Пространствена организация на ДНК и ензими, участващи в нейното поддържане

Предложените две форми на ДНК са идеализиран модел. В природата молекулите на ДНК нямат такива идеални форми. За да се поберат тези дълги молекули в клетките те се намират в така наречената суперспирализирана форма. Това важи както за кръговите така и за линейните форми на ДНК. Суперспирализацията на ДНК се осъществява посредством допълнителното завъртане (надясно) на двете дяснозавити вериги. При това допълнително завъртане около собствената си ос всяка кръгова молекула ДНК придобива линейна форма. Следователно наблюдавайки суперспирализирани молекули не бихме могли да предвидим тяхната форма.

В процеса на репликацията двете вериги се разделят за да послужат като матрици за синтез на нови ДНК копия. При разделянето им обаче се намесват ензимите на суперспирализацията. Нормално ДНК е дяснозавита молекула в първите моменти се предизвиква отрицателна суперспирализация, което води до релаксиране на молекулата. В последствие спирализацията се задълбочава и се достига до момент, при който молекулата е толкова свръхспирализирана, че репликативната вилка се блокира. В този момент се намесват топоизомеразите и предизвикват отрицателна спирализация (наляво). По този начин молекулата придобива отново линейна форма и репликацията продължава.

Репликацията е ензимен процес осъществяван от ензими наричани ДНК зависими ДНК-полимерази. Те изграждат ковалентна 5’,3’-фофодиестерна връзка между отделните нуклеотиди, следейки за правилното комплементарно свързване спрямо изходната матрица. Субстрат и енергиен източник на процеса се явяват свободните нуклеозидтрифосфати в клетката.

Репликацията на ДНК винаги протича в посока от 5‘ края на веригата към нейният 3‘ край, поради което в клетката не се откриват ензими които имат способността да присъединяват нуклеотиди в обратната посока.
Синтезата на ДНК винаги протича в поска 5’>3’, т. е. това е посоката на нарастване на ново-ситезиращата се верига:

Двете вериги на ДНК са антипаралелни, т.е. ако едната верига завършва с 5‘край, то комплементарната на нея ще завършва с 3‘ край от същата страна. Изхождайки от правилото, че ДНК се синтезира в посока от 5‘ към 3‘ края на веригата бихме могли да си зададем въпроса: В каква посока нарастват двете вериги в репликативната вилка? Ако се придържаме към правилото за синтезата на ДНК това би било невъзможно? Отговорът на този въпрос се крие в един интересен феномен. Както по-горе описахме репликацията на ДНК се стартира от няколко начала като в последствие всяко начало се превръща в отделен репликон. Установено е, че репликацията на едната верига започва и протича от едно начало (без прекъсване), защото тя притежава 5‘ край, от който процесът може да започне. Тази верига се отбелязва като водеща. Комплементарната верига обаче завършва с 3‘ край и процесът не може да започне от този край. При тази верига се наблюдават много точки на инициация (начала), от които започва синтезата на комплементарни малки вериги ДНК с посока от 5‘ към 3‘. Отделните фрагменти, при които се синтезират нови комплементарни вериги са наречени на името на техният откривател – фрагменти на Оказаки. Тъй като процесът при тази верига се извършва по-бавно в сравнение с водещата тя е наречена изоставаща верига. При удължаването на всеки отделен фрагмент рано или късно се застига друга начална точка (друг фрагмент). Свързването между двата фрагмента на Оказаки се извършва с помощта на лигазите. Тези ензими изграждат ковалентна връзка между хидроксилната група на 3‘ края на единият фрагмент и 5‘фосфатната група от началото на следващият фрагмент. По този начин в края на процеса и двете дъщерни вериги придобиват цялостен (нефрагментиран) вид.

В процеса на репликацията участие вземат няколко групи ензими. Както вече посочихме топоизомеразите намаляват напрежението пред репликативната вилка, а ДНК и РНК полимеразите присъединяват свободните нуклеозидтрифосфати към новосинтезиращата се верига. Участие в репликацията вземат и две други групи белтъци:

• 
  Хеликази – спомагат за по-бързото разрушаване на водородните връзки между двете вериги на майчината верига ДНК. Те имат свойството да се свързват с едноверижните участъци в началото на репликативната вилка и използвайки енергията от аденозинтрифосфатите (АТФ) разрушават водородните връзки между двете вериги на ДНК. При бактерията E. coli са открити две хеликази. Едната се свързва към изоставащата верига и се движи в същата посока по която тече репликацията (5‘-3‘). Другата хеликаза (Rep-белтък) се свързва към водещата верига и се движи в посока обратна на посоката на репликацията (3’>5’)
  
