Наредба №36 от 30 ноември 2005 Г. За изискванията към козметичните продукти

Нанасянето на стандартите и пробите се извършва под азот (3.8) и плаката се държи под азот до момента на хроматографирането.

5.2.2. Хроматографско разделяне

Хроматографската вана е предварително продухана с азот (3.8) и наситена с една от четирите подвижни фази (3.22). Плаката се поставя във ваната при стайна температура (20°С до 25°С) на тъмно, докато фронтът достигне 15 сm от стартовата линия, след което се изважда и изсушава под азот (3.8) при стайна температура.

5.2.3. Проявяване на петната

Плаката се напръсква веднага с един от четирите разтвора, описани в 3.23.

5.2.4. Идентифициране

Сравняват се R_f-стойностите и цветовете на получените петна от пробата с тези на стандартните разтвори.

В табл. 1 са представени R_f-стойностите и цветовете на петната на всички стандартни субстанции в съответните подвижни фази и използваните проявяващи реактиви.

По тази методика понякога може да се получи спорна идентификация при сравняване на петната на съответните стандартни субстанции с тези на пробата.

5.2.5. Полуколичествено определяне

Сравнява се визуално интензивността на петната на всяко вещество, идентифицирано съгласно 5.2.4 със серия от стандартни разтвори с подходяща концентрация.

Забележка:

1. о-ФДА се проявява слабо; трябва да се използва подвижна фаза (3.22.3), за да се разграничи ясно от о-ТДА.

2. (*) показва най-добро развитие на цвета.

6. Изпитване с двупосочна тънкослойна хроматография

Двупосочната хроматографска процедура изисква употребата на допълнителни стандарти и реактиви.

6.1. Допълнителни стандартни разтвори и субстанции

6.1.1. b-Нафтол (b-Н).

6.1.2. 2-Аминофенол (о-АФ).

6.1.3. 3-Аминофенол (м-АФ).

6.1.4. 4-Аминофенол (п-АФ).

6.1.5. 2-Нитро-1,4-фенилендиамин (2-НПФДА).

6.1.6. 4-Нитро-1,2-фенилендиамин (4-НОФДА).

Приготвят се 0,5% (M/V) разтвори на всички допълнителни стандартни субстанции, както е описано в 3.21.

6.2. Допълнителна подвижна фаза

6.2.1. Етилацетат:циклохексан:амонячен разтвор (25%) = 65:30:0,5 (V/V/V).

6.3. Допълнителна индикаторна система за проявяване на петната

Във ваната за тънкослойна хроматография се поставя стъклен съд с 2,0 g йодни кристали и ваната се затваря с подходящ капак.

6.4. Хроматографиране

6.4.1. Върху абсорбиращата повърхност на плаката за тънкослойна хроматография (4.1.3) се начертават две линии, както е показано на фигурата.

6.4.2. Под азотна атмосфера (4.1.1) се нанасят от 1 до 4 µl от екстракта на пробата на стартова точка 1 (фигурата), която е на 2 сm от двете страни на плаката.

Количеството на нанесения екстракт зависи от интензивността на петната върху хроматограмите 5.2.

6.4.3. Нанасят се на стартови точки 2 и 3 (фиг.1) окислителните багрила, които са идентифицирани или предстои да се идентифицират чрез 5.2 (разстоянието между точките е 1,5 cm). От всички стандартни разтвори се нанасят по 2,0 µl, с изключение на ДАФ - от него трябва да се нанесат 6,0 ml. Нанасянето се провежда под азот (6.4.2).

6.4.4. Повтаря се операция (6.4.3) за стартови точки 4 и 5 (фиг.1) - разстояние между точките 1,5 cm, и се оставя плаката под азот до момента на хроматографиране.

6.4.5. Хроматографската вана се продухва с азот (3.8) и се насища с подвижна фаза (3.22.2).

Плаката (6.4.4) се поставя във ваната в първата посока (фиг.1) на тъмно.

Хроматографирането продължава, докато фронтът на подвижната фаза достигне маркираната линия върху плаката (приблизително 13 cm).

6.4.6. Плаката се изважда от ваната и се поставя в друга, предварително продухана с азот, където престоява поне за 60 min, за да се изпарят разтворителите.

6.4.7. В следваща хроматографска вана, също предварително продухана с азот (3.8) и наситена с подвижна фаза (6.2), плаката се поставя обърната на 90°.

Хроматографира се във втората посока (също на тъмно), докато фронтът на подвижната фаза достигне начертаната линия върху абсорбиращата повърхност (фиг. 1), след което се изважда от ваната и се оставя на въздух да се изпарят разтворителите.

