Наредба №36 от 30 ноември 2005 Г. За изискванията към козметичните продукти

5.1.3. Прибавят се 10 cm³ (ml) ацетон (3.3), потапят се електродите (4.3 и 4.4) под повърхността и се започва разбъркване. Титрува се потенциометрично с 0,1 М разтвор на сребърен нитрат (3.4) и се построява диференциална крива за определяне на еквивалентния пункт (V cm³ (ml).

6. Изчисления

Съдържанието на хлор в пробата в % (M/M) се изчислява по формулата:

	0,3545 x V
% (M/M) хлор =	------------- ,
	M

където:

M е масата на пробата, взета за анализ (5.1.1), в g;

V - обемът на 0,1 М разтвор на сребърен нитрат, изразходван до еквивалентния пункт (5.1.3), в cm³ (ml).

7. Повторяемост (1)

За съдържание на хлор 4 % (M/M) разликата между две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надвишава 0,10 % (M/M).

Д. ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА ОТНОШЕНИЯТА НА АЛУМИНИЕВИ АТОМИ КЪМ ЦИРКОНИЕВИ АТОМИ И АЛУМИНИЕВИ ПЛЮС ЦИРКОНИЕВИ АТОМИ КЪМ ХЛОРНИ АТОМИ

1. Изчисляване на отношението алуминиеви атоми към циркониеви атоми

Отношението Al : Zr се изчислява по формулата:

Отношението (Al + Zr) : Cl се изчислява по формулата:

1. Област на приложение

Методът се отнася за качественото и количествено определяне на:

- хексамидин и неговите соли, включително изетионат и 4-хидрокси бензоат,

- дибромохексамидин и негови соли, включително изетионат,

- дибромопропамидин и негови соли, включително изетионат,

- хлорхексидин диацетат, диглюконат и дихидрохлорид в козметични продукти.

2. Дефиниция

Концентрациите на хексамидин, дибромохексамидин, дибромопропамидин и хлорхексидин, определени по този метод, се изразяват в % (M/M).

3. Принцип

Идентифицикацията и определянето се извършва чрез обратнофазова високоефективна течна хроматография (ВЕТХ) c УВ детектор. Хексамидин, дибромохексамидин, дибромопропамидин и хлорхексидин се идентифицират по техните времена на задържане в хроматографската колона.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "за ВЕТХ", а водата - бидестилирана.

4.1. Метанол.

4.2. 1-хептансулфонова киселина, натриева сол, монохидрат.

4.3. Оцетна киселина, ледена (d₂₀ = 1,05 g/cm³ (ml).

4.4. Натриев хлорид.

4.5. Подвижни фази.

4.5.1. Разтворител I: 0,005 М разтвор на 1-хептансулфонова киселина, натриева сол, монохидрат (4.2) в метанол (4.1), доведен до рН 3,5 с ледена оцетна киселина (4.3).

4.5.2. Разтворител II: 0,005 М разтвор на 1-хептансулфонова киселина, натриева сол, монохидрат (4.2) във вода, доведен до рН 3,5 с ледена оцетна киселина (4.3).

Забележка. Ако е необходимо да се подобри формата на пиковете, подвижните фази могат да се модифицират и приготвят, както следва:

- Разтворител I: разтварят се 5,84 g натриев хлорид (4.4) и 1,1013 g 1-хептансулфонова киселина, натриева сол, монохидрат (4.2) в 100 cm³ (ml) вода. Прибавят се 900 cm³ (ml) метанол (4.1) и се довежда до рН 3,5 с ледена оцента киселина (4.3).

- Разтворител II: разтварят се 5,84 g натриев хлорид (4.4) и 1,1013 g 1-хептансулфонова киселина, натриева сол, монохидрат (4.2) в 1 dm³ (l) вода и се довежда до рН 3,5 с ледена оцента киселина (4.3).

4.6. Хексамидин диизетионат [C₂₀H₂₆N₄O₂.2C₂H₆O₄S].

