Молекулярна биология и наследствени болести при домашните животни проф дсн Лилян Сотиров

Както вече описахме, наследствена информация освен в клетъчното ядро се съхранява и в различни цитоплазмени структури. Прието е извън ядрената наследственост да се означава като плазмон, а гените разположени в нея – плазмогени.

Енергийните централи на клетката са нейните митохондрии. Те са отговорни за синтезата на клетъчният енергиен носител – Аденозинтрифосфат (АТФ). Митохондриите притежават собствена наследствена информация базирана в двойноверижна ДНК молекула и различен генетичен код. Митохондриалната ДНК при човек съдържа 37 гена, повечето от които кодират ензимите участващи в дихателните вериги. При мутиране на някои от тези гени ефективността на митохондриите рязко намалява. При наличие на такива увредени митохондрии в зиготата бъдещият организъм би се родил с отклонения в енерго-консумиращите органи – сърце, мозък, и др.

Други цитоплазмени органели съдържащи наследствена информация са пластидите при растителните клетки. ДНК молекулите при тях са под формата на единични или слепени нишки. Мутациите, които настъпват в пластидната ДНК се унаследяват мозаечно от носещите ги органели. Така едни клетки съдържат нормални органели, други само мутантни, а трети и нормални и мутантни. Пример за това бихме могли да дадем с храстът Ficus benjamina, при който листата са с на зелено-бели петна. Участъците съдържащи зелен цвят съдържат нормални хлоропласти, а белите участъци са изградени от клетки носители на мутирали пластиди.

Като мутагени се означават всички фактори на средата способни да предизвикат мутации в наследственият апарат на клетката. Мутационният процес е отличителен белег на живият организъм. Мутагенезата може да бъде разгледана като основен фактор за възникване на наследствени и туморни заболявания, но и като начин за увеличаване на генетичният полиморфизъм на популациите. Според естеството си на действие мутагенните фактори се разделят на две основни групи:

• 
  Физични мутагени – към тях се отнасят ултравиолетовите и йонизиращите лъчения.
  

• 
  Ултравиолетови лъчения – представляват нейонизиращи лъчения, чиято биологична активност е най-висока при дължина на вълната между 250 и 290 nm. УВЛ са опасни преди всичко за едноклетъчните организми, където те лесно проникват до клетъчното ядро. Установено е, че пуриновите бази са значително по-чувствителни в сравнение с пиримидиновите, което обяснява по-високата честота на тиминовите димерни пръстени. При появата на такъв димерен пръстен двойноверижната конформация на ДНК молекулата се променя в резултат на което се блокира процесът репликация и клетката загива. При повечето организми съществува механизъм за репариране на ДНК молекулата, при която се откриват димерни пръстени. Механизмът се означава като фотореактивация и ще бъде подробно разгледан в следващият раздел. Освен образуването на димерни пръстени УВЛ могат да индуцират транзиции, трасверзии и делеции в отделни участъци от генома на организма.
  
• 
  Йонизиращи лъчения – те притежават способността да предизвикват йонизация в атомите и молекулите на клетъчните вещества като при взаимодействието с водата в клетката се отделят високореактивни йони - ОH^-, H⁺, e^-, HO_2, H₃O⁺ и др. Тези активни радикали взаимодействат с различните молекули в клетката включително и с ДНК и предизвикват мутационни явления. Йонизиращите лъчения се разделят на корпускулни (протони, електрони, неутрони и др.), и електромагнитни (рентгенови и гама лъчи). Корпускулните лъчения притежават способността бързо да предават енергията си и да предизвикват йонизация с голяма плътност, докато рентгеновите и гама лъчите притежават голяма прониквателна способност и ниско линейно предаване на енергията. Погълнатата доза е основният критерии за мутационният ефект от йонизиращите лъчения. Доказано е, че йонизиращата радиация е отговорна за различни по големина едно и двуверижни разкъсвания в молекулата на ДНК, които се смятат за предпоставка за възникването на хромозомни аберации. В зависимост от произхода си източниците на йонизиращите лъчения се разделят на естествени и изкуствени. Към естествените спадат космическото и земното гама лъчение. Към изкуствените се отнасят глобалното радиоактивно замърсяване, облъчването при самолетни полети, рентгенографията като способ в медицината и др.
  

