне на нуклеинови киселини.5.4. Рестрикционен анализ. 5.5. Основни видове хибридизационни методи на нуклеинови киселини.5.6. Анализ на полиморфизми.5.7. Възможност за директно автоматично секвениране или фрагментен анализ или експресионен анализ.6. Минимална, задължителна лабораторна апаратура за молекулярно-генетична лаборатория
7. Аналитични принципи за извършване на ДНК изследвания за медицински цели 7.1. Методите трябва да са разработени и валидизирани в лабораторията. Използват се комбинации от реактиви, които могат да бъдат доставени от различни производители. Всяка лаборатория определя специфичните характеристики за дадения генетичен анализ съобразно изследваната популация от пациенти. Аналитичната и клинична валидизация на анализа се извършва и документира от лабораторията. 7.2. Изследванията, използващи готови търговски набори, са изцяло осигурени от конкретния производител.7.3. Всички търговски набори, използвани за диагностични цели, трябва да съдържат информация за чувствителност, специфичност и надеждност на използвания анализ за конкретната диагностика и СЕ марка. 8. Подходи за молекулярно-генетични анализи за диагностични цели8.1. Директният ДНК анализ за диагностични цели при заболявания с висока алелна хетерогенност трябва да позволява откриването на не по-малко от 80 % на молекулните дефекти, свързани с конкретното заболяване.8.1.1. Известните молекулни дефекти са тези, за които има данни в HUGO MUTATION DATABASE. Всички методи, използвани за търсене на известни мутации, трябва да позволяват категоричното доказване на конкретен молекулен дефект. За това е необходимо използването на съответните референтни контроли (специфични мутации в хомо- и хетерозиготно състояние и нормална контрола).8.1.2. Новооткритите секвенционни варианти, за които няма данни в HUGO MUTATION DATABASE, се приемат за молекулни дефекти, имащи отношение към определена патология, ако: е доказана косегрегацията с изследваното заболяване в семейството; мутацията не е открита в изследвана контролна група лица, доказано здрави по отношение на изследваната патология (Броят на лицата в контролната група зависи от честотата на заболяването. Например за заболявания с честота 1:10 000 се изследват минимум 100 здрави индивида.); мутацията е доказана в два независими амплификационни продукта; доказана е връзката й с патологията чрез експресионен анализ; променят еволюционно консервативна аминокиселина.8.2. Индиректен подход е този, при който в изследваното семейство се проследява косегрегацията на заболяването с полиморфни маркери от болестния локус.9. Общи аналитични изисквания към диагностичните ДНК методи9.1. За диагностични цели могат да се използват следните биологични материали:9.1.1. Кръвни проби с обем не по-малък от 2 милилитра в епруветки с EDTA антикоагулант. Кръвните проби могат да бъдат съхранявани и транспортирани не повече от 48 часа при температура 4° - 8°С. Съсирени кръвни проби не подлежат на анализ. 9.1.2. Амниотична течност - минимум 5 милилитра. Амниотичната течност може да бъде съхранявана и транспортирана не повече от 48 часа при температура 4° - 8° C. Амниотична течност с примес на кръв не подлежи на ДНК анализ. 9.1.3. Култивирани клетки - минимум 1x106 клетки. Те трябва да бъдат съхранявани и транспортирани в стерилна среда, при температура 4° - 8° C за не повече от 48 часа. 9.1.4. Некултивирани клетки (букална лигавица, цервикални, уретрални и др.) се взимат и транспортират съгласно указанията на конкретната лаборатория. 9.1.5. Тъканен материал - минимум 5 милиграма. Хорионните въси трябва да бъдат предварително очистени от децидуа. Те трябва да бъдат съхранявани и транспортирани в стерилна среда или физиологичен разтвор при температура 4° - 8° C за не повече от 48 часа. Фиксирани тъкани са приложими за анализ само в определени случаи, посочени от конкретната лаборатория. 9.1.6. Кръв, накапана върху специална филтърна бланка (от масовия неонатален скрининг).9.2. Изолирането на ДНК/РНК от биологичен материал трябва да бъде извършвано със стандартизирани методики на базата на публикуваните в литературата данни или следвайки инструкциите на производителя при използването на готови набори. 