4.7. Дибромохексамидин диизетионат [C₂₀H₂₆Br₂N₄O₂.2C₂H₆O₄S].

4.8. Дибромопропамидин диизетионат [C₁₇H₁₈Br₂N₄O₂.2C₂H₆O₄S].

4.9. Хлорхексидин диацетат [C₂₂H₃₀Cl₂N₁₀.2C₂H₄O₂].

4.10. Стандартни разтвори: приготвят се 0,05 % (М/V) разтвори на всеки от четирите консерванта (4.6 до 4.9) в разтворител I (4.5.1).

4.11. 3,4,4'-трихлорокарбанилид (триклокарбан).

4.12. 4,4'-дихлоро-3-(трифлуорометил) карбанилид (халокарбан).

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Високоефективен течен хроматограф с УВ детектор с варираща дължина на вълната.

5.3. Аналитична колона: неръждаема стомана, дължина - 30 сm; вътрешен диаметър - 4 mm; напълнена с m-Bondapack С₁₈, 10 mm или подобен.

5.4. Ултразвукова вана.

6. Идентификация

6.1. Подготовка на пробата: Претеглят се около 0,5 g от пробата с точност 0,001 g в 10 cm³ (ml) мерителна колба и се долива до марката с разтворител I (4.5.1). Колбата се поставя в ултразвукова вана (5.4) за 10 min. Разтворът се филтрува или центрофугира. Филтратът се отделя за хроматографски анализ.

6.2. Хроматография.

6.2.1. Градиент на подвижната фаза

Време	Разтворител I	Разтворител II
(min)	(% V/V) (4.5.1)	(% V/V) (4.5.2)
0	50	50
15	65	35
30	65	35
45	50	50

6.2.2. Скорост на потока на подвижната фаза (6.2.1) до 1,5 cm³ (ml)/min и температура на колоната до 35 °С.

6.2.3. Дължина на вълната на детектора - 264 nm.

6.2.4. Инжектират се 10 ml от всеки стандартен разтвор (4.10) и се записват хроматограмите им.

6.2.5. Инжектират се 10 ml от разтвора на пробата (6.1) и се записва хроматограмата.

6.3. Идентифицира се присъствието на хексамидин, дибромохексамидин, дибромопропамидин или хлорхексидин, като се сравняват времената на задържане на записаните пикове в 6.2.5 с тези, получени от стандартните разтвори в 6.2.4.

7. Определяне

7.1. Подготовка на стандартни разтвори. Използва се един от консервантите (4.6 до 4.9), който липсва в мострата, като вътрешен стандарт. Ако това не е възможно, препоръчва се да се използва триклокарбан (4.11) или халокарбан (4.12).

7.1.1. Изходен разтвор на консерванта, 0,05 % (М/V), идентифициран в 6.3, в разтворител I (4.5.1).

7.1.2. Изходен разтвор на консерванта, 0,05 % (М/V), избран като вътрешен стандарт, в разтворител I (4.5.1).

7.1.3. За всеки идентифициран консервант се приготвят 4 стандартни разтвора, като се отмерват в серия от 10 сm³ (ml) мерителни колби подходящи количества от изходния разтвор на идентифицирания консервант (7.1.1) и подходящи количества от изходния разтвор на вътрешния стандарт (7.1.2) според долната таблица. Всяка колба се долива до необходимия обем с разтворител I (4.5.1) и се разбърква.

7.2. Подготовка на пробата.

7.2.1. Претегля се около 0,5 g (р) с точност 0,001 g от пробата в мерителна колба от 10 cm³ (ml), добавят се 1,0 cm³ (ml) от вътрешния стандартен разтвор (7.1.2) и 6 cm³ (ml) от разтворител I (4.5.1) и се разбърква.

7.2.2. Колбата се поставя в ултразвукова вана (5.4) за 10 min. Охлажда се. Долива се до необходимия обем с разтворител I и се разбърква. Центрофугира се или се филтрува през нагъната филтърна хартия. Събира се горната фаза или филтратът за хроматографиране.