• 
  Белтъци, свързващи едноверижна ДНК – имат свойството да покриват „оголените“ едноверижни участъци от ДНК (под действието на хеликазите), като по този начин предотвратяват обратното им свързване. Тези белтъци при E.coli са изградени от 177 аминокиселини и покриват участък от 32 нуклеотида от ДНК. Характерно за тях е, че при свързването на такъв белтък в един участък инициира свързването на белтъците и със съседни участъци. Това явление е описано като кооперативно свързване.
  

Както вече описахме, в началото на процеса репликазия се намесва ензимът РНК полимераза, който синтезира къси вериги от РНК (праймър). Тези вериги се захващат за началата разположени по ДНК веригата и ензимът ДНК полимераза започва да синтезира нова верига. Поради различията им с РНК полимеразите, участващи при транскрипцията на гените РНК полимеразите, синтезиращи праймър се означават с името примази. При бактерията Е. coli примазата представлява полипептид, активиращ се само в присъствието на няколко други полипептида. Комплексът от примазата и допълнителните белтъчини се означава като примозома. Примозомата изпълнява следните функции:

1. 
   Разпознава точките на инициация по дължината на ДНК веригата.
   
2. 
   Полимеризация на рибонуклеотиди и превръщането им в праймър.
   
3. 
   Изместване на покривните белтъчини от едноверижните ДНК вериги.
   
4. 
   Придвижване по дължината на репликативната вилка.
   

Бихме могли да кажем, че всички описани до момента ензими имат спомагателна роля в процеса на репликацията. Същинско значение за репликацията имат ДНК-полимеразите. При бактерията Е. coli се откриват три вида ДНК полимерази – ДНК полимераз I, ДНК полимераза II и ДНК полимераза III. Както вече се запознахме всички ДНК полимерази имат свойството да синтезират нови ДНК вериги, но изискват наличието на ДНК или РНК олигонуклеотиди (праймър) от които да стартират. Най-важна роля при репликацията играят ензимите ДНК полимераза I и III. Ензимът ДНК полимераза III е отговорен за синтезата на ДНК, както във водещата верига, така и във фрагментите на Оказаки. За да изпълнява тази си функция той притежава 5’>3’ активност. Установена е и така наречената редактираща активност на този ензим, изразяваща се в отстраняване на погрешно включени нуклеотиди. Тази функция (екзонуклеазна активност) се обуславя от 3’>5’ активността на ензима, което му позволява да замества неправилно включените нуклеотиди при синтезата на ДНК. Въпреки сравнително малкият брой на допусканите грешки при репликацията редакционната способност на ДНК полимераза III дава допълнителна точност на процеса. ДНК полимераза III е изградена от десет различни полипептидни вериги. Основната част от тях съставят така нареченият кор ензим съставен от три субединици. Едната субединица притежава 5’>3’ екзонуклеазна и полимеразна активност. Редактиращата способност на ензима се определя от определя от друга субединица на кор ензима, притежаваща 3’>5’ екзонуклеазна активност. Описаният ензим се открива в около 20 копия в клетката като при започване на репликацията той се закрепва за верига ДНК и не се отделя от нея докато не достигне краят и.

Функциите на ДНК полимераза I са основни три:

- Разграждане на праймъра от който започва репликацията, използвайки 5’>3’-екзонуклеазната си активност.

- Запълване на образуваната празнина (от отстраненият праймър) с комплементарни нуклеотиди. При този процес ензима използва 5’>3’-полимеризиращата си активност и добавя нуклеотиди към 3’-ОН-края на предходния фрагмент на Оказаки.

- Проверява и отстранява погрешно включените нуклеотиди (дублира функцията на ДНК полимераза III).

Този ензим се намира в по големи количества в клетката (400 копия) като освен при репликацията участва и в процесите на репарация и рекомбинация на ДНК.

След запълването на празнината от отстранения праймър и доближаването на двата фрагмента на Оказаки двата края се свързват в една обща верига. Свързването на крайщата на два съседни фрагмента се извършва от ензима ДНК лигаза, която образува ковалентна връзка между 3’-ОН-края на единия фрагмент на Оказаки и 5’-Ф-края на следващия.