9.3. Количеството на ДНК/РНК трябва да бъде измерено спектрофотометрично. Изолираната ДНК трябва да бъде съхранявана на -20°С (за ДНК банка при -70°С) под 96 % етилов алкохол или разтворена в специален буфер. Работните количества трябва да бъдат съхранявани на температури не по-високи от 4° C.10. Изисквания към контролните материали10.1. Подбор и приготвяне на контроли. В рамките на едно изследване основно се използват: (А) отрицателни контроли, (Б) положителни контроли, (В) контроли за диагностични маркери, (Г) контроли за определяне на молекулния размер на изследваните проби. 10.2. Точната нуклеотидна последователност на използваните ДНК сонди или зародиши (праймери) трябва да бъде документирана по изискванията на геномните бази данни или публикации в специализираната литература. Синтетичните олигонуклеотиди трябва да бъдат съпроводени с пълна техническа информация от страна на производителя.11. Полимеразно-верижна реакция (PCR)11.1. Препоръчително е използването на физични и/или биохимични бариери за предотвратяване на ДНК контаминация. Преамплифкационните процедури трябва да бъдат извършвани в помещение за подготовка на пробите за амплификация, където не се разрешава внасянето на амплификационни продукти. Предимство е физическо разделяне и ограничен поток на трафика, както и използване на ламинарен бокс.11.2. При амплификация на ДНК/РНК се използват консумативи за еднократна употреба. 11.3. Като амплификационна матрица може да се използва ДНК или РНК /кДНК (от всеки тип ядрени клетки). При използване на РНК е необходимо включване на подходящи контроли за обратната транскрипция.11.4. Подготовката на проби за амплификация, амплификацията и анализът на амплификационните продукти трябва да се извършват в отделни помещения.11.5. Методи, които използват ре-амплификация, предразполагат към грешки, свързани с PCR-контаминация. Прибавянето на матрицата за втората амплификация да бъде разделено физически от преамплификационното работно място. 11.6. Изисква се да се използват индивидуални пипети на всяко работно място. 11.7. Всяка нова партида сонди (праймери) трябва да бъде проверена върху референтен материал за потвърждаване на специфичността и количеството на продукта. 11.8. Контрола за реактивите (без нуклеинови киселини) трябва да бъде включена във всяко изследване, използващо полимеразно-верижна реакция. Друга отрицателна контрола може да включва отворена епруветка на работното място. 11.9. Лабораторията трябва да има критерии за приемане или отхвърляне на специфичността на амплификацията. 11.10. В случай, че амплификационният продукт е краен резултат от анализа, е необходимо използване на подходящи положителни и отрицателни контроли за установяване на евентуална неуспешна амплификация във всяка амплификационна смес.11.11. Условията за амплификация (напр. типът полимераза, концентрация на полимеразата, концентрация на нуклеозидтрифосфатите, концентрация на терминаторите) трябва да бъдат съобразени с вида на матрицата (напр. дължина на секвенцията, GC-съдържание).12. Електрофоретично разделяне на ДНК/РНК върху агарозни и полиакриламидни гелове носители12.1. Условията за разделяне трябва да бъдат предварително установени и потвърдени експериментално в лабораторията. 12.2. Концентрацията на използваните носители трябва да осигурява максимална разделителна способност за определяне на съответния вид проби.12.3. Визуализацията на пробите може да бъде извършвана по различни начини и трябва да бъде фотодокументирана.12.4. За всяка анализирана серия трябва да бъдат използвани молекулни свидетели или подходящи контроли за определяне на размера на пробите.13. Рестрикционен анализ13.1. Използването на специфични рестриктази за директен или индиректен ДНК анализ трябва да бъде основано на литературни данни или преки доказателства, гарантиращи правилната интерпретация на резултатите. 13.2. Задължително е използването на стандартизирани контроли във всяка изследвана серия, позволяващи отчитането на всички алелни варианти на локуса. 