7.3. Хроматография.

7.3.1. Градиентът на подвижната фаза, скоростта на потока, температурата на колоната и дължината на вълната на детектора на HPLC (5.2) са, както е препоръчано при етап идентификация (6.2.1 до 6.2.3).

7.3.2. Инжектират се 10 ml от разтвора на пробата (7.2.2) и се измерват пиковите площи. Повтаря се процесът с инжектиране на 10 ml от разтвора на пробата, докато се получат постоянни резултати. Изчислява се съотношението на пиковата площ, получена от анализираната проба, с пиковата площ, получена от вътрешния стандарт.

7.4. Калибриране.

7.4.1. Инжектират се 10 ml от всички стандартни разтвори (7.1.3) и се измерват пиковите площи.

7.4.2. За всеки стандартен разтвор (7.1.3) се изчислява съотношението на пиковите площи на хексамидина, дибромохексамидина, дибромопропамидина или хлорхексидина спрямо пиковата площ на вътрешния стандарт. Начертава се стандартна крива, като на ординатата се нанасят тези съотношения, а на абсцисата - съответните концентрации на идентифицираните консерванти в стандартните разтвори, в mg/cm³ (ml).

7.4.3. От стандартната крива (7.4.2) се отчитат концентрациите на идентифицираните консерванти, съответстващи на изчислените пикови площи в 7.3.2.

8. Изчисления

8.1.1.Съдържанието на хексамидин, дибромохексамидин, дибромопропамидин или хлорхексидин в пробата като % (M/M) се изчислява по следната формула:

	c		МW1
% (M/M) =	--------	x	----- ,
	1000 x p		МW2

където:

р е масата на анализираната проба (7.2.1) в g;

с - концентрацията на консерванта в разтвора на пробата, отчетена от стандартната крива, в mg/cm³ (ml);

МW1 - молекулното тегло на основната форма присъстващ консервант;

МW2 - молекулното тегло на съответната сол (виж т. 10).

9. Повторяемост (Виж ISO 5725.)

За концентрация 0,1 % (М/М) на хексамидина, дибромохексамидина, дибромопропамидина или хлорхексидина разликата в резултатите на две паралелно проведени определяния на една и съща проба не трябва да надвишава 0,005 %.

10. Таблица на консервантите със съответните формули и молекулни тегла

ХХХVI. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОПРЕДЕЛЯНЕ НА БЕНЗОЕНА КИСЕЛИНА, 4-ХИДРОКСИБЕНЗОЕНА КИСЕЛИНА, СОРБИНОВА КИСЕЛИНА, САЛИЦИЛОВА КИСЕЛИНА И ПРОПИОНОВА КИСЕЛИНА В КОЗМЕТИЧНИ ПРОДУКТИ

1. Област на приложение

Методът се отнася за идентификация и определяне на бензоена киселина, 4-хидроксибензоена киселина, сорбинова киселина, салицилова киселина и пропионова киселина в козметични продукти. Отделни процедури описват идентификацията на тези консерванти; определянето на пропионова киселина, 4-хидроксибензоена киселина, салицилова киселина, сорбинова киселина и бензоена киселина.

2. Дефиниция

Количествата на бензоена киселина, 4-хидроксибензоена киселина, сорбинова киселина, салицилова киселина и пропионова киселина, определени по този метод, се изразяват като % (M/M) на свободните киселини.

А. ИДЕНТИФИКАЦИЯ

1. Принцип

След киселинно-основна екстракция на консервантите екстрактът се анализира чрез тънкослойна хроматография (ТСХ), използвайки непосредствена дериватизация. В зависимост от резултатите идентификацията се потвърждава чрез високоефективна течна хроматография (ВЕТХ) или за пропионовата киселина чрез газова хроматография.

2. Реактиви

2.1. Общо изискване.

Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а.), водата - дестилирана или с еквивалентна чистота.

2.2. Ацетон.

2.3. Диетилов етер.

2.4. Ацетонитрил.

2.5. Толуен.

2.6. n-Хексан.

2.7. Парафин, течен.

2.8. Солна киселина, 4 М.

2.9. Калиев хидроксид, 4 М.

2.10. Калциев хлорид, CaCl₂.2H₂O.

2.11. Литиев карбонат, Li₂CO₃.

2.12. 2-Бром-2'-ацетонафтон.

2.13. 4-Хидроксибензоена киселина.

2.14. Салицилова киселина.

2.15. Бензоена киселина.

2.16. Сорбинова киселина.

2.17. Пропионова киселина.

2.18. Сравнителни разтвори.

Приготвят се 0,1 % (M/V) разтвори (100 mg/100 cm³ (ml) от всеки от петте консерванта (2.13 до 2.17) в диетилов етер.

2.19. Реактив за дериватизация.

0,5 % (M/V) разтвор на 2-бром-2'ацетонафтон (2.12) в ацетонитрил (2.4) (50 mg/10 cm³ (ml). Този разтвор се приготвя непосредствено преди употреба.

2.20. Разтвор на катализатор.

0,3 % (M/V) разтвор на литиев карбонат (2.11) във вода (300 mg/100 cm³ (ml). Този разтвор се приготвя непосредствено преди употреба.

2.21. Подвижна фаза.

Толуен (2.5) : ацетон (2.2) = 20 : 0,5 (V/V).

2.22. Течен парафин (2.7) : n-хексан (2.6) = 1 : 2 (V/V).

3. Апаратура

Стандартно лабораторно оборудване.

3.1. Водна баня, която може да поддържа температура 60 °С.

3.2. Хроматографска вана.

3.3. Източник на УВ светлина, 254 и 366 nm.

3.4. Плаки за тънкослойна хроматография Kieselgel 60, без флуоресцентен индикатор, 20 x 20 cm, дебелина на слоя 0,25 mm, с концентрираща зона 2,5 x 20 cm (Merck 11845 или еквивалентни).

3.5. Микроспринцовка, 10 ml.

3.6. Микроспринцовка, 25 ml.

3.7. Сушилня, която може да поддържа температура 105 °С.

3.8. Стъклени епруветки от 50 cm³ (ml) със запушалки на винт.

3.9. Филтърна хартия, диаметър 90 mm, Schleicher & Schull, № 5892, бяла лента или еквивалентна.

3.10. Универсална рН индикаторна хартия, рН 1-11.

3.11. Стъклени шишенца за проби от 5 cm³ (ml).

3.12. Ротационен изпарител (Rotavapor или еквивалентен).

3.13. Нагревателна плоча.

4. Процедура

4.1. Приготвяне на пробата.

В стъклена епруветка от 50 cm³ (ml) (3.8) се претегля около 1 g от пробата. Прибавят се 4 капки 4 M солна киселина (2.8) и 40 cm³ (ml) ацетон (2.2). За силноалкални продукти, като тоалетни сапуни, е необходимо да се прибавят 20 капки 4 М солна киселина (2.8). Проверява се стойността на рН дали е около 2 с индикаторна хартия (3.10). Епруветката се запушва и се разклаща енергично в продължение на 1 min.

Ако е необходимо да се улесни екстрахирането на консервантите в ацетоновата фаза, сместа се нагрява леко до около 60 °С за стопяване на течната фаза.

Разтворът се охлажда до стайна температура и се филтрува през филтърна хартия (3.9) в конична колба.

20 cm³ (ml) от филтрата се прехвърлят в конична колба от 200 cm³ (ml), прибавят се 20 cm³ (ml) вода и се разбърква. рН на сместа се довежда до около 10 с 4 М калиева основа (2.9), като за измерване на рН се използва индикаторна хартия (3.10).

Прибавя се 1 g калциев хлорид (2.10) и се разклаща енергично.

