Методика за определяне на сортовата чистота и сортова автентичност на семена хибриди и самоопрашени линии от царевица и слънчоглед



Дата10.10.2017
Размер323.38 Kb.




Методика

за определяне на сортовата чистота и сортова автентичност на семена хибриди и самоопрашени линии от царевица и слънчоглед
1.Цел
Определяне сортовата чистота и/или сортова принадлежност на семена хибриди и самоопрашени линии от царевица и слънчоглед.
2.Принцип
Методът се основава на анализ на резервните белтъци в семената. Синтезът на тези белтъци е в пряка връзка с ДНК контрола в клетката и практически не се влияе от климатични и др. фактори.

От семената се екстрахират резервни белтъци. Екстрактът се нанася на гел, където под въздействие на електрическо напрежение резервните белтъци се разделят. Образува се комбинация от линии, която е характерна за всеки отделен хибрид или самоопрашена линия.

Методът се използва за доказване на сортовата чистота на хибридите и самоопрашените линии. В хибрида се търсят една или повече линии от бащиния компонент, които са налични и в хибрида, но отсъстват от модела на майчиния компонент.

За определяне на сортовата принадлежност, комбинацията от линии, получена от анализираната проба се сравнява с моделите от база данни за различните сортове или с модела на линии, получени от проба за която със сигурност се знае, че е от същия сорт.


3.Правила за вземане на проби за електрофореза


Вземането на проби за електрофореза е съгласно методика за пробовземане, анализ чистота, кълняемост и абсолютна маса на посевен материал, утвърдена от министъра на земеделието и горите.

Пробата за електрофореза при хибридни семена царевица се взема след като в хибридния участък са отстранени бащините растения. Пробовземачът взема кочани от майчините растения на случаен принцип. Ако в пробата има нетипични кочани те се отстраняват. Кочаните се просушават до стандартна влага – 14%. От кочаните се отстраняват семената от върховете и основите и семената, останали в средните части се оронват и от тях се оформя проба за електрофореза.

За родителски компоненти царевица и слънчоглед, за хибриден слънчоглед вземането на проби е от заготвени количества, съгласно методика за пробовземане, анализ чистота, кълняемост и абсолютна маса на посевен материал, утвърдена от министъра на земеделието и горите.

Пробата за електрофореза за семена различни от царевица е част от средната пробата за последващ контрол.

Минималната маса на взетите проби е определена в наредбите по чл. 29 ал.6 от ЗППМ и е както следва:

- минималната маса на проба от родителските компоненти царевица , взета от партида с максимална маса 40 тона е 250 грама , съгласно Приложение №4 от

Наредба № 45
- минималната маса на проба от родителските компоненти слънчоглед , взета от партида с максимална маса 25 тона е 250 грама , съгласно Приложение №4 от Наредба № 46 .

- минималната маса на на проба от хибриден слънчоглед , взета от партида с максимална маса 25 тона е 1000 грама , съгласно Приложение №4 от Наредба № 46 .

За семена от хибридна царевица пробата се взема от посева по диагоналите му, след премахване на бащините редове, тя трябва да е представителна за посева и има следната маса:

- за посев до 500 декара – минимум 15 килограма кочани.

- за посев над 500 декара килограмите се увеличават пропорционално с 1 килограм за всеки следващи 20 декара .

За взетите проби пробовземачът изготвя протокол по образец, утвърден от изпълнителния директор на ИАСАС . Протоколът се подписва от пробовземача и от заявителя или от упълномощено от него лице.

Пробите за електрофореза /грунтов контрол/, задължително са придружени от следните документи :

- съпроводително писмо

- акт от полско обследване с който посевът се одобрява за електрофореза

- протокол за пробовземане

- за родителските компоненти – декларация от селекционера за закрепителни или възстановителни способности или декларация за стерилност за самоопрашените линии , съгласно чл.65 от Наредба № 45 и чл.75 от Наредба №46

След получаване в лабораторията , пробата за електофореза се описва в контролен регистър. Всяка проба получава пореден номер. Номерът, под който е регистрирана пробата , се записва и на опаковката й , и на всички отнасящи се за нея документи.

Контролният регистър съдържа всички данни за семето, посочени от изпращача.

След приключване на анализа, остатъкът от пробата се запечатва и задължително се съхранява като контролна проба в продължение на една година.


4.Електрофореза на изоензими
4.1.Принцип на извършване на електрофореза на изоензими
Електрофоретичен анализ с апаратура “Сартофор” за изследване сортовата чистота и /или автентичността на семената чрез определяне фенотипа на ензимни спектри .

Наличието или липсата на отделни ивици в спектъра дава възможност да се направят изводи, дали опрашването е извършено от желания бащин родителски компонент , дали е от друг опрашител или е настъпило нежелателно самоопрашване . За целта предварително се приготвят спектри на родителските компоненти и хибридите, които служат като модел .

4.1.2.Същност и обхват на метода
За основа на метода служи физическото разделяне на изоензими под влияние на електрично поле /прав ток, постоянно напрежение/ въз основа на техния заряд и различното им молекулно тегло.

Прилага се хоризонталният тип електрофореза.

Като разделителна среда, служи буферен разтвор, чиито електролити съдействат за протичане на тока, като в същото време поддържат и приблизително постоянна йонна среда.

Като носеща среда за поддържане на заредените частици по време на тяхното разделяне се използва целулозноацетатно фолио . Непосредствено преди използването му, фолиото се потопява в електрофорезен буфер, подсушава се между филтърна хартия , поставя се в “Сартофор” апарата и върху него се нанасят пробите. Движението на тока е в посока от катода към анода.