• 
  Химични мутагени – към тях се отнасят всички вещества, които имат способността да предизвикват мутагенез в наследствените структури на клетката. В зависимост от произхода си мутагенните химични вещества се разделят на естествени и изкуствени. Към групата на естествените химични мутагени спадат различни алкалоиди, флавоноиди, хетероциклени амини и др. Мутагените попадащи в околната среда в следствие на дейността на човека се причисляват към втората група химични вещества. Тук се отнасят отработените газове, токсичните метали, различни синтетични съединения откриващи се в промишлените отпадъци и др. Според приложението си химичните мутагенимогат да бъдат разделени на:
  

• 
  Пестициди, инсектициди, хербициди и др.
  
• 
  Промишлени отпадъци.
  
• 
  Фармацевтични препарати
  
• 
  Консерванти, подобрители, подправки и замърсители на храни;
  

Повечето мутагени са различни киселини, основи, алкилиращи съединения и др., които влизат в пряк контакт с веригите на ДНК. При това взаимодействие се променя химичната идентичност на базите, при което някои от нуклеотидите придобиват свойството да изграждат водородни връзки с некомплементарни на тях нуклеотиди. Други химични агенти предизвикват невъзможност на нуклеотидите да изграждат връзки нито с пиримидинови, нито с пуринови бази. Чрез тези механизми различните химични агенти действат пряко върху нуклеотидите и водят до появата на мутации. Пример може да бъде даден с Азотната киселина, която предизвиква окислително дезаминиране на базите и така предизвиква точкови мутации подобни на базовите замени. При дезаминирането на аденина се получава хипоксантин, който изгражда връзки с цитозин вместо с тимин. Впоследствие цитозинът се дезаминира до урацил, който се свързва с аденин вместо с гуанин. Така първоначалната двойка Аденин – Тимин, се заменя от двойката Гуанин – Цитозин.

Базовите аналози са сходни на нормалните азотни бази вещества, които могат да се свързват към веригата на ДНК по време на репликацията вместо природните нуклеотиди. Те предизвикват явление сходно с базовите замени – срещу тях се включват погрешни нуклеотиди. Пример можем да дадем със съединението 5-бромурацил. Той е аналог на тимина, но има свойството да се сдвоява с гуанин. При наличието му в клетката първоначално (при първа репликация) срещу нуклеотида Аденин се свързва 5-бромурацил. Впоследствие (следваща репликация- F1) срещу това съединение се свързва Гуанин. При следваща репликация (F2) срещу Гуанина се свързва Цитозин. Така една нуклеотидна двойка се заменя с друга, което променя един кодон, а той променя първичната структура на кодираният от генът белтък.

Установени са и мутагени причиняващи изместване рамката на четене.Това са съединения с плоска структура изградени от няколко свързани пръстена (полициклични), които се свързват със също така плоските повърхности на пуриновите и пиримидинови бази в ДНК посредством стекинг-взаимодействия. Тези мутагени стабилизират еднобазовите бримки като по този начин повишават вероятноста за единични базови делеции или инсерции. Те от своя страна водят до мутации свързани с изместване рамката на четене. Пример може да бъде даде с етидиевият бромид, който е едно от най-често използваните вещества при ДНК анализите (агарозна гел електрофореза), поради свойството му да изгражда стабилни съединение с двойноверижна ДНК молекула, видими под UV светлина.

Алкилиращите съединения са група химични мутагени притежаващи една или няколко реактивни алкилни групи - СH₃, С₂H₅, С₃H₇ и др. При взаимодействието си с молекулата на ДНК те са способни да предизвикват замяна на отделни нуклеотиди, както и двойноверижни разкъсвания.

Активните кислородни форми (^.О₂^-, OH^., О₂, H₂O₂ и NO) са силно реактивоспособни структури, съдържащи единични електрони във външният си електронен слой. Те се образуват в клетката под въздействието на УВЛ, различни замърсители на околната среда, антибиотици, пестициди и др. Една от най-често срещаните мутации под въздействието на активните кислородни форми е двойноверижното пречупване на ДНК, което почти винаги е летално за клетката.