Комплексът от всички белтъчини, вземащи участие в процесът на репликацията се обозначават с общото име реплизома.
Етапи на репликацията

Репликацията на ДНК може да бъде разделена на три основни етапа:

1. Инициация

Както вече описахме началото на репликацията при водещата верига започва от едно място, докато при изоставащата верига от няколко места, които в последствие формират фрагментите на Оказаки. Практически точките на инициация са местата в които се формират репликативните вилки. При прокариотните организми генома най-често е съсредоточен в една кръгова молекула ДНК и при тях точката на инициация е една. От тази точка в двете посоки се оформят по една репликативна вилка. При E. coli началото на репликацията е участък съставен от 245 нуклеотидни двойки. Предполага се, че тези нуклеотиди се разпознават от ензимите и белтъците участващи в инициацията на репликацията в следствие на което процесът стартира. Такива белтъчини са: dna A; dnaC-polD, dnaH, dnaI и dnaP. Решаващо значение за инициацията има формирането на репликативната вилка и започването на синтезата на водещата верига. На по-късен етап стартира и синтезата на изоставащата верига. Първоначално се синтезират къси РНК вериги, които служат като праймър за водещите вериги.

2. Елонгация

Удължаването на полинуклеотидната верига се регулира от всички описани в предходният раздел ензими. Разкъсването на водородните връзки се осъществява от ензима хеликаза, след което покриващите белтъчини покриват едноверижните разклонения за да ги предпазят от ендонуклеазите в клетката. В последствие синтезата на веригата се извършва от ензима ДНК полимераза III, който измества праймъра и започва да присъединява нуклеотиди комплементарни на майчината верига. На по-късен етап ензимът ДНК полимераза I запълва празното пространство образувано от отстраненият праймър и заменя неправилно включените нуклеотиди, а ДНК лигазата свързва крайщата на двата съседни фрагмента на Оказаки. Така първоначално разделената нова верига придобива завършен вид.

3. Терминация

Въпреки мащабните проучвания все още не са установени специфични ДНК последователности, които да провокират спирането на репликацията. Експериментално това е доказано посредством отстраняване на участъците ДНК (при кръгова ДНК репликативните вилки се срещат на 180° от началото на репликацията), в които нормално се срещат двете срещуположни репликативни вилки. Подобни делеции не възпрепятстват терминацията на репликацията.

В зависимост от морфологията на молекулата, която ще се удвоява съществуват следните типове репликация:

1. Репликация тип Око (тета репликация)

Тази репликация се извършва при линейни молекули ДНК. Точката на инициация е приблизително в средата на молекулата, при което се разплита двойната спирала и в двете посоки започват да се синтезират нови ДНК вериги. Както вече описахме при започването на репликацията двете вериги не се разплитат изцяло, а само в участъкът на инициацията. При синтезата на нови вериги в двете посоки се образува структура, при която в двата края се намират все още неразплетените майчини вериги, а в средата се откриват две двойноверижни молекули, при които процесът вече е протекъл. Тази структура може да се наблюдава под електронен микроскоп и се нарича „Око“. При продължаването на процеса големината на получилият се мехур нараства и постепенно се приближава към двата края на майчината верига. Тъй като точката на инициация не е точно в средата на веригата мехурът достига по-бързо единият край на веригата отколкото другия. При наблюдение под микроскоп се вижда Y-подобна структура. При продължаването на процеса към другият край на веригата малко по-късно се наблюдава V-подобна структура. При приключването на репликацията от линейната родителска верига се получават две двойноверижни дъщерни молекули, всяка носеща по една родителска и една новосинтезирана молекула.

2. Репликация тип Търкалящ се пръстен (сигма репликация, rolling circle)

Този тип репликация е свойствен за пръстеновидните ДНК молекули. Процесът стартира с разкъсването на фосфодиестерните връзки в определен участък от едната верига. Такава едноверижна дупчица на мястото на една фосфодиестерна връзка се означава като ник (nick) и води до образуването на 3’OH и 5’PO₄ краища в тази верига. Другата верига запазва пръстеновидната си форма. Към 3’OH края на срязаната верига се захваща ензимът ДНК-полимераза и започва да удължава веригата като избутва 5’PO₄ навън. Върху избутаният край на веригата веднага се прилепват покриващите белтъчини за да го предпазят от ендонуклеазите в клетката. Към избутаният 5‘ край се захваща друга молекула ДНК полимераза, която започва да изгражда нова верига в посока 5‘>3‘. Освободената едноверижна опашка се реплицира по известния механизъм чрез образуването на фрагменти на Оказаки, а водещата верига се синтезира върху интактната кръгова матрица и непрекъснато доставя матрицата на изоставащата верига. При постепенното нарастване на веригите се получава σ-подобна структура откъдето този тип репликация носи и името си. При завършването на репликацията се образуват две двойноверижни дъщерни вериги, едната с кръгова форма, а другата с линейна. Този тип репликация е характерен за някои бактериофаги и вируси.