4.1.3.Апаратура и пособия


4.1.3.1.Система “Сартофор”:

1) Захранващ блок

2) “Сартофор” резервоар

3) Свързващ кабел

4) Апликатор

5) Мембранен мост

6) Държач на мембранния мост

7) Поставка за нанасяне на пробите

8) Маса с вградено осветление

4.1.3.2.Центрофуга

4.1.3.3.Дестилатор

4.1.3.4.Хладилник /-18˚С/

4.1.3.5.Сушилня

4.1.3.6.рН метър

4.1.3.7.Лабораторни пособия

1) Целулозно – ацетатни фолия / тип SM 12 200 /

2) Микропипети

3) Епруветки тип “Епендорф” / 1,5 ml /

4) Квадратни петрита

5) Филтърна хартия

6) Лабораторна стъклария
4.1.4.Реактиви и разтвори

1) Агар-агар

2) Трис / хидроксиметил / аминометан

3) Абсолютен алкохол

4) Еднонормална солна киселина

5) 5% оцетна киселина

6) Еднонормална натриева основа

7) Дитиоеритритол

8) Магнезиев двухлорид с 6 молекули вода

9) Фаст гарнет ГБС сол

10) Бета – нафтил фосфат

11) Кисел натриев фосат

12) Тринатриев цитрат с 2 молекули вода

13) Никотинамид аденин динуклеотид

14) Тиазолил блу тетразолиев бромид

15) 5-метилфеназониум метил сулфат

16) Малеинова киселина

17) Динатриева сол на трифосфопиридин динуклеотид

18) Динатриева сол на етилендиамин тетраоцетна киселина

19) Алфа – Д- глюкозо фосфат

20) Глюкозо - 6 - фосфат дехидрогеназа

21) Ябълчна киселина

22) Тринатриева сол на фосфоглюконовата киселина

4.1.5.Техники за прилагане на метод електрофореза при работа със система “Сартофор”


При работа със “Сартофор” системата се използват описаните по-долу техники:

4.1.5.1. АСР – кисела фосфатаза

4.1.5.2. АDН – алкохол дехидрогеназа

4.1.5.3. PGM - фосфоглюкомутаза

4.1.5.4. МDH - малат дехидрогеназа

4.1.5.5. Пептидаза, изоцитрат – 6 фосфоглюконат дехидрогенази

4.1.5.1. АСР – кисела фосфатаза

1) Подготовка на пробите

Семената от царевица се накисват във вода за 24-48 часа и кълновете се използват за получаване на екстракт. На анализ се подлагат 100 семена.

Кълновете се изваждат от семената с помощта на скалпел и се поставят в епруветки тип “Епендорф” / 1,5 ml / , заливат се с по 50 µl 0,05М трис–солнокисел буфер с рН 8.0 , в който е разтворен 0,01М разтвор дитиоеритритол / 150 mg за 100 ml буфер / и се раздробяват с пинсета. Сместа се центрофугира 6 минути при 10 000 об/мин. Двадесет микролитра от центрофугираната смес се поставят в улеите на масичката за проби.

Екстрактите се използват в разстояние на 2 часа, тъй като активността им бързо спада.

2) Изливане на плоча от гел за реакционната смес


500 mg агар-агар , разтворен в 50 ml еднонормален трис-солнокисел буфер с

рН 8.0 се разтопяват при температура 90-95 ˚С .

Буферът се подготвя по следния начин : 12.11 g трис се разтварят в 900 ml дестилирана вода. Прибавя се еднонормална солна киселина до рН на разтвора 8.0 и се довежда до обем 1000 ml с дестилирана вода.

След охлаждане до 50-55 ˚С агарът се разлива в пластмасови петриеви блюда. Всяко блюдо трябва да е изцяло и равномерно покрито с агар.

3) Електрофорезен буфер

Използва се фосфат-цитратен буфер с рН 5.9

Приготовление : в 1000 ml дестилирана вода се разтварят последователно 2.88 g 0.025М кисел натриев фосфат и 4.41 g 0.015М тринатриев цитрат с 2 молекули вода. Буферът се съхранява и използва изстуден до 4 ˚С .


    1. Реакционна смес / за един гел /

В 5 ml 0.2М натриево-ацетатен буфер с рН 5.0 се разтварят последователно : 5 mg магнезиев двухлорид с 6 молекули вода , 5 mg фаст гарнет ГБС сол и 5 mg бета-нафтил фосфат.
Реакционната смес е светлочувствителна и трябва да се пази от светлина!


    1. Електрофореза

Пробата, се нанася върху целулозно-ацетатно фолио се поставя от страната на катода . Електрофорезата протича при напрежение 250V за 35 минути при сила на тока 1-3 mA при стайна температура.

Десет минути преди края на електрофорезата плочата от гел се залива с 5 ml от реакционната смес. Престоява 5 минути . Излишъкът се излива . След завършване на разделянето целулозно-ацетатното фолио се отрязва по перфорацията и с горната си повърхност се залепва върху реакционния гел.

Целулозноацетатното фолио поставя се в сушилня при температура 37˚С за 8-20 минути до отчетливо появяване на червени ивици. Фолиото се измива обилно с вода , фиксира се 20 минути в 5% оцетна киселина, отново се промива с дестилирана вода и се изсушава между филтърна хартия.


4.1.5.2.Техника на алкохол дехидрогеназа / ADH /


  1. Подготовка на пробите от царевица хибриди– както при 4.1.5.1.

  2. Методът е подходящ за анализ на семена от царевица хибриди




  1. Изливане на плоча от гел за реакционната смес - както при 4.1.5.1.

  2. Електрофорезен буфер - трис-солнокисел буфер с рН 8.6

Приготвяне : 6.05 g трис се разтварят в 900 ml дестилирана вода. Прибавя се еднонормална солна киселина , за да бъде рН на целия буфер 8.6 .Довежда се до обем 1000 ml с дестилирана вода. Буферът се съхранява и използва изстуден до 4 ˚С.


  1. Реакционна смес / за един гел /

4.6 ml 0.05М трис-солнокисел буфер с рН 8.6, в който се разтварят последователно 4 mg никотинамид аденин динуклеотид, 2 mg тиазолил блу тетразолиев бромид , 1 mg 5- метилфеназониум метил сулфат и 0.4 ml абсолютен алкохол.

Реакционната смес е светлочувствителна и трябва да се пази от светлина!



  1. Електрофореза

Пробата се нанася върху целулозноацетатно фолио от страната на катода. Електрофорезата протича при напрежение 300 V за 45 минути при сила на тока 1-3 mA при стайна температура.
Поставя се в сушилня при температура 38 ˚С за 1-4 минути до поява на сини ивици.
4.1.5.3. Техника на фосфоглюкомутаза / PGM /


  1. Подготовка на пробите от царевица – както при 4.1.5.1.

