Към 5% (M/V) воден разтвор на сребърен нитрат (3.15) се добавя 25% амоняк (3.4), докато утайката се разтвори. Приготвя се непосредствено преди употреба. Остатъкът от разтвора се изхвърля.
4. Апаратура
4.1. Стандартна апаратура за тънкослойна хроматография.
4.1.1. Пластмасов или стъклен капак с конструкция, която осигурява хроматографската плака да е в азотна атмосфера при проявяване и сушене на петната. Тази предпазна мярка е необходима поради податливостта на някои багрила към окисление.
4.1.2. Микроспринцовка от 10 µl, градуирана през 0,2 µl, с игла с квадратно сечение или препоръчително дозаторно устройство от 50 µl, монтирано върху скобата на статива, така че плаката да бъде под азот.
4.1.3. Тънкослойни силикагелни плаки 20 x 20 сm с дебелина на слоя 0,25 mm (Macherey and Nagel, Silica G-HR или еквивалентни).
4.3. Центрофужни епруветки, 10 cm3 (ml), с полиетиленови капачки на винт или еквивалентни.
5. Процедура
5.1. Подготовка на пробите
При изстискване на тубата първите 2-3 cm се отстраняват. В центрофужна епруветка (4.3), предварително продухана с азот, се поставят 300 mg аскорбинова киселина и 3,0 g кремообразна или хомогенизирана течна боя. Добавя се 25% амоняк (3.4) на капки до рН 10. Долива се до 10 cm3 (ml) с 96% етанол (3.3), хомогенизира се под азот (3.8), ценрофугира се 10 min при 4000 rpm. Изследва се горният слой на течната фаза.
5.2. Хроматографски анализ
5.2.1. Нанасяне на разтворите върху плаките
На хроматографската плака (4.1.3) се маркира стартова линия на 1,5 cm от ръба й. Върху 9 точки се нанасят по 1,0 µl от стандартните разтвори в посочения ред:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Р
П
Х
п-ФДА
ДАФ
п-ТДА
о-ФДА
о-ТДА
м-ФДА
м-ТДА
алфа-Н
Върху точки 10 и 11 се нанасят по 2,0 µl от разтвора на пробата (5.1).
Нанасянето на стандартите и пробите се извършва под азот (3.8) и плаката се държи под азот до момента на хроматографирането.
5.2.2. Хроматографско разделяне
Хроматографската вана е предварително продухана с азот (3.8) и наситена с една от четирите подвижни фази (3.22). Плаката се поставя във ваната при стайна температура (20°С до 25°С) на тъмно, докато фронтът достигне 15 сm от стартовата линия, след което се изважда и изсушава под азот (3.8) при стайна температура.
5.2.3. Проявяване на петната
Плаката се напръсква веднага с един от четирите разтвора, описани в 3.23.
Сравняват се Rf-стойностите и цветовете на получените петна от пробата с тези на стандартните разтвори.
В табл. 1 са представени Rf-стойностите и цветовете на петната на всички стандартни субстанции в съответните подвижни фази и използваните проявяващи реактиви.
По тази методика понякога може да се получи спорна идентификация при сравняване на петната на съответните стандартни субстанции с тези на пробата.
5.2.5. Полуколичествено определяне
Сравнява се визуално интензивността на петната на всяко вещество, идентифицирано съгласно 5.2.4 със серия от стандартни разтвори с подходяща концентрация.
Ако концентрацията на една или повече субстанции в пробата е много висока, пробата се разрежда и определението се повтаря.
Таблица 1
Rf - стойности и цветове на петната, получени веднага след напръскването