3. Репрликация тип D-бримка

Геномите на органелите имат интересна особеност: двете вериги на тяхната ДНК имат различни и неравностойни начала на репликация. Репликацията при тях се извършва по специфичен начин известен като D-бримка. Синтезата на нови молекули ДНК стартира от веригата, съдържаща по-активното начало като новосинтезираната ДНК молекула измества старата допълнителна верига. процесът би могъл да се оприличи на репликация тип търкалящ се пръстен, но тук двете вериги запазват кръговата си форма. Друга отличителна черта на репликацията тип D-бримка е, че в изоставащата верига не се образуват фрагменти на Оказаки, а процесът ротича без прекъсвания.

4. Репликация на едноверижни кръгови геноми

Наследствената информация на някои бактериофаги е разположена в едноверижна кръгова ДНК молекула. След навлизането им в бактериалната клетка едноверижната фагова ДНК почти изцяло се покрива с покривни белтъчини. Непокрита остава само една малка част, където се синтезира РНК праймър необходим за започване на репликацията. Процесът продължава със синтез на нова верига (ензим ДНК полимераза III), отстраняване на РНК праймъра (ДНК полимераза I) и формиране на ковалентна връзка между двата края на новосинтезираната верига (ДНК лигаза). Получената двойноверижна кръгова молекула се обозначава като репликативна форма. От тук на татък процесът продължава по вече описаният механизъм на въртящото се колело.

5. Еднопосочна репликация на двойноверижни линейни фагови геноми без използването на РНК-праймери

Геномът на някои бактериофаги е базиран на линейни двойноверижни ДНК молекули и репликацията при тях протича без използването на РНК праймер. Репликацията при тях започва в единият край (независимо кой) на линейната молекула и се реплицира само едната верига. При синтезирането на молекулата тя постепенно избутва едната родителска верига. Краищата на избутаната едноверижна молекула взаимодействат и формират структура подобна на фуркет (стебло и бримка). В двойноверижният участък на фуркета се захваща друга ДНК полимераза III и започва синтезата на комплементарна верига. При преминаването на ензима по дължината на фуркета той се разрушава и на края на процеса се образува ново копие двойноверижна линейна ДНК.

Механизмът за репликация на ДНК се означава като:

1. 
   Консервативен
   
2. 
   Полуконсервативен
   
3. 
   Уникален
   
4. 
   Специфичен
   

1. 
   Разкъсване на една от двете вериги на ДНК
   
2. 
   Разкъсват и двете вериги на ДНК
   
3. 
   Разкъсват хромозомите при деленето на клетката
   
4. 
   Разкъсват ядрената мембрана
   

1. 
   5’>3’
   
2. 
   3’>5’
   
3. 
   И в двете посоки
   
4. 
   Друго (моля посочете)
   

1. 
   Разпознава точките на инициация по дължината на ДНК веригата.
   
2. 
   Полимеризация на рибонуклеотиди и превръщането им в праймър.
   
3. 
   Изместване на покривните белтъчини от едноверижните ДНК вериги.
   
4. 
   Придвижване по дължината на репликативната вилка.
   
5. 
   Всички посочени отговори
   
6. 
   Нито един от посочените отговори
   

В зависимост от морфологията на молекулата която ще се удвоява, репликацията може да бъде (верните отговори са повече от един):

1. 
   Тета репликация
   
2. 
   Търкалящ се пръстен
   
3. 
   Д-бримка
   
4. 
   Права репликация
   
5. 
   Обратна репликация
   

8. 
   Рибонуклеинова киселина – РНК
   

ДНК >>>> РНК >>>> белтък.