  2. Методът е подходящ за анализ на семена от царевица родителски линии и хибриди




  1. Изливане на плоча от гел за реакционната смес - както при 4.1.5.1

  2. Електрофорезен буфер

Използва се трис-малеиново кисел буфер с рН 7.4

Приготовление : в 900 ml дестилирана вода се разтварят последователно 12.11 g трис, 11.62 g 0.1М малеинова киселина , 3.24 g 0.008М разтвор на динатриева сол на етилендиамин тетраоцетна киселина , 2.03 g 0.01М магнезиев двухлорид с 6 молекули вода . Добавя се еднонормална натриева основа до рН 7.4 . Довежда се до обем 1000 ml с дестилирана вода. Изстудява се до 4˚С . Използва се разреден 1 : 15 .




  1. Реакционна смес / за един гел /

В 5 ml 0.06М трис-солнокисел буфер с рН 8.0 / 27 g трис се разтварят в 900 ml дестилирана вода и се добавя еднонормална солна киселина до достигане на рН 8.0/ се разтварят последователно : 18 mg алфа -Д – глюкозо фосфат , 10 mg магнезиев двухлорид с 6 молекули вода , 0.5 mg никотинамид аденин динуклеотид ,

0.4 mg тиазолил блу тетразолиев бромид , 5 mg динатриева сол на етилендиамин тетраоцетна киселина и 8.75 IE глюкозо-6-фосфат дехидрогеназа .
Реакционната смес е светлочувствителна и трябва да се пази от светлина!


  1. Електрофореза

Пробата се нанася върху целулозно-ацетатното фолио от страната на катода. Електрофорезата протича при напрежение 350 V за 30 минути при сила на тока 1-3 mA при стайна температура.

Поставя се в сушилня при температура 38˚С за 5-7 минути .


4.1.5.4.Техника на малат дехидрогеназа / MDH /


  1. Подготовка на пробите

  2. Методът е подходящ за анализ на семена от царевица и слънчоглед родителски линии и хибриди

Семената на царевицата или слънчогледа се накисват във вода за 24-48 часа и кълновете се използват за получаване на екстракт.

Кълновете се изваждат с помощта на скалпел и се поставят в епруветки тип “Епендорф” / 1,5 ml / , заливат се с по 50 µl 0,05М трис–солнокисел буфер с рН 8.0 , в който е разтворен 0,01М разтвор дитиоеритритол / 150 mg за 100 ml буфер / и се раздробяват с пинсета. Сместа се центрофугира за 6 минути при 10 000об/мин. Двадесет микролитра от нея се поставят в улеите на поставката за проби.

Екстрактите трябва да се използват в разстояние на 2 часа , тъй като активността бързо спада.


  1. Изливане на плоча от гел за реакционната смес ( както при 4.1.5.1.)

500 mg агар-агар , разтворен в 50 ml еднонормален трис-солнокисел буфер с

рН 8.0 се разтопяват при температура 90-95 ˚С / достатъчен за 5 плочи / .

Буферът се подготвя по следния начин : 12.11 g трис се разтварят в 900 ml дестилирана вода. Прибавя се еднонормална солна киселина до рН на разтвора 8.0 и се довежда до обем 1000 ml с дестилирана вода.

След охлаждане до 50-55 ˚С агарът се разлива в пластмасови петриеви блюда.Всяко блюдо трябва да е изцяло , равномерно покрито с агар.



  1. Електрофорезен буфер

Използва се трис-малеиново кисел буфер с рН 7.4 / както при 4.1.5.1./ Разреждането е 1 : 10 .



  1. Реакционна смес / за един гел /

В 1.5 ml дестилирана вода се разтварят последователно 2 mg никотинамид аденин динуклеотид , 1.5 mg тиазолил блу тетразолиев бромид и 1 mg

5-метилфеназониум метил сулфат . Към разтвора се прибавят 3.5 ml трис-солно-ябълчнокисел буфер с рН 8.0 / приготвя се като към 18 ml 0.1 моларен трис-солнокисел буфер с рН 8.0 се прибавят 350 mg ябълчна киселина . Добавя се еднонормална натриева основа до рН 8.0 / .


  1. Електрофореза

Пробата се нанася върху целулозно-ацетатно фолио от страната на катода / 2-ра позиция / . Електрофорезата протича при напрежение 300 V за 30 минути при сила на тока 3-5 mA при стайна температура .

Поставя се в сушилня при температура 37 ˚С за 8-20 минути .
4.1.6.Отчитане и интерпретиране на резултатите


        1. Отчитане на резултатите

На анализ се подлагат 100 броя семена, избрани на случаен принцип.

След изсушаване на целулозно-ацетатното фолио се пристъпва към отчитане на резултата . За всеки хибрид е разработен стандартен спектър.

Всеки спектър се състои от ивици , които дават информация за майчината линия, за бащината линия и информация за самия хибрид .

При гарантирана чистота на родителските компоненти всеки хибрид от различни реколтни години дава еднакви спектри .


        1. Интерпретиране на резултатите

При анализиране вида на получения спектър са възможни следните случаи :



  1. Спектър на хибрида – броя и положението на отделните ивици в спектъра на семената от изследваната партида да съответстват на стандартния спектър на изследвания хибрид .

  2. Спектър на самоопрашената майчина линия – когато в получения спектър липсва информация от бащата , със сигурност може да се каже , че това са самоопрашени майчини растения .

  3. Спектър на чуждоопрашените / други сортове и резки отклонения / - в случаите , когато е налице спектър , който е различен от този на хибрида или на майката , става дума за чуждо опрашване или така наречените “резки отклонения” .

4.1.6.3. Норми и стойности на отклоненията


Показатели за сортова чистота при простолинейни хибриди царевица при подложени на електрофоретичен анализ 100 семена .



Сортова чистота, % не по-малко от

93%

Самоопрашени майчини растения не повече от

5%

Други сортове и резки отклонения не повече от

2%

Показатели за сортова чистота при сложни хибриди царевица при подложени на електрофоретичен анализ 100 семена .





Сортова чистота, % не по-малко от

90%

Самоопрашени майчини растения не повече от

8%

Други сортове и резки отклонения не повече от

2%

Показатели за сортова чистота при царевица самоопрашени линии, прости хибриди , в т.ч. сестринско – линейни кръстоски , компоненти на хибриди при подложени на електрофоретичен анализ 100 семена .




Сортова чистота на самоопрашени фертилни линии не по-малко от


99%

Други сортове и резки отклонения не повече от:

1%

Сортова чистота на прости хибриди , в т.ч. сестринско-линейни кръстоски на фертилна основа, като компоненти в хибридни участъци не по-малко от

97 %

Самоопрашени майчини растения не повече от

1%

Други сортове и резки отклонения не повече от

2%

Други сортове и резки отклонения при сестринско – линейни на стерилна основа, като родителски компоненти в хибриден участък

2 %

Други сортове и резки отклонения при стерилни самоопрашени линии не повече от

1%

Показатели за сортова чистота при слънчоглед – линии и прости хибриди , компоненти на тройни хибриди при подложени на електрофоретичен анализ 100 семена .




Сортова чистота на самоопрашени фертилни линии не по-малко от

99%

Други сортове и резки отклонения не повече от

1%

Сортова чистота на прости хибриди – родителски компоненти на тройни хибриди

98%

Други сортове и резки отклонения не повече от

2%

Други сортове и резки отклонения при самоопрашени стерилни линии не повече от

1%

Показатели за сортова чистота при слънчоглед - прости и тройни хибриди при подложени на електрофоретичен анализ 100 семена .





Сортова чистота, % не по-малко от

90%

Самоопрашени майчини растения не повече от

8%

Други сортове и резки отклонения не повече от

2%

4.2. Изоелектрично фокусиране / IEF/


Изоелектричното фокусиране се провежда в много тънък полиакриламиден гел с концентрация 2-2.5 %(w/v)на амфолити за градиент на рН 3-10 върху пластичен подкрепящ лист . Методът се използва за разделяне на протеини в зависимост от различната им изоелектрична точка . Амфолитите имат ниски молекулни тегла и висока степен на дифузия в гела. Молекулите на амфолити с по-ниски изоелектрични точки мигрират към анода, а тези с по-високи – към катода . При прилагане на електрично поле върху гела, където са нанесени протеините молекулите започват да мигрират към анода или катода в зависимост от своя заряд докато достигнат позиция в рН градиента, където зарядът им е нула. Тази рН стойност е “изоелектрична точка”, а ефектът се нарича “фокусиране” . Градиентът се поддържа стабилен чрез ленти от филтърна хартия напоени в електроден разтвор поставени между гела и електродите. Използва се кисел разтвор за анода и основен за катода .

4.2.1. Метод за определяне на сортова чистота и/или за сортова автентичност на самоопрашени линии и хибриди царевица чрез изоелектрично фокусиране на резервни протеини


4.2.1.1. Принцип
Резервните протеини / зеини / се извличат от царевични семена, избрани на случаен принцип и се разделят чрез изоелектрично фокусиране върху ултратънки гелове при рН 3-10.

Методът е подходящ за анализиране на резервни белтъци извлечени от колеоптил или зародиш.

Спектърът на протеиновите ивици , проявен на гела е характерен за всеки сорт или всяка самоопрашена линия.

Като цяло е възможно да се определи сортовата чистота чрез намиране на една или повече зеинови ивици от бащиния компонент, които липсват при майчиния и са представени в хибрида . Тези ивици може да бъдат използвани като маркерни за идентифициране на хибриди и като начин за изследване и определяне на хибридната чистота .

Ултратънките гелове са много икономични . Те могат да се пуснат на по-висок волтаж за по-кратко време и се оцветяват по-бързо от обикновените гелове .

4.2.1.2.Апарати и оборудване


4.2.1.2.1. Апаратура

Използва се хоризонтален апарат за електрофореза с охлаждаща система ( Multifor ІІ и Multitemp ІІІ ) осигурен с високоволтажен източник .


4.2.1.2.2. Химикали

Всички химикали трябва да бъдат от степен “Аналитичен реагент” или еквиваленти .



  1. Захароза

  2. Натриев аскорбат

  3. Акриламид ( специално пречистен за електрофореза )

  4. Бисакриламид ( БИС ) ( специално пречистен за електрофореза )

  5. 30% Акриламид / БИС – премикс ( 97/3 ) разтвор

  6. Амфолити ( Сервалити ) рН 3-10

  7. Амониев персулфат

  8. N N N ’N’ – Тетраметилетилендиамин ( ТЕМЕД )

  9. Уреа

  10. L – Аспарагинова киселина

  11. L – Глутаминова киселина

  12. L – Аргинин

  13. DL – Лизин

  14. Етилендиамин

  15. Трихлороцетна киселина

  16. Комаси брилянт блу G 250

  17. Комаси брилянт блу R 250

  18. Метанол

  19. Оцетна киселина ( 99% )

  20. Етанол ( 96% )

  21. БлуСлик

4.2.1.2.3. Разтвори


4.2.1.2.3.1. Екстрахиращ разтвор – към 16.7 g захароза и 8.3 g натриев аскорбат се разтварят в дестилирана вода – до 100 ml . Довежда се до рН 7.6 с аскорбинова киселина .
4.2.1.2.3.2. Аноден разтвор – 0.33 g L – аспарагинова киселина и 0.37 g

L – глутаминова киселина се разтварят в дестилирана вода и се довежда до 100 ml .

Този разтвор може да се съхранява една седмица при 4 ˚С .

4.2.1.2.3.3. Катоден разтвор – 0.40 g L – аргинин , 0.36 g DL – лизин и

12 ml етилендиамин се разтварят в дестилирана вода и се довежда до 100 ml .

Този разтвор може да се съхранява една седмица при 4 ˚С .

4.2.1.2.3.4.Основен гел-разтвор – 16.57 g акриламид и 0.43 g бисакриламид се разтварят в дестилирана вода и се довежда до 250 ml .

Този разтвор може да се съхранява две седмици при 4 ˚С .

4.2.1.2.3.5.Фиксиращ разтвор – трихлороцетна киселина 12% разтвор

( 240 g трихлороцетна киселина се разтварят в 1500 ml дестилирана вода Довежда се до 2 l ) . За един гел необходимото количество е 400 ml разтвор .

4.2.1.2.3.6.Гел-оцветяващ разтвор – 0.45 g комаси R 250 , 1.35g комаси G 250 , 330 ml оцетна киселина и 540 ml етанол се смесват и доливат с дестилирана вода до 3000 ml .За един гел са достатъчни 400 ml .

4.2.1.2.3.7.Гел обезцветяващ разтвор – 750 ml етанол и 125 ml оцетна киселина се смесват и се доливат с дестилирана вода до 2500 ml.


4.2.1.3. Процедура
4.2.1.3.1. Протеинова екстракция

4.2.1.3.1.1.Екстракция от колеоптил


Семената на царевицата кълнят 4 дни (за хибридите) и 5 дни ( за самоопра-шените линии ) в навлажнена филтърна хартия при 25 ˚С на тъмно . Отрязва се 12-15 mm от върха на колеоптила. Отстранява се листът. Колеоптилите се поставят в епруветки тип “Епендорф” , стриват се със стъклена пръчица , като след всяко стриване стъклената пръчица се промива с дестилирана вода и се заливат с 60 µl екстрахиращ разтвор (4.2.1.2.3.1.) . Центрофугират се 5 минути при 10 000 оборота. Бистрият разтвор се използва за електрофореза.

4.2.1.3.1.2. Екстракция от зародиш


Семената предварително се накисват в чаша с вода ( за една нощ ) за да поемат влага . Отделя се зародиша с помощта на скалпел . Зародишите се поставят по един в епруветки тип “Епендорф” , стриват се със стъклена пръчица , като след всяко стриване стъклената пръчица се промива с дестилирана вода и се заливат с 60 µl екстрахиращ разтвор (4.2.1.2.3.1.) . Центрофугират се 6 минути при 10 000 оборота. Бистрият разтвор се използва за електрофореза.

4.2.1.3.2.Приготвяне на гел


Чисти и сухи касети се събират според дизайна на използваната апаратура. Стъклените плочи се третират със БлуСлик преди да се съберат за улесняване отделянето на гела. Гел касетите включват пластичен подкрепящ лист. По време на разбъркване на гел-разтвора трябва да бъде избегнато образуването на въздушни мехурчета . Полимеризацията се стартира с добавяне на втория агент за полимеризация. Гелът трябва да бъде внимателно излят, избягвайки образуването на въздушни мехурчета . Полимеризацията е пълна след 20 минути .

Гелът е с размери 250 х 110 х 0.5 mm или 250 х 110 х 1 mm.

Смесват се следните компоненти :

Дестилирана вода - 32.0 ml

Уреа - 11.93 g

30% Акриламид/БИС премикс (97/3 ) разтвор - 6.0 ml

Амфолити рН 3-10 - 3.0 ml

За полимеризация :

1% Амониев персулфат ( свеж разтвор ) - 1.2 ml

ТЕМЕД - 0.08 ml

Прибавят се внимателно за да се предотврати вкарването на излишни количества въздух . След внимателно смесване , гелът се излива в “гел касетите” и се оставя да полимеризира .
4.2.1.3.3.Електрофореза
4.2.1.3.3.1.Подготовка
Гелът се поставя в центъра на преохладената ( 10˚С ) охлаждаща плоча на хоризонталния електрофорезен апарат . Под гела не трябва да има образувани въздушни мехурчета .
4.2.1.3.3.2.Префокусиране
Електродните филтърни ленти се напояват с подходящ разтвор ( 4.2.1.2.3.2. и 4.2.1.2.3.3. ) и се поставят в двата края на гела .Платинените електродни проводници се нагласяват така , че да бъдат точно над филтърните ленти . Свързват се проводниците на електродите с апарата . Поставя се предпазния капак . Свързва се с електрическата мрежа . Префокусирането протича при 700 V , 12 mA и 8 W за 20 минути .
4.2.1.3.3.3. Нанасяне на пробите
След префокусирането апаратът се изключва . Предпазният капак се отстранява . За нанасяне на пробите се използва апликаторна силиконова лента , която се полага директно върху повърхността на гела . Могат да се нанасят до 52 проби с обем 10-20 µl във всяко кладенче . Поставят се електродите и предпазният капак и се стартира изоелектричното фокусиране . То протича при 2000 V , 14 mA 14 W за 90 минути ( за един гел ) . Електрофорезата протича в посока от анода към катода .

4.2.1.3.3.4.Фиксиране и оцветяване

В края на електрофорезата , гелът се премества във фиксиращ разтвор

( 4.2.1.2.3.5. ) на слабо разклащане , най-малко за 30 минути . Тогава гелът се оцветява чрез поставянето му в гел оцветяващ разтвор ( 4.2.1.2.3.6.) при разклащане за 1 час .

Обезцветяване се извършва ако е необходимо . Следва кратко измиване с дестилирана вода . Гелът се изсушава за цяла нощ на стайна температура . Готовите гелове могат да се съхраняват много дълго при стайна температура .
4.2.1.3.4.Отчитане и интерпретиране на резултатите
Понастоящем това е най-добрият изпозван метод за идентифициране на сортове по сравнителен път чрез изпитване дали протеиновия образец на пробата е идентичен с този на автентичният сортов източник , анализиран по същото време .

Чрез този метод се определя сортовата чистота на хибридните семена . Сравнявайки протеиновите образци на родителските компоненти с този на хибрида е нужно да се намерят в хибрида една или повече маркерни ивици ( представени само в бащината линия ) . Семена с протеинов модел идентичен на майчината линия се квалифицират като самоопрашени . Чуждоопрашените семена показват различен протеинов образец , най вече протеинови ивици на неочаквани места . Семена с различен протеинов образец могат да се появят и поради механично замърсяване с друг сорт .

В съответствие към различните типове хибриди , оценяването е както следва :

- Прости хибриди : за хибрида е характерен само един ивичен модел с ивици наследени от двете родителски линии

- Трилинейни хибриди : майчиния компонент е кръстоска и също съдържа ивици от двете линии .Така в хибрида има два възможни протеинови образци ( ивица от бащиния компонент и една от две ивици от майчиния компонент ) , които са характерни .
4.2.2. Метод за определяне на сортовата чистота и/или за сортова автентичност на линии слънчоглед чрез изоелектрично фокусиране

/ IEF/

4.2.2.1.Принцип


Протеините се извличат от слънчогледови семена, избрани на случаен принцип и се разделят чрез изоелектично фокусиране върху ултратънки гелове при рН 3-10. Спектърът на протеиновите ивици, проявен на гела е характерен за всеки сорт или самоопрашена линия.

Като цяло е възможно да се определи хибридната чистота чрез намиране на една или повече ивици в бащиния компонент , които липсват при майчиния и са представени в хибрида . Тези ивици може да бъдат използвани като маркерни за идентифициране на хибриди и като начин за изследване и определяне на хибридната чистота .

Ултратънките гелове са много икономични . Те могат да се пуснат на по-висок волтаж за по-кратко време и се оцветяват по-бързо от обикновените гелове .
4.2.2.2.Апарати и оборудване
4.2.2.2.1. Апаратура

Използва се хоризонтален апарат за електрофореза с охлаждаща система ( Multifor ІІ и Multitemp ІІІ ) осигурен с високоволтажен източник .