Акридиновите бои осъществяват мутагенното си действие посредством включването си между две съседни бази в молекулата на ДНК. По този начин те предизвикват разтягане на веригата в засегнатичт участък. При репликацията срещу този участък се свързва допълнителен нуклеотид. Така те променят нуклеотидната последователност в засегнатият кодон.

Биологични мутагени – към тази група мутагени се отнасят вирусите, бактериофагите, токсините и др. Вирусите са едни от най-честите причинители на мутации както в еукариотната така и в прокариотната клетка. В повечето случаи медицината обръща внимание единствено на инфекциозните качества на вирусите, но те предизвикват редица отклонения в генома на клетката, в която попаднат. При остра инфекция те са способни да предизвикат разкъсване на хромозомите, фрагментация и пулверизация, които се оказват пагубни за клетката. При хронични инфекции те са способни да инициират хромозомни аберации и дори геномни мутации (полиплоидия и анеуплоидия). Съществува и група вируси (ретровируси) способни да интегрират генома си в генома на клетката. Използвайки ензимният апарат на клетката те разкъсват определен участък и вмъкват собственият си геном. При репликацията на клетката вирусната ДНК последователност се предава в следващите поколения. В повечето случаи вирусният геном се вмъква по средата или малко след промотора на някой ген и така се измества рамката на четене, при което се синтезират функционално различни белтъчини. В следствие на тези промени в генома клетката се лишава от важни за съществуването и функции.

Описаните до момента различни мутационни събития предизвикват промени в първичната структура на ДНК, както и отклонения в процесите транскрипция и репликация. Почти всички описани мутагенни фактори проявяват своето действие през целият живот на клетката.

Едни от най-директните механизми се изразяват с ензимно отстраняване на повредата чрез обръщане посоката на химичната реакция причинила мутацията. Тези механизми се обозначават като същинска поправка. Наблюдават се и по-сложни механизми, при които първо се изрязва увреденият нуклеотид и в последствие се замества с нов комплементарен на отсрещната верига нуклеотид. Понякога освен увреденият нуклеотид се изрязват и група нуклеотиди разположени около него, след което празното пространство от едната верига се допълва с нуклеотиди комплементарни на отсрещната. Така ДНК веригата възстановява нормалната си първична структура. Този тип механизми се означават като поправка чрез изрязване.

Освен чрез изрязване съществуват и механизми на поправка чрез рекомбинация. Те се проявавят, когато мутацията е засегнала и двете вериги на молекулата ДНК и така едната верига не може да служи като матрица. При този тип механизми увреденият участък се заменя (рекомбинира) с двойноверижен участък от хомоложна молекула ДНК.

Понякога напредването на репликационната вилка се блокира от увредена база. В такива случаи се включва специален вид ДНК полимераза, който има способността да добавя нуклеотиди към синтезираната верига независимо от матрицата. Така се избягва увреденият участък, но се включват множество погрешни нуклеотиди.

Същинска поправка на уврежданията в ДНК

Фотореактивация

При фотореактивацията измененията в ДНК молекулата се отстраняват директно от определени ензими. При облъчването на някои бактерии с UV светлина се установява образуването на деимерни пръстени между два съседни остатъка на тимина. Това предизвиква локално увреждане на една от веригите на ДНК молекулата и супресира експресията на гена разположен в този участък. При поставянето на колониите бактерии на видима светлина в клетките им се синтезира ензимът фотолиаза кодиран от ген phr. Този ензим има силно изразен афинитет към димерите на пиримидиновите бази като на тъмно той образува комплекс със тях. Използвайки енергията на видимата светлина тези комплекси се разрушават като димерите се превръщат в мономери. Така нормалната структура на веригата се възстановява и засегнатият ген възстановява функцита си.