6.4.8. Плаката се поставя за 10 min в хроматографската вана с йодни пари (6.3). Двупосочната хроматограма се тълкува, като се използват R_f-стойностите и цветът на стандартните субстанции, хроматографирани по същото време. В табл. 2 са посочени цветовете на петната на стандартните субстанции.

Забележка. За да се получи максимално оцветяване на петната, хроматограмата се оставя на въздух за половин час след проявяване на петната.

6.4.9. Наличието на окислителни багрила, открити в 6.4.8, може окончателно да се потвърди с повторение на операциите, описани в 6.4.1 до 6.4.8, и добавяне в стартова точка 1 върху количеството нанесена проба (6.4.2) на 1 µl от стандартните разтвори, идентифицирани в т.6.4.8.

Ако не се открие друго петно, сравнено с получената хроматограма в 6.4.8, тълкуването й е правилно.

А. Идентификация

1. Област на приложение

Методът се отнася за определяне на нитрити в козметични продукти, в частност в кремове и пасти.

2. Принцип

Присъствието на нитрити се установява чрез образуване на цветни производни с 2-аминобензалдехид фенилхидразон (Nitrin(r)).

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Разредена сярна киселина: 2 cm³ (ml) концентрирана сярна киселина (d₄²⁰ = 1,84) се разреждат с 11 cm³ (ml) дестилирана вода.

3.2. Разредена солна киселина: 2 cm³ (ml) концентрирана солна киселина (d₄²⁰ = 1,19) се разреждат с 11 cm³ (ml) дестилирана вода.

3.3. Метанол.

3.4. Разтвор на 2-аминобензалдехид фенилхидразон (реактив Nitrin(r)) в метанол.

Претеглят се 2,0 g Nitrin(r) с точност 0,001 g и се прехвърлят количествено в мерителна колба от 100 cm³ (ml). На капки се прибавят 4,3 cm³ (ml) разредена солна киселина (3.2) и се разклаща. Долива се до марката с метанол и се разбърква, докато разтворът стане напълно бистър. Разтворът се съхранява в тъмна стъклена бутилка (4.3).

4. Апаратура

4.1. Стъклени чаши, 50 cm³ (ml).

4.2. Мерителна колба, 100 cm³ (ml).

4.3. Тъмна стъклена бутилка, 125 cm³ (ml).

4.4. Стъклена плочка, 10 x 10 cm.

4.5. Пластмасова шпатула.

4.6. Филтърна хартия, 10 x 10 cm.

5. Процедура

5.1. Част от пробата за изследване се разстила равномерно върху стъклената плочка (4.4), така че да покрие повърхността с дебелина на слоя не повече от 1 cm.

5.2. Филтърна хартия (4.6) се напоява с дестилирана вода. Разстила се върху пробата и се притиска с пластмасова шпатула (4.5).

5.3. Изчаква се една min и в центъра на филтърната хартия се накапват:

- две капки разредена сярна киселина (3.1);

- две капки реактив на Nitrin(r) (3.4).

5.4. След 5 до 10 sec филтърната хартия се отстранява и се разглежда на дневна светлина. Присъствието на нитрити се установява от червеникаво-пурпурно оцветяване.

Ако съдържанието на нитрити е ниско, след 5 до 15 sec червеникаво-пурпурното оцветяване се променя в жълто. Тази промяна се наблюдава едва след 1 до 2 min, когато количеството на нитрити е голямо.

Интензивността на червеникаво-пурпурното оцветяване и времето, което протича до промяната му в жълто, може да даде указание за съдържанието на нитрити в пробата.

Б. Определяне

1. Област на приложение

Методът се отнася за определяне на нитрити в козметични продукти.

2. Дефиниция

Съдържанието на нитрити в пробата, определено съгласно този метод, се изразява в % (M/M) натриев нитрит.

3. Принцип

След разреждане с вода и избистряне присъстващите нитрити реагират със сулфаниламид и N-1-нафтилетилендиамин и се измерва оптическата плътност на полученото цветно съединение при дължина на вълната 538 nm.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1. Избистрящи реактиви: съхраняват се в хладилник и са устойчиви в продължение на една седмица.

4.1.1. Реактив Carrez I:

Разтварят се 106 g калиев цианоферат(II) (K₄Fe(CN)6.3H₂O) в дестилирана вода до 1000 сm³ (ml).

4.1.2. Реактив Carrez II:

В мерителна колба от 1000 сm³ (ml) се разтварят 219,5 g цинков ацетат (Zn(CH₃COO)2.2H₂O) и 30 cm³ (ml) ледена оцетна киселина и се долива до марката с дестилирана вода.