13.3. Задължително е използването на молекулен свидетел, съдържащ фрагменти, кореспондиращи максимално близко на очакваните алелни варианти. 14. Хибридизация с алелспецифични олигонуклеотиди (Southern хибридизация)14.1. Рестрикционният анализ на изолирана ДНК трябва да бъде извършен съгласно възприетите лабораторни протоколи. 14.2. Качеството на рестрикционната реакция трябва да бъде удостоверено чрез проверка върху агарозен гел с използването на молекулни стандарти. 14.3. Преди подготовката на мембраната за пренос гелът трябва да бъде фотодокументиран. 14.4. Преносът върху мембрана трябва да бъде извършен съгласно възприети протоколи. 14.5. Хибридизацията трябва да се извършва съгласно възприети лабораторни протоколи. 14.6. При хибридизация трябва да се използват възприети за съответния анализ контроли.14.7. Резултатите трябва да бъдат фотодокументирани и съхранявани в протоколи, придружаващи всяка анализирана серия.15. Анализ на микросателити, минисателити и еднонуклеотидни замени15.1. За изследване на ДНК фрагменти, съдържащи мини, микросателити и еднонуклеотидни замени, трябва да бъдат установени подходящи електрофоретични условия (напр. температура, сила на тока, продължителност на електрофорезата, буфер), позволяващи разграничаването на всички, различаващи се по дължина, алелни форми в изследвания локус. Условията трябва да бъдат протоколирани за всяка електрофореза. 15.2. Задължително е използването на контроли във всяка изследвана серия, позволяващи отчитането на наблюдаваните алелни варианти в локуса, а при многоалелните локуси (микро- и минисателити), използвани за идентификационни цели - използването на алелни свидетели, съдържащи всички чести алели в изследвания локус.15.3. За целите за идентификация на индивида установените алели на високополиморфните (многоалелни) ДНК локуси трябва да се описват според общоприетата международна номенклатура, за да могат резултатите, получени в различни лаборатории, да бъдат съпоставими. 15.4. Отчитането и определянето на алелите трябва да бъде извършвано от двама специалисти, независимо, невключващи началника на лабораторията. 15.5. При количествено определяне на доза на даден алел трябва да се използват контроли, приготвени в същата аналитична серия. Освен визуалното интерпретиране на резултатите трябва да бъде извършено и денситометрично определяне със специализирана за този вид изследване компютърна програма.15.6. Статистическата интерпретация на случаите на неизключване при определяне на спорен родителски произход трябва да отразява последните международни изисквания (популационни данни за съответната етническа група от българската популация, отчитане на майчиния генотип при определени алелни комбинации, използването на специфични формули при отсъствие на един от родителите от анализа и др.). 16. Директно автоматично секвениране на ДНК16.1. Матрицата за секвениране трябва да се характеризира със съответна специфичност (напр. локусна или алелна специфичност), количество и качество. Методът за подготовка на матрицата трябва да осигурява секвенционна матрица с достатъчна дължина, която не съдържа инхибитори на секвенционните реакции и замърсявания и не трябва да оказва влияние върху точността на секвенцията (напр. мутации, възникнали при клониране, преференциална амплификация). 16.2. Диагностичният анализ на секвенциите трябва да се основава на данни от двете комплементарни вериги на ДНК. При наличие на секвенционна вариация анализът се потвърждава чрез повторно секвениране на новогенериран амплификационен продукт. 16.3. При установяване на алел, за който няма информация в геномната база данни, той трябва да се потвърди с повторно секвениране на новогенерирана матрица. 16.4. Всяка анализирана секвенция трябва да бъде сравнена с нормална контролна ДНК или с нуклеотидните последователности, регистрирани в най-актуалните версии на геномните бази данни.16.5. Трябва да се избягва интерпретирането на резултати от секвенционни реакции, съдържащи "стопове", компресии или други артефакти. 16.6. При използване на автоматични секвенатори флуоресцентно белязаните нуклеотиди или зародиши трябва да бъдат съобразени с параметрите на апарата.16.7. Всички секвенции трябва да бъдат съхранявани върху електронен носител не по-малко от 2 години. 