1. 
   Информационна РНК – бележи се като иРНК или мРНК (матрична РНК). Отговаря за копирането и пренасянето на наследствената информация до рибозомите. Информационната РНК молекула е едноверижна и е изградена от последователното подреждане на 4 нуклеотида (Аденин, Гуанин, Цитозин и Урацил) във всички възможни комбинации. Тъй като аминокиселините съставящи белтъците са общо 20 на брой, то кодирането на определена аминокиселина не може да се базира на един нуклеотид. Установено е, че група от три последователно подредени нуклеотида кодират местоположението на дадена аминокиселина в полипептидната верига. Такива три нуклеотида, кодиращи местоположението на дадена аминокиселина в в ППВ се наричат кодон (триплет). Броят на възможните кодони е 4³ – 64, което показва, че някои аминокиселини се кодират само от един триплет (метионин и триптофан), докато други се кодират от няколко (аргинин, левцин и др.). Доказано е, че от възможните 64 кодона, 61 кодират определена аминокиселина, а три от кодоните са безмислени. Безмислените кодони служат като маркер на веригата за спиране на транслацията. Такива кодони са УАА, УГА и УАГ. С изключение на кодоните при митохондриите и някои протозои генетичният код е универсален за всички живи организми на нашата планета, което потвърждава неговата прецизност и точност. Количеството на иРНК в клетката е около 5% от общото количество РНК. Обикновено иРНК се намират в твърде малки количества и имат кратко време на полуживот.
   
2. 
   Транспортна РНК – бележи се като тРНК. Количеството на тРНК в клетките е около 15% от общото количество РНК в клетката. Характерно за тях е, че не са прикрепени към клетъчни структури, а се движат свободно в цитоплазмата – разтворими РНК. Тези РНК молекули отговарят за пренасянето на различните аминокиселини до рибозомите и дешифрирането на кода носен от информационната РНК. Транспортните РНК молекули са сравнително къси вериги изградено от около 70-80 нуклеотида с молекулна маса между 25000 и 30000. Всяка аминокиселина им една или няколко тРНК, които я свързват и пренасят до растящият край на полипептидната верига в рибозомите. Функцията на тРНК молекулите зависи от тяхната пространствена структура. Въпреки, че са едноверижни молекули някои от участъците им са комплементарни едни на други, вследствие на което веригата се огъва и свързва на определени места. Получената структура притежава няколко двойноверижни участъка и няколко бримки (изградени от некомплементарни участъци). Така описаната вторична сруктура на тРНК може да се оприличи на четирилистна детелина. Долепените два края на веригата образуват своеобразно стъбло от което стърчат двата края (3’ и 5’ ) на веригата. Установено е, че при 5‘ края всички тРНК завършват с гуанин, а на своят 3‘ край притежават последователността ЦЦА добавена след приключването на синтезата и процесинга на тРНК. Именно този участък е отговорен за свързването на определена аминокиселина – акцепторен край. Той включва нуклеотидната последователност ЦЦА, завършваща със свободна 3‘-ОН група на аденозина. Към тази група аминоацил-тРНК-синтетазите присъединяват остатъците на аминокиселини, след което образуваните комплекси се транспортират към рибозомите за участие в белтъчната синтеза. Образуваните четири бримки също имат специфични функции.
   
   1. 
      Тимидиновата бримка (Т-бримка) отговаря за свързването на тРНК с рибозомата. Включва 7 нуклеотида, между които задължително и псевдоуридилова киселина.
      
   2. 
      Вариабилна бримка – функцията и все още не е изяснена.
      
   3. 
      Антикодонова бримка – в средата и е разположен антикодонът съставен от три нуклеотида с точно определена последователност. На принципът на комплементарността кодонът на иРНК се свързва с антикодонът на тРНК, при което носената от тРНК аминокиселина се включва в нарастващата полипептидна верига. По този начин се определя мястото на всяка аминокиселина в процеса на белтъчната синтеза (адапторна роля на тРНК).
      
   4. 
      Дехидроуридинова бримка (Д-бримка) – открива се от активиращият аминокиселината ензим и взема участие в свързването на аминокиселината със специфичната за нея тРНК.
      
3. 
   Рибозомна РНК – бележи се като рРНК. Този тип РНК молекули имат скелетна функция за рибозомите. Асоциирайки се със съответните протеини рРНК формира рибозомите. Те са изградени от малка (30S) и голяма (50S) субединица. В малката субединица има само една малка рРНК молекула, а в голямата една голяма и една или няколко по-малки. Тези комплексни структури се движат по иРНК като катализират свързването на аминокиселините в полипептидна верига. Те също свързват тРНК и други молекули нужни за синтезата на белтъци. Първичната нуклеотидна последователност на всеки тип рРНК варира, поради което те могат да формират различни стъбло-бримка структури с различна пространствена структура. Количеството на рРНК в клетките съставлява около 80% от общото количество РНК в клетките.