10 сm³ (ml) от този разтвор се разрежда до 500 сm³ (ml) с дестилирана вода; 1,0 сm³ (ml) от последния разтвор = 10 µg NaNO₂

4.2. Разтвор на натриев нитрит:

В мерителна колба от 1000 сm³ (ml) се разтварят 0,500 g натриев нитрит в дестилирана вода и се долива до марката с дестилирана вода. 10 cm³ (ml) от този разтвор се разреждат до 500 cm³ (ml) с дестилирана вода; 1 cm³ (ml) от последния разтвор съдържа 10 mg NaNO₂.

4.3. Натриев хидроксид, 1 N

4.4. Сулфаниламид хидрохлорид, 0,2% (M/V)

В 1000 сm³ (ml) колба се разтварят 2,0 g сулфаниламид в 800 cm³ (ml) вода при нагряване. Охлажда се и се добавят 100 cm³ (ml) концентрирана солна киселина при бъркане. Долива се до марката с дестилирана вода.

4.5. Солна киселина, 5 N

4.6. Реактив N-1-нафтил, приготвен непосредствено преди употреба.

В 100 cm³ (ml) мерителна колба се разтварят 0,1 g N-1-нафтилетилендиамин дихидрохлорид в дестилирана вода и се долива до марката.

5. Апаратура

5.1. Аналитична везна.

5.2. Мерителни колби от 100, 250, 500 и 1000 cm³ (ml).

5.3. Градуирани пипети.

5.4. Мерителни цилиндри от 100 cm³ (ml).

5.5. Нагъната филтърна хартия, свободна от нитрити, диаметър 15 cm.

5.6. Водна баня.

5.7. Спектрофотометър с кювети с дебелина на слоя 1 cm.

5.8. рН-метър.

5.9. Микробюрета от 10 cm³ (ml).

5.10. Стъклени чаши от 250 cm³ (ml).

6. Процедура

6.1. Претеглят се около 0,5 g (M) с точност до 0,0001 g от хомогенизираната проба, прехвърля се количествено с топла вода в стъклена чаша от 250 cm³ (ml) (5.10) и обемът се довежда приблизително до 150 cm³ (ml) с топла дестилирана вода. Чашата (5.10) се поставя във водна баня (5.6) при 80 °С за половин час, като се разклаща периодично.

6.2. Охлажда се до стайна температура и последователно, при разбъркване се добавят 2 cm³ (ml) реактив Carrez I (4.11) и 2 cm³ (ml) реактив Carrez II (4.12).

6.3. Прибавя се разтвор на натриев хидроксид (4.3) за довеждане на рН до 8,3 с рН-метър (5.8). Съдържанието се прехвърля количествено в мерителна колба от 250 cm³ (ml) и се долива до марката с дестилирана вода.

6.4. Съдържанието се разбърква и се филтрува през филтърна хартия (5.5).

6.5. С помощта на пипета (5.3) се прехвърля в мерителна колба от 100 cm³ (ml) (5.2) не повече от 25 cm³ (ml) от бистрия филтрат (V). Долива се с дестилирана вода до обем 60 cm³ (ml).

6.6. След разбъркване се добавят 10,0 cm³ (ml) разтвор на сулфаниламид хидрохлорид (4.4) и след това 6,0 cm³ (ml) 5 N солна киселина (4.5). Разбърква се и се оставя да престои 5 min. Прибавят се 2,0 cm³ (ml) реактив N-1-нафтил (4.6), разбърква се и се оставя да престои 3 min. Долива се с вода до марката и се разбърква.

6.7. Приготвя се празна проба чрез повтаряне на операции 6.5 и 6.6 без прибавяне на реактив N-1-нафтил (4.6).

6.8. Измерва се (5.7) оптическата плътност при 538 nm на разтвора, получен съгласно 6.6 спрямо празната проба (6.7) като контрола.

6.9. По стандартна крива (6.10) се отчита съдържанието на натриев нитрит в µg/100 cm³ (ml) разтвор (М1), което съответства на отчетената оптическа плътност в 6.8.

6.10. Изготвя се стандартна крива, като се използва 10 µg/cm³ (ml) разтвор на натриев нитрит (4.2) за концентрации 0, 20, 40, 60, 80 и 100 µg натриев нитрит на 100 cm³ (ml).

7. Изчисление

Съдържанието на натриев нитрит в пробата в % (M/M) се изчислява с помощта на следната формула:

%NaNO₂ = 250/V x M₁ x 10^-6 x 100/M = M₁ / (V x M x 40) ,

където:

M₁ е съдържанието на натриев нитрит, определено съгласно 6.9, в µg;

V е филтратът, използван за измерването (6.5) в cm³ (ml).

8. Повторяемост (Виж ISO 5725)

При съдържание на натриев нитрит около 0,2% разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля абсолютна стойност от 0,005%.