На дисертационния труд

върху дисертационен труд, представен пред научно жури, сформирано със заповед № I-148/18.10.2013 на директора на Институт по микробиология “Стефан Ангелов”, БАН за получаване за получаване на научна степен “доктор на биологичните науки”

Именно към тези аспекти на големия проблем за биоразнообразието на термофилите и термостабилните биологично-активни вещества насочва вниманието д-р Камбурова. Това подчертава актуалността и перспективността на представения дисертационен труд. Още повече, че дисертацията на кандидатката е част от пионерните изследвания за България и нейните горещи извори. Преценката за актуалността произтича главно от основната насоченост на разработката – получаване на нови знания в теоретичен и приложен аспект относно биоразнообразието на бактерии и археи в българските горещи извори и техният капацитет като продуценти на ценни ензими и екзополизахариди. Трябва да се отбележи и факта, че в литературата все по-често се срещат обобщаващи изследвания за отделни региони или държави и трудът на Камбурова идва да присъедини българските горещи извори към световната база данни. Актуалната насоченост на дисертационния труд се вписва много точно в основните приоритети на страната и Европа, каквито са екологията и биотехнологията.

Изборът на темата и начинът на разработване показват голямата ерудиция на д-р Камбурова в областта на термофилните прокариоти. Отличното познаване на проблема и на възможностите на съвременните методи за навлизане в нерешените въпроси, й позволяват да намери обединяващия елемент в едно мащабно изследване. Компетентността на автора проличава още от увода, който подчертава новата роля на микробиологичните изследвания в посочените по-горе актуални научни направления, аргументирано доказва основанията за написването на дисертационния труд и дори включва постиженията на колегите. Тази компетентност е основната характеристика и на литературния обзор, изготвен целенасочено и конкретно, с творческо използване на литературните данни. Обзорът представлява възможно най-пълно представяне на съвременното състояние на проблема като включва значението на такъв род изследвания в исторически аспект и до сега – 21 век. Изграден е основно върху научната информация от последните години. Разделен е на отделни части, съответстващи на разработваните в дисертацията аспекти. Цитирани са 508 литературни източници на латиница. Обзорът също носи белег на актуалност, тъй като над 65% (330) от статиите са от последните 10 години, а над 30% (160) от всички са от последните 4-5 години. Прави впечатление отговорността на учения към проучване на българските горещи извори, личният поглед на автора към биологията и екологията на термофилните микроорганизми, към адаптационните стратегии, използвани от тях и важността на термостабилните ензими и екзополизахариди.

Въз основа на активния анализ на отразените данни, авторът извежда целта на дисертационния труд, която включва проучване на микробното разнообразие на неизследваните български горещи извори с класически и съвременни методи, както и биосинтетичния капацитет на оригинално изолирани термофилни бактерии да синтезират екзополизахариди и термостабилни ензими от различни класове. За реализиране на целта са формулирани десет конкретни, взаимно обвързани и логически следващи задачи, които очертават мащабният характер на дисертационния труд.

Следващият раздел „Материали и методи” предоставя на читателя внушителен набор от подходи и методи, съобразени с конкретните изисквания на съответната задача. Налага се впечатлението, че всички експерименти са обмислени професионално, без пренебрегване на детайлите. Тук се включват както класически, така и най-съвременни микробиологични, биохимични, генетични, молекулярно биологични и биотехнологични методи. Те са разбираеми и дават възможност за коректно провеждане на експериментите и получаване на достоверни резултати. Искам да подчертая метагеномния подход, амплификацията на 16S рРНК и конструиране на клонови библиотеки, амплификацията 16S рДНК и идентификацията на коректни клонове, РСR и RAPD-PCR, секвениране и филогенетичен анализ, ДНК-ДНК хибридизация, анализи на аминокиселинния състав на ензими, различни видове електрофоретични и хроматографски анализи, създаване на имобилизирани системи от клетки и ензими и много други. Методите са описани прецизно, без излишни подробности, но достатъчно пълно, за да бъдат възпроизведени.

Разделът „Резултати и дискусия” е много внушителен, обхваща 150 страници, богато илюстрирани с доказателствен материал и дискутиран на базата на съществуващите в литературата данни. Всеки подраздел започва с подходящ преамбюл, който въвежда читателя в работата и обосновава неговата актуалност. Д-р Камбурова използва за своите изследвания проби от 35 горещи извора в България, като 3 от тях са проучени с методите на метагеномиката. Това изследване е мащабно и пионерно, което вече е предпоставка за оригинални приноси. Започва с характеристика на местообитанията и след това с молекулно-биологични методи и филогенетични анализи доказва богатството на българските извори по отношение на термофилни бактерии и археи. Тук трябва да се подчертае подхода на Камбурова да сравни тези резултати с данните за горещи извори в различни географски региони. Това от своя страна й позволява да намери мястото на нашите извори в световното богатство от термофили и да даде своя принос в подкрепа на космополитната хипотеза за разпространението на биологичните видове. Много важен момент в дисертацията е доказването на нови Кандидат бактериални типове, непознати археални групи и нови бактериални видове, признати от Международната комисия по систематика на прокариоти и включени в последното издание на Бърджи. Този кратък анализ на подраздел 1 и подраздел 2 се основава на огромен брой експерименти, конструиране на клонови библиотеки, електронно микроскопски снимки, перфектно изработени гел-електрофорези, секвениране и позициониране на нови видове във филогенетичното дърво, изработване на паспорти на нови видове и умело интерпретиране на резултатите.

Не по-малко мащабна работа е включена в подраздел 3 „Синтетичен потенциал на култивируеми термофилни бактерии, изолирани от български горещи извори”. Изолирани са оригинални продуценти на 12 типа въглехидрат разграждащи ензими. Следват детайлно и цялостно разработени задачи за получаване на термостабилните ензими гелан лиаза, ксиланаза, инулиназа, пулуланаза, липаза и екзополизахариди – от изолиране на ефективен продуцент, през оптимизиране на условията за биосинтеза, пречистване и охарактеризиране на продукта до получаване на кристални форми, както и имобилизиране на клетки и ензими. Логичен завършек на всяка отделна разработка са експериментите за определяне продуктите на ензимното действие с пречистени ензими и полизахариди. По този начин авторът предоставя готови лабораторни методи за получаването на ценни за биотехнологичната индустрия ензими, които в повечето случаи са единствени в световен мащаб по термостабилност и ефективност. Едновременно с това е създаден метод за синтезата на уникални по своите свойства полизахариди с висока молекулна маса, значителна стабилност и биологична активност спрямо цитотоксини, което ги очертава като перспективни за фармацевтичната индустрия.

С това кръгът на изследвания се затваря. На лице е една завършена научна разработка, която демонстрира целенасочените усилия на автора да обобщи проучванията върху един неизследван проблем с ясно изразена научна стойност и приложно звучене.

Към достойнствата на дисертацията трябва да се добави и умението на автора да отразява извършеното много ясно и коректно, да обсъжда получените резултати на фона на постигнатото от други автори. Дискусията е убедителна, на базата на съвременни данни. Това, разбира се, е възможно благодарение на много доброто познаване на проблема и задълбочената научна разработка. Много добра идея е в края на дисертационния труд да бъде представен подраздел „Заключение”. Той е общение на най-важните резултати, което улеснява читателя при възприемане на постиженията на разработката.

Искам със задоволство да подчертая също много доброто оформление на дисертацията, стегнатия научен стил, на който е написана, коректното отразяване на резултатите във фигури и таблици, както и тяхното професионално представяне. В дисертационния труд са включени 85 фигури и 43 таблици. Изводите са логично следствие от експерименталните данни и дават необходимата информация за стойността на проведените изследвания.

Искам да подчертая, че всички направени от мен забележки на апробацията са взети пред вид. В порядъка на препоръка, предлагам на д-р Камбурова да оформи материала в монография. Като имам пред вид обхвата на проблема и прецизността на изпълнението, подобно издание ще бъде полезно за широк кръг специалисти.

В резултат на извършените изследвания се оформят сериозни теоретични и приложни приноси. По мое мнение, д-р Камбурова ги е формулира много ясна и точно в представената справка. По-важните от тях са следните:

1. 
   Получени са нови данни, подкрепящи „космополитната хипотеза” за разпространението на видовете във Вселената.
   