При ексцизионната репарация се активира гликозилазен ензим, който има свойството да открива и отстранява некомплементарните бази във веригите. Първоначално в засегнатият участък се наблюдава празно пространство (геп) в една от двете вериги. В последствие образуваният „Геп“ се разпознава от втори ензим, който хидролизира фосфодиестерната връзка от едната страна на празното пространство и така изгражда свободен 3’-хидроксилен край. Свободният 3’ край се разпознава от притежаващата 5’>3’ екзонукклеазна активност, репарираща ДНК полимераза, която отстранява увреденият нуклеотид. Накрая интактността между двете вериги се възстановява от комбинираното действие на ензимите ДНК полимераза и лигаза, които на принципа на комплементарността свързват подходящ нуклеотид (комплементарен на срещуположният) и възстановяват фосфодиестерните връзки между двете вериги. Описаният процес бихме могли да разделим на няколко отделни фази:

1. 
   Откриване на димерите – участва ензима ултравиолетова ендонуклеаза.
   
2. 
   Инцизия на веригата близо до димерите – участва ензима ултравиолетова ендонуклеаза.
   
3. 
   Ексцизия (отстраняване) на увреденият участък - участва ензима ултравиолетова екзонуклеаза.
   
4. 
   Ресинтезиране на нови комплементарни на отсрещната верига нуклеотиди – участват ензимите ДНК полимераза и полинуклеотидлигаза.
   
5. 
   Възстановяване на двойноверижният строеж на ДНК чрез изграждане на съответните химични връзки – участват ензимите ДНК полимераза и полинуклеотидлигаза.
   

При засягане на двойноверижен участък се задействат механизмите на рекомбинационната репарация. В повечето случаи се касае за репарация на скъсани двойноверижни участъци. При наличието на тиминови димери, които не са отстранени чрез други механизми ДНК-полимеразата може да използва като матрица за репликацията на този участък хомоложната молекула ДНК (сестринска или несестринска хроматида). Поради характера на този процес той се означава като механизъм на хомоложната рекомбинация. Предполага се, че този механизъм се е развил като механизъм за поправка на летални за клетката повреди в молекулата на ДНК, а в последствие е залегнал като механизъм на комбинативна изменчивост.

При засягане и на двете хомоложни молекули ДНК репарацията се извършва посредством механизма на нехомоложното свързване на крайщата (nonhomologous end joining). При такива повреди доближаването на разкъсаните крайща на ДНК се осъществява посредством образуване на случайни къси комплементарни сдвоявания. Впоследствие ДНК полимеразата и лигазата запълват появилите се празнини. При този тип репарация основна роля заема белтъкът Ku, който спомага за доближаването на двата разкъсани края и ги предпазва от ендонуклеазната (разрушаваща) способност на някои вътреклетъчни ензими. Поради високата си сложност ефективността на този механизъм е твърде малка.

https://www.youtube.com/watch?v=xS6bJMcOrAk

Репликация на увредена ДНК без отстраняване на повредата

Въпреки, че повечето от описаните до момента механизми на репарация са доста ефективни увреждания в молекулата на ДНК винаги остават. При репликацията на такива участъци полимеразата е представена пред два варианта. Единият вариант е да спре синтезата на нова верига (летално за клетката), а другият да се опита да реплицира участъка с цената на грешно свързани нуклеотиди. В процеса на еволюцията в клетките са се развили специфичен тип полимеразни (Y полимерази) ензими способни да реплицират увредени ДНК молекули. Тези полимерази въпреки, че са матрично зависими при достигане на увреден участък, където веригата е „интактна“ започват да включват нуклеотиди независимо от това дали са комплементарни на матрицата или не. Вследствие на това случайно свързване на нуклеотиди в ДНК възникват нови мутации, но биологично това е по-благоприятно, отколкото клетката да загине. Затова при нормални условия гените кодиращи Y полимеразите не са експресирани, но се активират при установяване на увреждания в ДНК неотстранени преди нейната репликация.

