Молекулярно-биологичен анализ на суровини и храни доказване на ДНК от хранителни продукти, дрожди, E. coli или човек

Доказване на екстрахирана ДНК;

От всеки от източниците на ДНК се взема проба чрез стерилен памучен тампон. С тампона се обтрива изследваната повърхност, като целта е да се получи максимално количество от клетъчната проба. В микро епруветка от 1,5 ml тип Епендорф се поставя 0,5  ml екстрахиращ разтвор. Епруветката се надписва с номер и дата. Тампона се потапя до дъното на епруветката и се въртеливи движения се размива пробата в разтвора. Получава се мътнина от разтворените клетки, което е изходната клетъчна суспензия.

Клетъчната суспензия в микроепруветките се използва за Екстрахиране на ДНК по следния метод:

1. 
   поставяне на микроепруветките в ямките на плуващ статив
   
2. 
   поставяне на статива на кипяща водна баня за 15 минути за клетъчен лизис
   
3. 
   центофугиране при 14 000 rpm^-1 за 10 минути за утаяване на клетъчните стени и други частици
   
4. 
   от супернатанта съдържаща разтворената ДНК се прехвърлят 100 μl в микро епруветка от 200μl тип Епендорф
   

1. 
   Приготвяне на агарозен гел с концентрация 1% и добавка на ДНК оцветител (етидиев бромид)
   
2. 
   Сглобяване на камерата за изливане на гел-форма с 16 ямки
   
3. 
   Изливане на гел-формата и охлаждане за 30 минути
   
4. 
   Заливане на формата с буферен разтвор за електрофореза
   
5. 
   Поставяне на 10 μl от екстрахираната ДНК с GelLoading разтвор във всяка от 16-те ямки на гела
   
6. 
   Настройване на апарата за екелтрофореза90V, 90A за 30 минути
   
7. 
   Включване на апарата и провеждане на изследването
   
8. 
   Фотоснимка на ДНК при UV-светлина в камера за видим образ
   

1. 
   отделяне само на епруветките с положителни резултати за ДНК
   
2. 
   приготвяне на реактив “PCR-mix” в 16 обема (всеки по 2μl) в обща микро епруветка от 1,5 ml тип Епендорф.
   

3. 
   нареждане на 16 микроепруветки от 200 μl тип Епендорф на микростатив
   
4. 
   добавяне на 1 μl отДНК екстракта към всеки обем в отделна епруветка
   
5. 
   поставяне на всички микроепруветки в PCR апарат (термосайклър)
   
6. 
   програмиране на PCR апарата за ампилификация при следните условия:
   

94°С 94°С 60°С 72°С 72°С 4°С

3` 1` 1.5` 1.5` 7` ∞

6. 
   след края на програмата се провежда гел-електрофореза в 1,5% агарозен гел, при 120V, 90A за 40 минути.
   

1. 
   снимка на гел с ДНК при UV-светлина
   
2. 
   маркировка на всяка ямка в гела
   
3. 
   отчитане големината на ДНК фрагмента (амплификата)
   
4. 
   написване на лабораторен протокол с резултатите
   

М – маркер ледер 100 bp.

1 – Л. Кръстева - епит. кл.

2 – М. Димитрова - епит. кл

3 – Д. Белче - дрожди

4 – А. Коджаманов – Е.coli

5 – Е. Стоянова - Е.coli

6 – Ю. Кунева - епит. кл.

7 – М. Каттос - Е.coli

8 - Н. Дурхан - дрожди

9 – Д. Сотирова - Е.coli

10 – Д. Василева - епит. кл.

11 – Д. Даскалова - епит. кл.

12 – Ганчо Чаков - епит . кл.

При всички проби се отчита наличие на екстрахирана ДНК. Маркерната рулетка (М) е с големина по-малка от тази на екстрахираната ДНК от пробите.

Каталог: truni6 -> wp-content -> uploads -> vmf -> file
file -> Доказване на ДНК от дрожди, E. coli или човек чрез pcr и гел-електрофореза
file -> Ветеринарномедицински факултет стара загора Правилник
file -> Акушерство, гинекология и андрология
file -> Доклад за живота и творчеството му от Декана на вмф проф. М. Люцканов зала №6
file -> Програма " ветеринарна администрация"
file -> С п и с ъ к на студентите по ветеринарна медицина v-ти курс, 1 група, учебна 2016/2017година
file -> С п и с ъ к на студентите по ветеринарна медицина vi-ти курс, 1 група, учебна 2017/2018година
file -> Списък на студентите от ІV курс, които ще проведат клиничния си стаж в клиниката на вмф

Изтегляне 52.52 Kb.

Сподели с приятели: