Направление „Синаптична сигнализация и комуникация



страница1/4
Дата27.10.2018
Размер0.6 Mb.
#101996
ТипАвтореферат
  1   2   3   4


Българска академия на науките

институт по невробиология

Направление „Синаптична сигнализация и комуникация”


Асистент Нели Димитрова Недялкова

АВТОРЕФЕРАТ


На дисертационен труд за придобиване на образователна и научна степен „Доктор” по направление „Биологични науки”, професионална област „Природни науки”, Научна специалност: „Физиология на животните и човека”

(01. 06. 17.)


Физиологични аспекти

на невро-медиирана моторна дейност на колон

Научен ръководител: чл.- кор. проф. д-р

Радомир Георгиев Радомиров, дмн

Официални рецензенти:

Проф. Д-р Рени Калфин, дм

Доц. Д-р Иван Ламбев, дм



София

2014


Дисертационният труд е представен на 130 страници. Съдържа 30 фигури (22 с представени резултати) и 2 таблици. Библиографията обхваща 219 литернатурни източника, от които 2 на кирилица.
Експериментите са проведени в лаборатория „Периферни синапси”, при Институт по Невробиология, БАН. Експерименталните програми са провеждани в съответствие с изискванията на Комисия по етика на научно-изследователската дейност на Институт по Невробиология при БАН.
Дисертационният труд е обсъден и насочен за публична защита на Научен семинар на Институт по Невробиология, БАН, състоял се на 27.01.2014 г.

Изказвам благодарността и признателността си към всички, които ми помогнаха да започна, осъществя и завърша това изследване. Благодаря на моите учители, колеги и приятели за подкрепата и съпричастността.
СЪДЪРЖАНИЕ


I.ВЪВЕДЕНИЕ

6

II.цел, задачи, МАТЕРИАЛИ и методи

7

1.ЦЕЛ

7

2. ЗАДАЧИ

7

3. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

7

3.1. Експериментални животни

7

3.2. Изследване на модуларни моторни отговори

7

3.2.1. Изолирани препарати за изследване на модуларни отговори

7

3.2.2.Електрическа полева стимулация на изолирани гладкомускулни препарати

8

3.3. Изследване на рефлекторните отговори в цялостен сегмент от колон

9

3.3.1. Метод на трикамерната органна вана

9

3.3.2. Електрическа полева стимулация в цялостен препарат от колон на плъх

10

3.4. Техническо оборудване

10

3.5. Разтвори и субстанции за физиологични изследвания

10

3.6. Статистически методи

11

III. РЕЗУЛТАТИ от проучването

11

1. Моторни отговори на изолирани препарати от колон тип „ринг” и тип „ивица”

11

1.1. Модуларни моторни отговори на изолирани препарати тип „ринг” от циркуларен слой на колон

11

1.2. Моторни отговори на изолирани препарати тип-ивица от лонгитудинален слой на колон

13

1.3. Сравняване на моторни отговори на изолирани препарати от циркуларен слой с моторни отговори на изолирани препарати от лонгитудинален слой

14

2. Моторни отговори на изолиран сегмент от колон

16

2.1. Спонтанна моторна активност на изолирани сегменти от колон

16

2.2. Електрически-предизвикани локални моторни отговори

17

2.3. Електрически-предизвикани възходящи моторни отговори

19

2.4. Електрически-предизвикани низходящи моторни отговори

20


IV. ОБСЪЖДАНЕ НА ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИТЕ РЕЗУЛТАТИ

25

1.Експериментални животни и експериментален модел

25

2. Спонтанна моторна активност на изолирани препарати от колон на плъх

26

3. Моторна активност на изолирани циркуларни препарати тип-ринг и лонгитудинални препарати тип-ивица от колон на плъх

26

3.1. Модуларни моторни отговори на изолирани препарати от циркуларен слой на колон

26

3.2. Моторни отговори на изолирани препарати от лонгитудинален слой на колон

28

3.3. Сравняване на моторни отговори на изолирани препарати от циркуларен слой с моторни отговори на изолирани препарати от лонгитудинален слой от колон на плъх

29

4. Моторни отговори в изолиран сегмент от колон

30

4.1. Електрически-предизвикани локални моторни отговори

32

4.2. Електрически-предизвикани възходящи и низходящи моторни отговори

33

изводи

37

Приноси на дисертационния труд

38

Приложения

39

Публикации във връзка с дисертационния труд

39

Научни съобщения по темата на дисертационния труд

39



ИЗПОЛЗВАНИ СЪКРАЩЕНИЯ
Cd – ринг – препарат от циркуларен слой от дистален колон

Cp - ринг – препарат от циркуларен слой от проксимален колон

CM – циркуларен мускулен слой

EFS – electrical field stumilation (електрическа полева стимулация)

LM – лонгитудинален мускулен слой

TTX – Tetrodotoxin (тетродотоксин)

СЧТ – Стомашно-чревен тракт


  1. ВЪВЕДЕНИЕ

Въпросите засягащи възбудно-съкратителния процес в интестиналните гладки мускули се разглеждат в широк кръг изследвания. Особено внимание се отделя на регулаторните механизми на дейността и невромедиаторните взаимодействия в коло-ректо-аналната област. Известно е, че дебелите черва са прицелна точка за възпалителни заболявания, дегенеративни процеси и развитие на туморни образувания. Тези болестни състояния повлияват двигателната активност на колона, която е от основните компоненти на моториката в тази интестинална област. Патогенезата на моторните нарушения в червата включва структурни или функционални промени в ентералната нервна система, интерстициалните клетки на Cajal, невротрансмитерите, сигналните пътища, или други компоненти на ентералните рефлекси.

През последните близо 50 години, след показване на неадренергичната-нехолиергична невротрансмисия се уточнява значението на ентералната нервна система в регулацията на функциите на стомашно-чревния тракт в норма и патология. Въпреки натрупаните данни, все още моториката, моторните дисфункции и потенциалните терапевтични подходи не са достатъчно проучени и изяснени. Поради ограничените познания на основните механизми, обуславящи двигателното поведение в коло-ректалната област е трудно да се направи адекватната оценка на моторните дисфункции, респективно на подходящите терапевтични въздействия.

Изучаването на отделна невромедиаторна система в интегративния процес на координация в дейността на лонгитудиналния и циркуларния слоеве е от значение за изясняване на дезорганизацията на моторната дейност.

За по-бързо разрешаване на проблема в здравен и социален аспект, основна роля има изследването на механизмите на коло-ректо-аналната двигателна активност и участието и/или неучастието в тези процеси на невромедиаторните системи, обуславящи моториката на интестиналната мускулатура.

В настоящия дисертационен труд се представят основните положения на съвременните схващания за механизмите, обуславящи съкратителната активност на гладките мускули, като особено внимание се обръща на невромедиаторните модуларни и дистантни, низходящи и възходящи моторни отговори като характеристика на локални и възходящи и низходящи рефлексни пътища на ентералната нервна система в колон.




II. цел, задачи, МАТЕРИАЛИ и методи

1. ЦЕЛ

Цел на настоящото изследване е характеризиране на физиологични аспекти определящи невро-медиираното участие на лонгитудинален и циркуларен слоеве в координираната моторна активност на колон.