16.8. Установени със секвениране молекулни дефекти, имащи отношение към заболяването, трябва да бъдат документирани с отпечатан резултат и приложени към досието на пациента. 16.9. Отбелязването на установените молекулни варианти трябва да бъде извършвано съгласно препоръките на HUGO. 16.10. Секвенциите трябва да бъдат анализирани от двама квалифицирани специалисти независимо, като единият от тях не включва началника на лабораторията.17. Специфични изисквания за съхранение на генетичен материал в ДНК банка17.1. Определение:В ДНК банката се съхранява ДНК, изолирана от биологичен материал, и информация за здравословното състояние и начина на живот на индивиди с цел извършване на бъдещи генетични изследвания за определяне на генетичен риск и генетична предразположеност за заболявания на донорите на ДНК и/или техните потомци и извършване на бъдещи диагностични и научни геномни и фармакогеномни проучвания. 17.2. Статут на ДНК банката.17.2.1. ДНК банка се разкрива към лаборатория в лечебно заведение, извършваща молекулярно-генетична диагностика 17.2.2. ДНК банката отговаря на общите изисквания, посочени в раздел ІV А17.3. Помещение и минимално оборудване 17.3.1. ДНК банката разполага със самостоятелно помещение от минимум 20 м217.3.2. Хладилна камера -20°С, над 400 литра - 2 бр.17.3.3.Хладилна камера -80°С, над 400 литра - 2 бр. 17.4. Условия за вземане на биологичен материал:17.4.1. Предоставяне на дарителите на подробна писмена информация, която съдържа:17.4.1.1. Цели за изграждането на ДНК банката17.4.1.2. Близки и далечни ползи за донора на ДНК17.4.1.3. Специален протокол, по който ще се съберат данните за здравословното състояние и начина на живот на донора.17.4.1.4. Принципа, на който се изгражда ДНК банката17.4.1.5. Механизмите, които гарантират дългосрочно съхраняване на ДНК.17.4.1.6. Евентуалните рискове, които поема донорът.17.4.1.7. Права на донора.17.4.1.8. Законови гаранции за запазване правата на донора.17.4.1.9. Механизмите, чрез които се гарантира анонимност на информацията. 17.4.2. Вземане на биологичен материал за ДНК банка става по определен протокол след писмено информирано съгласие, което съдържа цялата информация в т. 17.1.17.5. Съхраняване на ДНК17.5.1. Биологичният материал и изолираната ДНК се съхраняват при следните условия:17.5.1.1. На порции с измерена концентрация на ДНК.17.5.1.2. Порциите са надписани с един и същ идентификационен номер, изграден от 9 буквено-цифров код.17.5.1.3. В два хладилника при -70°С с независимо електрозахранване. 17.5.1.4. Биологичен материал от скрининговите програми може да се използва анонимизиран (с идентификационен номер) за ДНК банка, в съответствие с действащите нормативни актове.17.5.1.5. Ако изрично е записано в информираното съгласие, биологичен материал и ДНК, постъпили в лабораторията с цел диагностика, могат да се използват за ДНК банка анонимизирани (с идентификационен номер) без допълнително съгласие на пациента и при изчерпване на моментните диагностични възможности на лабораторията.17.6. Изразяване на информирано съгласие от донора на ДНК за изграждане на ДНК банка.17.6.1. За всеки донор се събират данни за здравословното състояние и начина на живот в стандартизиран протокол - интервю, одобрен от етична комисия. Въпросите в интервюто се определят от целите на геномния проект, за който се изгражда ДНК банката.17.6.2. Индивидуалният унифициран протокол се съхранява в писмен вид и на електронен носител, кодиран с идентификационния номер.17.6.3. На отделен документ (файл) се съхраняват идентифициращите пациента данни (ЕГН, лични имена, място и дата на раждане и телефон) и идентификационен номер. 17.6.4. Биологичният материал, документът с идентифициращите пациента данни и унифицираният протокол носят един и същ идентификационен 9-значен буквено-цифров номер (инициали и рождена дата на донора). 