2. 
   За първи път е охарактеризирано бактериалното и археално разнообразие в български горещи извори.
   
3. 
   Доказана е изключително високата степен на разнообразие на термофилни бактерии и археи в 35 български горещи извори, което ги характеризира като най-богатите на филотипове и археални групи извори в света.
   
4. 
   Идентифицирани са непознати бактериални и археални групи.
   
5. 
   Изолирани и дентифицирани като нови видове са два бактериални вида Anoxybacillus rupiensis и A. bogroviensis, които са признати от Международната комисия по систематика на прокариоти и са включени в последното издание на Бърджи.
   
6. 
   Установена е филогенетичната принадлежност на култивируеми продуценти на карбохидрази и е доказано присъствието на пет рода от групата Bacillus sensu lato.
   
7. 
   В липидния профил на описаните нови видове термофилни бактерии са идентифицирани неизвестни групи липиди.
   
8. 
   Създадена е единствената в страната колекция от термофилни бактерии, продуценти на ензими и екзополизахариди, обхващаща над 400 щама, което е принос към националните източници за използване в биотехнологичната индустрия.
   
9. 
   Разработени са лабораторни технологии за ефективно получаване на ценни термостабилни ензими:
   

• 
  първата в света термостабилна гелан лиаза с температурен оптимум 70С;
  
• 
  екстрацелуларна ксиланаза с необичайно висока термостабилност и 63.6% ефективност на процеса за хидролиза на буков ксилан до чиста ксилоза;
  
• 
  термостабилна инулиназа с висок добив, съизмерим с този при мезофилни бактерии и с редица предимства при индустриално използване;
  
• 
  термостабилна пулуланаза от имобилизирани клетки с четирикратно повишаване на специфичната ензимната активност в сравнение с тази на свободните клетки.
  

10. 
    Разработени са оригинални и ефективни схеми за пречистване на ензимите до електрофоретично хомогенни препарати.
    
11. 
    Направена е детайлна характеристика на физикохимичните свойства на изолираните ензими.
    
12. 
    Разработени са ефективно действащи имобилизирани системи от бактериални клетки и ензими, които позволяват многократно и непрекъснато използване с повишаване на специфичната ензимна активност.
    
13. 
    Селекциониран е ефективен термофилен продуцент на нов екзополизахарид, разработен е метод за получаване и е доказана 12 пъти по-висока биологична активност към цитотоксични съединения, което е принос във фармацевтичната индустрия и пречистването на отпадни води.
    

Направеният разбор, както и моите лични впечатления, ми дават основание да считам, че приносът на д-р Камбурова е решаващ за разработването на представената дисертация. Във всички случаи тя е инициатор и активен двигател на проведените изследвания, предоставя методично ръководство, сътрудничество с чуждестранни учени и проектно финансиране. Искам да добавя, че д-р Камбурова е търсен специалист, известен авторитет в микробиологичните среди. Задълбоченото познаване на материята, богата ерудиция и опита на автора в изследването на разглеждания проблем са й позволили да избере много интересна и актуална тема, да навлезе в неизследвана ниша, да докаже поставената цел, да получи резултати, подкрепящи една от хипотезите за произхода на живота на Земята, да оформи оригинални и потвърдителни приноси. Едни от най-впечатляващите характеристики на дисертацията е нейната насоченост в полза на повишаване качеството на живот, включването на България в световната база данни за биоразнообразие на горещи извори, предлагането на ефективни методи за биотехнологичната индустрия относно получаване на ценни биологично-активни съединения и тяхното използване в редица клонове на стопанския живот.

Дисертационният труд на д-р Камбурова отговаря напълно на изискванията за присъждане на научната степен "Доктор на науките". Тя надхвърля и нормите, определени от Правилника на ИМикБ към ЗРАСРБ. Като имам предвид посочените достойнства на рецензирания труд, резултатите от мащабната изследователска дейност и направените приноси, убедено препоръчвам на уважаемите членове на научното жури, сформирано със заповед № І-148/18.10.2013 г. на директора на ИМикБ да присъди научната степен "Доктор на биологичните науки" на доц. д-р Маргарита Камбурова.

12. 11. 2013 г