2. ЗАДАЧИ

2.1. Изследване на модуларни моторни отговори на циркуларни ринг – препарати, изолирани от колон на плъх;

2.2. Изследване на моторните отговори на лонгитудинални ивица-препарати, изолирани от колон на плъх;

2.3. Изследване на функционалната координация между лонгитудинален и циркуларен слоеве чрез локални моторни отговори в цялостен препарат от колон;

2.4. Характеризиране на възходящи и низходящи моторни отговори, предизвикани от електрическа полева стимулация;

2.5. Изследване на ролята на лонгитудинален и циркуларен слоеве във възходящи и низходящи рефлексни пътища.
3. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

3.1.Експериментални животни

В експерименталната работа са използвани 180 мъжки полово зрели плъха от порода Wistаr с тегло 250-280 g, възраст – 10-12 седмици. Животните са отглеждани при темперетура 22.0+/- 2.00°С, влажност 50 ± 10%, при 12:12 часа светъл-тъмен режим и неограничен достъп до храна и вода. Животните са оставяни без храна през нощта преди експеримента и са убивани чрез удар зад главата и декапитация или гилотиниране. Коремната кухина е отваряна по linea alba и дисталната част на колона е отстранявана. Колонът е отделян бързо и поставян в оксигениран модифициран разтвор на Кребс при стайна темперетура. Препаратите са внимателно промивани с разтвор на Кребс, прилаган със спринцовка в проксималния край на препарата. Внимателно са отстранявани кръвоносни съдове, нерви и адвентиция по мезентериалната страна на препарата в среда на оксигениран Кребс.


3.2. Изследване на модуларни моторни отговори

3.2.1. Изолирани препарати за изследване на модуларни отговори

От всяко опитно животно е изолиран сегмент от колон с дължина 28-30 мм с интактни нервни плексуси и гладкомускулни слоеве, без отстраняване на мукозата.

За проучване на модуларните отговори са изолирани циркуларни рингове с ширина 2 мм от проксималния (Cp) и от дисталния (Cd) край на препарата. Изолирани са и препарати от проксималния и дисталния край на сегмента с дебелина 2-3 мм и дължина 10-15 мм по надлъжна посока на колона, за изследване на контрактилния отговор на лонгитудиналния слой (Lp, Ld). Фиксирани в двата противоположни края гладкомускулните препарати се монтират в термостатизирани (37°С) органни вани с обем 10 ml, съдържащи модифициран разтвор на Кребс (рН 7,4), който се аерира непрекъснато с газова смес (95%O2 и 5% CO2) (Фиг.1).
3.2.2. Електрическа полева стимулация на изолирани гладкомускулни препарати

За предизвикване на възбуждане на нервните структури е използвана електическа полева стимулация (EFS) (Paton а. Vizi, 1969). EFS е прилагана чрез два платинени електрода с дебелина 0.45 мм, фиксирани на държач един срещу друг, на разстояние 14 мм. Правоъгълни импулси с продължителност 0.8 мс са генерирани с честота 2,5 и 10 Hz през интервал не по-малък от 5 минути и при напрежение 40 V от електростимулатор (Radomirov, Venkova, 1988; Ivancheva & Radomirov, 2001).

ЕFS-предизвиканите моторни отговори на ринг-препаратите от циркуларен мускулен слой от проксимална и дистална част на колон са описани като „модуларни моторни отговори”, дължащи се на възбуждане на локалните модули от нервната мрежа, лежащи в полето на електрическа стимулация.

Във всяка органна вана се монтира по един препарат. Препаратите се натоварват с опъване от 1 грам, равностойно на 10mN. Промените в тонуса и EFS-предизвиканите гладко-мускулни съкращения се записват с on-line система.





Фигура 1. Схема на еднокамерна органна вана за изследване на електрически-предизвикани моторни отговори
3.3. Изследване на рефлекторните отговори в цялостен сегмент от колон

Цялостен препарат от колон с интактни нервни плексуси, гладка мускулатура, без отстраняване на мукозата с дължина приблизително 46-50 мм се монтира хоризонтално в отделенията на трикамерна органна вана (Brading et al.,2008).


3.3.1. Метод на трикамерната органна вана

За изследване на перисталтичните рефлекси в изолирани чревни препарати бе използвана трикамерна органна вана (Ivancheva C, Radomirov R, 2001). Трикамерната органна вана е използвана в експериментални програми за регистриране на моторни отговори на лонгитудинален и циркуларен слоеве на сегменти от колон на плъх. Тя се състои от три камери, разделени чрез пластмасови прегради с парафинови отвори с диаметър от 2 мм. По този начин са на лице орално, средно и анално отделения на ваната (Фиг.2). Силиконова неутрална смазка се поставя около препарата в парафиновия отвор за да се предотврати контакта на хранителната течност в различните камери. Всяка камера е с обем от 10 см3 и притежава собствена проточна/обмиваща система за продължителна перфузия с разтвор на Кребс.

Проксималният и дисталният край на сегментите, всеки от които с дължина около 15-18 мм бяха монтирани с мезентериалната стена надолу върху пластмасова пръчка с дължина около 25 мм и дебелина около 1.5 мм. Пръчката е свързана със стената на проксималната или дисталната камери. Външната част на пръчката с дължина около 8 мм е прегъната под ъгъл от 45° спрямо хоризонтално разположената й вътрешна част. Проксималната и дисталната част на сегмента са прикрепени към пръчката чрез копринен конец в мястото на прегъването й. По този начин се минимизира влиянието на съкращенията на мускулите в лонгитудиналната и циркуларната ос.

Проксималният и дисталният край на препарата, лежащи респективно в проксималната и дисталната камера на ваната се свързват към механопреобразуващи датчици и по този начин се регистрира моторната активност на лонгитудиналния слой. Моторната активност на циркуларния слой в двете части (проксимална и дистална част на сегмента) се измерва между два противоположни края на циркуларния ринг, единият закрепен неподвижно, непозволяващ движение чрез пластмасовата пръчка, а другият е свързан чрез конец към механопреобразувател на 1-2 мм от мястото на прегъване на пръчкатата. И двата мускулни слоя - лонгитудинален и циркуларен са натоварени с еквивалент на 10 mN. Моторната активност на двата слоя, принадлежащи към проксималния и дисталния край на препарата се регистрира едновременно (Brading et al., 2008).



3.3.2. Електрическа полева стимулация в цялостен препарат от колон на плъх

За предизвикване на възбуждане на нервните структури в цялостен препарат от колон е използвана EFS, с описаните по-горе параметри. Прилагането на EFS в оралната или аналната част на ваната предизвикава моторен отговор в съответния сегмент на колона, монтиран в същия раздел на ваната. Тези отговори са локални.

В същото време EFS провокира моторен отговор в нестимулираната част на препарата, извън полето на стимулация. При стимулация в дисталната част на сегмента се регистрират отговори в проксималната част. Тези отговори са възходящи, дължащи се на разпространение на възбуждането по проксимално насочени ентерални пътища. При стимулация на оралната част на сегмента се наблюдава отговор на аналната част. Тези отговори са низходящи, дължащи се на разпространение на възбуждането по дистално насочени ентерални пътища.


Фигура 2. Схема на трикамерна органна вана за отчитане на двигателната активност на изолирани сегменти от колон на плъх.
3.4.Техническо оборудване

Моторните отговори са регистрирани чрез изометрични тензодатчици (Microtechna, Prague, Czech Republic) свързани с усилвател (Microtechna, Prague, Czech Republic) и се дигитализират чрез компютърна програма Силомер 4. Използван е стимулатор (Experimetria, Budapest, Hungary), 6-канално записващо устройство (Watanabe, Tokyo, Japan) и двуканално записващо устройство TZ 4620 ( Laboratorni pristroje, Prague, Czech Republic).


3.5. Разтвори и субстанции за физиологични изследвания

В експерименталната работа бе използван модифициран разтвор на Кребс със следния състав (в mM): NaCl 120, KCl 5.9, NaHCO3 15.4, NaH2PO4 1.2, MgCl2 1.2, CaCl2 2.5 и глюкоза 11.5. Разтворът се аерира постоянно с 95 % O2 и 5 % CO2 (pH 7.2) при 36.5⁰C .