4.2.2.2.2. Химикали
Всички химикали трябва да бъдат от степен “Аналитичен реагент” или еквиваленти .

1)Едномоларен трис солнокисел буфер с рН 7.2

2)Бета - меркаптоетанол

3)Акриламид ( специално пречистен за електрофореза )

4)Бисакриламид ( БИС ) ( специално пречистен за електрофореза )

5)30% Акриламид / БИС – премикс ( 97/3 ) разтвор

6)Амфолити ( Сервалити ) рН 3-10

7)Амониев персулфат

8) N N N ’N’ – Тетраметилетилендиамин ( ТЕМЕД )

9)Уреа


10)L – Аспарагинова киселина

11)L – Глутаминова киселина

12)L – Аргинин

13)DL – Лизин

14)Етилендиамин

15)Трихлороцетна киселина

16)Комаси брилянт блу G 250

17)Комаси брилянт блу R 250

18) Метанол

19)Оцетна киселина ( 99% )

20) Етанол ( 96% )

21) БлуСлик


4.2.2.2.3. Разтвори
4.2.2.2.3.1. Екстрахиращ разтвор – към 10 ml едномоларен трис солнокисел буфер и 0.2 ml бета – меркаптоетанол се добавя дестилирана вода до 100 ml .

4.2.2.2.3.2. Аноден разтвор – 0.33 g L – аспарагинова киселина и 0.37 g

L – глутаминова киселина се разтварят в дестилирана вода и се довежда до 100 ml .

Този разтвор може да се съхранява една седмица при 4 ˚С .


4.2.2.2.3.3. Катоден разтвор – 0.40 g L – аргинин , 0.36 g DL – лизин и 12 ml етилендиамин се разтварят в дестилирана вода и се довежда до 100 ml .

Този разтвор може да се съхранява една седмица при 4 ˚С .


4.2.2.2.3.4.Основен гел-разтвор – 16.57 g акриламид и 0.43 g бисакриламид се разтварят в дестилирана вода и се довежда до 250 ml .

Този разтвор може да се съхранява две седмици при 4 ˚С .


4.2.2.2.3.5.Фиксиращ разтвор – трихлороцетна киселина 12% разтвор

( 240 g трихлороцетна киселина се разтварят в 1500 ml дестилирана вода Довежда се до 2 l . За един гел необходимото количество е 400 ml разтвор .


4.2.2.2.3.6.Гел-оцветяващ разтвор – 0.45 g комаси R 250 , 1.35g комаси G 250 , 330 ml оцетна киселина и 540 ml етанол се смесват и доливат с дестилирана вода до 3000 ml .За един гел са достатъчни 400 ml .
4.2.2.2.3.7.Гел обезцветяващ разтвор – 750 ml етанол и 125 ml оцетна киселина се смесват и се доливат с дестилирана вода до 2500 ml.
4.2.2.3. Процедура
4.2.2.3.1. Протеинова екстракция от котилидони или зародиш
Методът е подходящ за анализиране на резервни белтъци извлечени от котилидони или зародиш.

За протеинова екстракция се използват котилидоните от покълнали семена .

Семената на слънчогледа кълнят в навлажнена филтърна хартия при 25 ˚С на тъмно . След 3-4 дни се отрязват котилидоните като се отстранява тънката ципа , която ги обвива. Поставят се по един в епруветки тип “Епендорф” и се заливат с 300 µl

екстрахиращ разтвор (4.2.2.2.3.1.) , стриват се със стъклена пръчица и епруветките се затварят с капаче. Центрофугират се 6 минути при 10 000 обор/мин. Бистрият разтвор се използва за електрофореза.

За протеинова екстракция могат да се използват и зародиши от семена слънчоглед.

Семената предварително се накисват в чаша с вода за една нощ за да поемат влага . Отделя се зародиша с помощта на скалпел . Зародишите се поставят по един в епруветки тип “Епендорф” , стриват се със стъклена пръчица , като след всяко стриване стъклената пръчица се промива с дестилирана вода и се заливат с 300 µl (4.2.2.2.3.1) екстрахиращ разтвор.


4.2.2. 3.2.Приготвяне на гел
Чисти и сухи касети са събрани според дизайна на използваната апаратура.Стъклените плочи са третирани със силикон преди да се съберат за улесняване отделянето на гела. Гел касетите включват пластичен подкрепящ лист.По време на разбъркване на гел-разтвора трябва да бъде избегнато образуването на въздушни мехурчета . Полимеризацията се стартира с добавяне на втория агент за полимеризация . Гела трябва да бъде внимателно излят , избягвайки образуването на въздушни мехурчета . Полимеризацията е пълна след 20 минути .

Гелът е с размери 250 х 110 х 0.5 mm .

Смесват се следните компоненти :

Дестилирана вода - 32.0 ml

Уреа - 11.93 g

30% Акриламид/БИС премикс (97/3 ) разтвор - 6.0 ml

Амфолити рН 3-10 - 3.0 ml

За полимеризация :

1% Амониев персулфат ( свеж разтвор ) - 1.2 ml

ТЕМЕД - 0.08 ml

Прибавят се внимателно за да се предотврати вкарването на излишни количества въздух . След внимателно смесване , гелът се излива в “гел касетите” и се оставя да полимеризира .
4.2.2.3.3.Електрофореза
4.2.2.3.3.1.Подготовка
Гелът се поставя в центъра на охлаждащата плоча на хоризонталния електрофорезен апарат, когато температурата й достигне 10˚С. Под гела не трябва да има образувани въздушни мехурчета .

4.2.2.3.3.2.Префокусиране


Електродните филтърни ленти се напояват с подходящ разтвор ( 4.2.2.2.3.2. и 4.2.2.2.3.3. ) и се поставят в двата края на гела . Платинените електродни проводници се нагласяват така , че да бъдат точно над филтърните ленти . Свързват се проводниците на електродите с апарата . Поставя се предпазният капак . Свързва се с електрическата мрежа . Префокусирането протича при 700 V , 12 mA и 8 W за 20 минути .