ДНК-полимеразите притежават изключително голяма точност, на което се дължи и изключително високата точност на процеса репликация. Въпреки това понякога се случва полимеразата да свърже некомплементарни нуклеотиди. Теоретически са възможни 12 такива неправилни сдоявания (Т-Т, Т-С, Т-G и т. н.), които ако не се поправят след следващите цикли на репликация се закрепват в потомството на делящата се клетка като трайни точкови мутации. В клетката са развити много сложни механизми на пострепликационна репарация, които имат свойството бързо да открият погрешно свързаните нуклеотиди и способността да установят кой от двата срещуположни нуклеотида е погрешно свързаният. Тъй като едноклетъчните организми са по-просто устроени бихме могли да дадем пример за такава репарация при бактерията E.coli. При тази бактерия репарацията на погрешно свързаните нуклеотиди се извършва от белтъците MutS, MutL и MutH. След срязването на погрешно присъединеният нуклеотид се включва хеликазата UvrD, която отстранява некомплементарният фрагмент. Впоследствие ДНК-полимеразата и лигазата и възстановяват отстраненият участък чрез присъединяване на комплементарни вериги. Как обаче се установява коя от двете вериги е новата, притежаваща неправилно свързани нуклеотиди? При бактерията, чиито механизми описваме се наблюдава ензим наречен Метилаза Dam. Този ензим има свойството да метилира участъци в двете вериги притежаващи последователността 5’-GATC-3’. Тази малка 4 нуклеотидна последователност се среща доста често в генома на бактерията. Именно тук се крие и отговорът на поставеният въпрос – за кратък период от време новосинтезираните вериги остават неметилирани, което подсказва на Mut белтъците коя е новата верига и къде да насочат действията си. Подобни механизми са описани и при еукариотните организми, но поради изключителната сложност на техният геном те са изключително голяма рядкост.

В звисимост от посоката и силата на действие на мутиралият ген Херман Мюлер разделя мутациите на следните категории:

1. 
   Аморфни, Ултраморфни и Олигоморфни
   
2. 
   Аморфни, Хипоморфни, Хиперморфни, Антиморфни и Неоморфни
   
3. 
   Полезни и вредни
   
4. 
   Трайни и нетрайни
   
5. 
   Миссенс и Нонсенс
   

1. 
   Транзиция
   
2. 
   Трансверзия
   
3. 
   Микроделеция
   
4. 
   Инверсия
   
5. 
   Транспозиция
   

1. 
   Аморфни, Ултраморфни и Олигоморфни
   
2. 
   Аморфни, Хипоморфни, Хиперморфни, Антиморфни и Неоморфни
   
3. 
   Полезни и вредни
   
4. 
   Трайни и нетрайни
   
5. 
   Миссенс и Нонсенс
   

1. 
   Ултравиолетовите лъчения
   
2. 
   Йонизиращите лъчения
   
3. 
   Всички са верни
   
4. 
   Нито едно от посочените
   

1. 
   Метод за изследване на ДНК отпечатъци
   
2. 
   Метод за репарация на молекулата на ДНК
   
3. 
   Метод за откриване на мутации в ДНК
   
4. 
   Метод за денатураиране на ДНК
   

8. 
   РЕПЛИКАЦИЯ НА ДНК
   

1. 
   Принцип на репликацията
   

• 
  Консервативен – предполага се, че след разделянето на двойната верига всяка от веригите служи като матрица за синтез на нова верига. В края на процеса получените две двойни вериги се разделят като изходните „матрици се съединяват (сглобяват) и възвръщат изходната „майчина“ верига. От друга страна двете нови копия също се съединяват на принципа на комплементарността и оформят изцяло нова дъщерна верига ДНК. Този механизъм е бил първоначална хипотеза, но в последствие е бил отхвърлен.
  
• 
  Полуконсервативен – след разделянето на родителската верига двете едноверижни молекули служат като матрица за синтез на нова комплементарна верига ДНК. След края на процеса се образуват две двойноверижни молекули, всяка от които съдържа една родителска и една дъщерна верига ДНК. След огромен брой експерименти е доказано, че репликацията на ДНК се извършва именно по полуконсервативният механизъм. Предполага се, че еволюционно клетката е предпочела този начин на репликация, тъй като той не изисква допълнително разделяне на веригите и прегрупирането им.
  

Молекулата на ДНК се среща в две основни форми:

• 
  Линейна – при еукариотите.
  
• 
  Кръгова – при бактериите, някои фаги и вируси, плазмидите и др.