Съединенията бяха с химическа чистота (ч.з.а.) и се разтваряха в бидестилирана вода.

Неврогенната или миогенна природа на моторните отговори е тествана чрез претретиране с тетродотоксин (ТТХ) – селективен блокер на бързия натриев канал. Основният разтвор на ТТХ (Sankyo, Zurich, Switzerland), е съхраняван при – 20 ⁰C.


3.6. Статистически методи

Установеното след 30-минутна адаптация ниво на тонуса се приема за изходна точка за измерване на амплитудата на моторните отговори. Амплитудите са представена в milliNewton (mN; 1 mN=0.102 g). Амплитудите на регистрираните отговори са съпоставяни чрез Student t-теста и а еднофакторен ANOVA, post hoc (LSD, Bonferroni и Duncan) тестове. Данните са представени като средни стойности и стандартна грешка (m±SEM); статистическа значима разлика между групите се приема при р<0.05; n е броят на изследваните препарати. Статистическата обработка на данните е извършена със статистически програми STATGRAPHICS Plus 4.1 for Windows, SPSS 14 (Statistical Package for the Social Sciences) и Exсel (Оffice 2007). За представяне на механографските записи е използван програмен продукт Origin 7.5 Pro.


III. РЕЗУЛТАТИ от проучването

1. Моторни отговори на изолирани препарати от колон тип „ринг” и тип „ивица”

1.1. Модуларни моторни отговори на изолирани препарати тип ринг от циркуларен слой на колон

Спонтанната моторна активност на изолирани препарати ог циркуларен слой на колон се характеризира с неритмични високо-амплитудни съкращения и ниско-амплитудни ритмични фазични съкращения. Не се наблюдават различия в спонтанната моторна активност на ринг препарати, изолирани от проксималната или дистална част на колона.

Модуларните моторни отговори на ринг-препарати изолирани от циркуларен слой на проксималната или дистална част на колона извлечени от електрическа полева стимулация (0.8 ms, 40 V, 20 s) приложена с честота 2 Хц (Фиг.3.) или 5 Хц (Фиг.4) или 10 Хц (Фиг.5) са подобни по характер, бързо развиващи се twitch - подобни съкращения.

Съкратителните отговори се различават в зависимост от честотата на приложената стимулация (Таблица 1). Съкращенията на ринг-препаратите от циркуларен слой, изолирани от проксималната или дисталната област на колона се увеличават по амплитуда пропорционално на увеличаване на честотата на прилаганата електрическа стимулация.



Съществени разлики в максималните стойности на амплитудите в съкратителните отговори на ринг-препарати от циркуларен слой, изолирани от проксималната или дистална част на колон не се наблюдават (фиг. 3, 4, 5).
Таблица 1.

Модуларни моторни отговори – амплитуди. Електрически предизвикани /0.8 мs, 40 V, 20 s/ моторни отговори на циркуларни ринг-препарати изолирани от проксимална (Cp) и дистална (Cd) област на колон при приложени честоти на стимулация 2, 5 и 10 Хц.

Препарат

/Sample

Colon/



2 Hz mN


5 Hz mN


10 Hz mN

t­­­-test

n

t

p

Cp



M 7,87

SD 4,17

SE 1,26

M 10,73

SD 4,82

SE 1,45

M 13,74

SD 5,38

SE 1,62

11

t -1,488 (2 vs. 5) p 0,152

t -2,856 (2 vs.10) p 0,009

t -1,376 (5 vs. 10) p 0,184


Cd

M 7,95

SD 4,1

SE 1,09

M 9,95

SD 4,40

SE 1,18

M 11,34

SD 5,28

SE 1,41

14

t -1,24 (2 vs. 5) p 0,225

t 1,899 (2 vs. 10) p 0,069

t 0,758 (5 vs.10) p 0,455





Сподели с приятели:
  1   2   3   4




©obuch.info 2024
отнасят до администрацията

    Начална страница