4.2.2.3.3.3. Нанасяне на пробите


След префокусирането апаратът се изключва . Предпазният капак се отстранява . За нанасяне на пробите се използва апликаторна силиконова лента, която се полага директно върху повърхността на гела . Могат да се нанасят до 52 проби с обем 10-20 µl във всяко кладенче. Поставят се електродите и предпазният капак и се стартира изоелектричното фокусиране . То протича при 2000 V , 14 mA 14 W за 90 минути ( за един гел ) .

4.2.2.3.3.4.Фиксиране и оцветяване


В края на електрофорезата , гелът се премества във фиксиращ разтвор (4.2.2.2.3.5. ) на слабо разклащане , най-малко за 30 минути . Тогава гелът се оцветява чрез поставянето му в гел оцветяващ разтвор ( 4.2.2.2.3.6.) при разклащане за 1час и 30 минути.

Обезцветяване се извършва ако е необходимо . Следва кратко промиване с дестилирана вода . Гелът се изсушава за цяла нощ на стайна температура . Готовите гелове могат да се съхраняват много дълго при стайна температура .

4.2.2.3.4.Отчитане и интерпретиране на резултатите
Чрез този метод се определя сортовата чистота на хибридните семена. Сравнявайки протеиновите образци на родителските компоненти с тези на хибрида в хибрида се намират една или повече маркерни ивици ( представени само в бащината линия ) . Семена с протеинов модел идентичен на майчината линия се квалифицират като самоопрашени . Чуждоопрашените семена показват различен протеинов образец, най-вече протеинови ивици на неочаквани места. Различен протеинов образец може да се прояви и поради механично замърсяване с друг сорт .

4.2.2.3.4.1.Норми и стойности на отклоненията


Показатели за сортова чистота при простолинейни хибриди царевица. Електрофоретичен анализ се извършва на 100 броя семена .



Сортова чистота, % не по-малко от

93%

Самоопрашени майчини растения не повече от

5%

Други сортове и резки отклонения в не повече от

2%

Показатели за сортова чистота при сложни хибриди царевица при подложени на електрофоретичен анализ 100 семена .





Сортова чистота, % не по-малко от

90%

Самоопрашени майчини растения не повече от

8%

Други сортове и резки отклонения в не повече от

2%

Показатели за сортова чистота при царевица самоопрашени линии, прости хибриди , в т.ч. сестринско – линейни кръстоски , компоненти на хибриди при подложени на електрофоретичен анализ 100 семена .




Сортова чистота на самоопрашени фертилни линии в % , не по-малко от


99%

Други сортове и резки отклонения не повече от:

1%

Сортова чистота на прости хибриди , в т.ч. сестринско-линейни кръстоски ( на фертилна основа) , компоненти на хибриди не по-малко от

97 %

Самоопрашени майчини растения не повече от

1%

Други сортове и резки отклонения не повече от

2%

Други сортове и резки отклонения при сестринско – линейни кръстоски ( на стерилна основа),компоненти на хибриди не повече от

2 %

Други сортове и резки отклонения при стерилни самоопрашени линии не повече от

1%

Показатели за сортова чистота при слънчоглед – линии и хибриди , компоненти на тройни хибриди при подложени на електрофоретичен анализ 100 семена .




Сортова чистота, на самоопрашени фертилни линии , в %

99%


Други сортове и резки отклонения не повече от

1%

Сортова чистота на прости хибриди – родителски компоненти на тройни хибриди , в %

98%

Други сортове и резки отклонения не повече от

2%

Други сортове и резки отклонения при самоопрашени стерилни линии не повече от

1%

Показатели за сортова чистота при слънчоглед - прости и тройни хибриди при подложени на електрофоретичен анализ 100 семена .




Сортова чистота, % не по-малко от

90%

Самоопрашени майчини растения не повече от

8%

Други сортове и резки отклонения не повече от

2%

5.Документиране
За резултатите от електрофоретичното изпитване се издава свидетелство за сортова чистота по образец, утвърден от изпълнителния директор на ИАСАС. Свидетелството за сортова чистота или сортова принадлежност се издава в три екземпляра

- един за притежателя на семената

- един за Териториалното звено на ИАСАС , взело пробите

- един за архив на Централната лаборатория на ИАСАС



Приложение № 2

Използвани термини и определения
1.Биополимери – високомолекулни органични съединения от съществено значение за структурата и функциите на живите организми.

2.Ензими – биологични катализатори с белтъчна природа , притежаващи висока специфичност : те ускоряват протичането на определени биохимични реакции и играят важна роля в процесите на обмяната на веществата .

3.Изоензими – множествени молекулни форми на даден ензим , които се срещат в един исъщ организъм и които имат сходни каталитични свойства .

4.Електрофореза – физическото разделяне на изоензими или други биополимери под влияние на електрично поле / прав ток , постоянно напрежение / въз основа на техния заряд и различното им молекулно тегло .

5. Хоризонтална електрофореза – електрофореза , която протича върху хоризонтално разположен носител .

6. Буферен разтвор – разтвор на киселини , основи и техни соли , поддържащ постянна концентрация на водородни йони в определени граници .

7. Реакционна смес – разтвор на химични вещества , осигуряващи протичането на ензимна реакция .

8.Сортова чистота – процент на типичните за хибрида семена .

9. Типични за хибрида семена – напълно идентични със стандартните спектри за изследвания хибрид .

10.Семена от самоопрашени майчини растения – напълно идентични със стандартните спектри на самоопрашената линия , използвана като майка при производството на хибрида .

11. Резки отклонения – отличаващи се рязко от типичните за хибрида и типичните за майчината линия .

12. Изоелектрично фокусиране – разделяне на протеините въз основа на различната изоелектрична точка , различната големина на молекулите и различната скорост на придвижване към анода или катода.

13. Предфокусиране – кратко протичане на електрофореза , преди нанасяне на пробите

14. Изоелектрична точка – точката , в която молекулите на протеините в гела спират своето движение, поради това че не носят заряд . Изоелектричната точка е различна при различните протеини , поради различната им способност да приемат водородните йони .

15. Амфолити – синтетични аминокиселини с определена изоелектрична точка , ниско молекулно тегло и висока степен на дифузия в гела . Протеините заемат определено място между тях .