17.7. Предоставяне на ДНК17.7.1. Порции от ДНК могат да се предоставят на други лаборатории само в анонимизиран вид.17.7.2. Лабораторията е длъжна да информира донора, в случай че той желае и в случай че се получат резултати, имащи отношение към здравословното му състояние.18. Качествен контрол18.1. Лабораторията, изпълняваща молекулярно-генетични анализи, участва поне в една система за ВОК в зависимост от спецификата и приоритетите на извършваните изследвания. 18.2. Видовете генетични тестове, предлагани за оценка на качество, както и изискванията са представени от The European Molecular Genetics Quality Network. 18.3. Биологичните проби се изпращат според установените от системите за ВОК схеми и периоди. 18.4. Анализите на контролните материали се извършват съгласно изискванията по ISO 15189 (GLP and competence). 18.5. Документацията от качествения контрол се съхранява върху електронен и хартиен носител и включва всички етапи на изследването.18.6. Резултатите се отнасят до анализиране на генетичните варианти и интерпретация на резултата, касаещ клиничната диагноза. 18.7. Контролната лаборатория издава протокол, оценяващ правилното техническо изпълнение на анализите и правилната интерпретация на резултатите.18.8. При пропуски в аналитичните процедури лабораторията трябва да вземе мерки съгласно установените принципи за ВКК и да го отрази в писмен вид. Раздел VПрава на пациентите и служителите1. Пациентите имат следните права:1.1. Предприемането на генетично изследване е доброволно и се осъществява само при съгласие от страна на пациента или негов законен представител и след разрешение на комисията по медицинска етика към съответното лечебно заведение, като се спазват условия за информираност, конфиденциалност, ограничен достъп до резултатите. За целта се подписва информирано съгласие, съответстващо на провежданото изследване.1.2. Пациентът/консултиращият се може да поиска по всяко време информация за хода на изследването.1.3. Пациентът/консултиращият се може да поиска по всяко време спиране на изследването.1.4. Да бъдат информирани за значението и диагностичната стойност на изследването.1.5. Да бъдат информирани за други необходими за уточняване на диагнозата изследвания.1.6. Да преценят дали да бъдат уведомени техни роднини при възможност за носителство на мутация.1.7. Да им бъде предложена и осигурена генетична консултация.1.8. Резултатите от изследванията са лични данни на пациентите. Служителите на лабораторията трябва да гарантират опазването им. Ако данните от изследванията се нанасят в компютър, той не трябва да е в мрежа, или да са защитени с код, известен само на работещия с компютъра служител.1.9. Въпросът за правото на детето да знае или не за медицинския проблем се урежда законово.1.10. Пациентът има право да получи резултата от изследването от МГК лично.1.11. Права на донора на ДНК:1.11.1. Чрез писмена молба до началника на лабораторията донорът на ДНК има право по всяко време да изтегли порция от съхраняваната ДНК, за да бъде изпратена в друга лаборатория за целите на диагностиката.1.11.2. Ако не е анонимизирана ДНК, чрез писмена молба до началника на лабораторията донорът на ДНК има право по всяко време да пожелае ДНК пробите му да бъдат унищожени заедно с всички данни за него в регистъра.1.11.3. Донорът има право да знае резултатите от провежданите научни изследвания върху неговата ДНК, в случай че те дават полезна информация за здравословното му състояние.2. Права на служителите2.1. Служителят има право:2.1.1. На информация за естеството на работа, рисковете, свързани с нея, и на обучение, свързано с работата му.2.1.2. На безопасност при извършване на професионалната си дейност и всички останали изисквания на действащото трудово законодателство. Каталог: medstand medstand -> Клинична патология medstand -> Имунологична подготовка при трансплантация на органи, тъкани и клетки medstand -> Нуклеарна медицина medstand -> Клинична лаборатория medstand -> Клинична хематология medstand -> Ушно-носно-гърлени болести medstand -> Наредба №36 от 6 август 2010 Г. За утвърждаване на медицински стандарт "очни болести" medstand -> Наредба №4 от 13 март 2014 Г. За утвърждаване на медицински стандарт "нефрология" medstand -> Ортопедия и травматология Изтегляне 466.91 Kb. Сподели с приятели:
|