16.Зеини – резервни протеини , които се намират в ендосперма и зародиша на семената на царевицата . Проявяват се точно като мономерни ензими ( една ивица при линия , две ивици при хибрид )

17. Фиксиращ разтвор – използва се 12%-ен разтвор на трихлороцетна киселина, който прави протеините неразтворими .Така се улеснява оцветяването на гела .
Приложение № 1

МИНИСТЕРСТВО НА ЗЕМЕДЕЛИЕТО и ГОРИТЕ


ИЗПЪЛНИТЕЛНА АГЕНЦИЯ ПО СОРТОИЗПИТВАНЕ, АПРОБАЦИЯ И СЕМЕКОНТРОЛ



ДИРЕКЦИЯ ЦЕНТРАЛНА ЛАБОРАТОРИЯ


СВИДЕТЕЛСТВО ЗА СОРТОВА ЧИСТОТА №





(от електрофореза)


Пробата е постъпила на




маса на пробата

g

Пробата е изпратена от

ГДАС ТЗ

Семето принадлежи на




№ и дата на протокола за пробовземане




№ и дата на акта за апробация

изд.от

ТЗ

Майчина линия:




размн.










Бащина линия:




размн.









Сведения за семето, дадени от изпращача



Вид,сорт,размножение:




Реколтна година




Произход:




Партида №

маса

кg.

Резултати от изследването



Вид и сорт





Семена подложени на анализ:

100 бр

От тях:




а) типични за сорта










б) самоопрашени майчини растения










в) други примеси













Сортова чистота:


ЗАКЛЮЧЕНИЕ:



Семето се одобрява за :







гр.София

Ст.специалисти: Директор “Централна лаборатория”

1113 София, бул. “Цариградско шосе” №125, бл.1, тел. 02/ 870 04 77, тел./факс: 02/ 870 80 27




Съдържание:

  1. Цел.....................................................................................................1

  2. Принцип............................................................................................1

  3. Правила за вземане на проба за електрофореза............................1

  4. Електрофореза на изоензими..........................................................2

4.1. Принцип на извършване на електрофореза на изоензими........ ..2

4.1.2. Същност и обхват на метода.......................................................3

4.1.3. Апаратура и пособия ...................................................................3

4.1.3.1. Система “Сартофор”..................................................................3

4.1.4. Реактиви и разтвори.....................................................................3

4.1.5. Техники за прилагане на метод електрофореза при работа с апарат “Сартофор”..............................................................................................4

4.1.5.1. АСР – Кисела фосфатаза...........................................................4

4.1.5.2. Техника на алкохол дехидрогеназа /ADH/…..........................5

4.1.5.3. Техника на фосфоглюкомутаза /PGM/.....................................6

4.1.5.4. Техника на малат дехидрогеназа /MDH/..................................6

4.1.6. Отчитане и интерпретиране на резултатите...............................7

4.1.6.1. Отчитане на резултатите...........................................................7

4.1.6.2. Интерпретиране на резултатите .............................................8

4.1.6.3. Норми и стойности на отклоненията ......................................8

4.2. Изоелектрично фокусиране /IFF/ ..................................................9

4.2.1. Метод за определяне на сортовата чистота и /или сортова автентичност на линии или хибриди царевица чрез изоелектрично фокусиране... ...10

4.2.1.1. Принцип ....................................................................................10

4.2.1.2. Апарати и оборудване..............................................................10

4.2.1.2.1. Апаратура...............................................................................10

4.2.1.2.2. Химикали ...............................................................................10

4.2.1.2.3. Разтвори .................................................................................11

4.2.1.2.3.1. Екстрахиращ разтвор .........................................................11

4.2.1.2.3.2. Аноден разтвор ...................................................................11

4.2.1.2.3.3. Катоден разтвор...................................................................11

4.2.1.2.3.4. Основен гел разтвор ...........................................................11

4.2.1.2.3.5. Фиксиращ разтвор ..............................................................11

4.2.1.2.3.6. Гел ощветяващ разтвор ......................................................11

4.2.1.2.3.7. Гел обезцветяващ разтвор ..................................................11

4.2.1.3. Процедура ..................................................................................11

4.2.1.3.1. Протеинова екстракция .........................................................11

4.2.1.3.1.1. Екстракция от колеоптил ...................................................11

4.2.1.3.1.2. Екстракция от зародиш.......................................................11

4.2.1.3.2. Приготвяне на гел ..................................................................12

4.2.1.3.3. Електрофореза ........................................................................12

4.2.1.3.3.1. Подготовка ...........................................................................12

4.2.1.3.3.2. Префокусиране ....................................................................12

4.2.1.3.3.3. Нанасяне на пробите .......................................................... 12

4.2.1.3.3.4. Фиксиране и оцветяване .....................................................13

4.2.1.3.4. Отчитане и интерпретиране на резултатите .........................13

4.2.2. Метод за определяне на сортовата чистота и /или сортова автентичност на линии или хибриди слънчоглед чрез изоелектрично фокусиране............13

4.2.2.1. Принцип......................................................................................13

4.2.2.2. Апарати и оборудване ..............................................................14

4.2.2.2.1. Апаратура.............................................................................14

4.2.2.2.2. Химикали ............................................................................14

4.2.2.2.3 Разтвори ...............................................................................14

4.2.2.2.3.1. Екстрахиращ разтвор .........................................................14

4.2.2.2.3.2. Аноден разтвор ...................................................................14

4.2.2.2.3.3. Катоден разтвор...................................................................14

4.2.2.2.3.4. Основен гел разтвор ...........................................................14

4.2.2.2.3.5. Фиксиращ разтвор ..............................................................15

4.2.2.2.3.6. Гел ощветяващ разтвор ......................................................15

4.2.2.2.3.7. Гел обезцветяващ разтвор ..................................................15

4.2.2.3. Процедура .................................................................................15

4.2.2.3.1. Протеинова екстракция от котилидони или зародиш ..... .15

4.2.2.3.2. Приготвяне на гел ..................................................................15

4.2.2.3.3.Електрофореза ........................................................................16

4.2.2..3.3.1. Подготовка .........................................................................16

4.2.2.3.3.2. Префокусиране ...................................................................16

4.2.2.3.3.3. Нанасяне на пробите ..........................................................16

4.2.2.3.3.4. Фиксиране и оцветяване ....................................................16

4.2.2.3.4. Отчитане и интерпретиране на резултатите .......................16

4.2.2.3.4.1. Норми и стойности на отклоненията ...............................17

5. Документиране .................................................................................18

Приложение 1 .......................................................................................19



Приложение 2 ......................................................................................20


База данных защищена авторским правом ©obuch.info 2016
отнасят до администрацията

    Начална страница