Филтрува се през филтърна хартия (3.9) в делителна фуния от 250 cm³ (ml), съдържаща 75 cm³ (ml) диетилов етер, и се разклаща енергично в продължение на 1 min. Оставя се да се разделят слоевете и водният слой се излива в конична колба от 250 cm³ (ml). Етерният слой се отстранява.

Като се използва индикаторна хартия (3.10), рН на водния слой се довежда до около 2 с помощта на 4 М солна киселина (2.8). Прибавят се 10 cm³ (ml) диетилов етер (2.3), колбата се запушва и се разбърква енергично в продължение на 1 min. Оставя се да се разделят слоевете и етерният слой се прехвърля в ротационен изпарител (3.12). Водният слой се изхвърля.

Етерният слой се изпарява почти до сухо и остатъкът се разтваря в 1 cm³ (ml) диетилов етер (2.3). Разтворът се прехвърля в шишенце за проби (3.11).

4.2. Тънкослойна хроматография.

За всички стандартни разтвори и от проби, които ще се хроматографират, се нанасят със спринцовка (3.5) по около 3 ml от разтвора на литиев карбонат (2.20) на еднакви разстояния върху стартовата линия на концентриращата зона на плаката за ТСХ (3.4) и се изсушава в ток от студен въздух.

Плаката се поставя върху нагревателната плоча (3.13), загрята до 40 °С, за да остават петната колкото е възможно по-малки. С микроспринцовка (3.5) се нанасят по 10 ml от стандартните разтвори (2.18) и от разтвора на пробата (4.1) върху стартовата линия на плаката точно върху петната от литиев карбонат.

Накрая се нанасят по около 15 ml от реактива за дериватизация (2.19) (2-бром-2'-ацетонафтон) отново точно върху петната, където са нанесени стандартните разтвори и разтворът на пробата, както и разтворът на литиев карбонат.

Плаката се нагрява в сушилня (3.7) при температура 80 °С в продължение на 45 min. След охлаждане плаката се поставя в хроматографската вана (3.2), която предварително е доведена до равновесие за 15 min (без да се прилага облицоване с филтърна хартия) с подвижната фаза (2.21). Плаката престоява, докато фронтът на елуента достигне разстояние 15 cm от стартовата линия (това може да отнеме приблизително 80 min).

Плаката се изсушава в ток от студен въздух и получените петна се разглеждат под УВ светлина (3.3). За засилване на флуоресценцията на бледите петна плаката може да се потопи в сместа течен парафин/n-хексан (2.22).

5. Отчитане на резултатите

Изчислява се R_f стойността на всяко петно.

Сравнява се R_f стойността и поведението при УВ облъчване на петната от пробата и петната от стандартните разтвори.

Прави се предварително заключение относно присъствието и идентичността на наличните консерванти. Провежда се ВЕТХ, описана в част Б, или ако се докаже пропионова киселина - газова хроматография, описана в част Б. Сравняват се получените времена на задържане с тези на стандартните разтвори.

Обобщават се резултатите от ТСХ, ВЕТХ или ГХ и на тази база се определя окончателната идентификация на присъстващите в пробата консерванти.

Б. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА БЕНЗОЕНА КИСЕЛИНА, 4-ХИДРОКСИБЕНЗОЕНА КИСЕЛИНА, СОРБИНОВА КИСЕЛИНА И САЛИЦИЛОВА КИСЕЛИНА

1. Принцип

След подкисляване пробата се екстрахира със смес от етанол и вода. След филтруване консервантите се определят посредством високоефективна течна хроматография (ВЕТХ).

2. Реактиви

2.1. Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а), а където е необходимо с чистота "за ВЕТХ".

Използваната вода трябва да бъде бидестилирана или с еквивалентна чистота.

2.2. Етанол, абсолютен.

2.3. 4-хидроксибензоена киселина.

2.4. Салицилова киселина.

2.5. Бензоена киселина.

2.6. Сорбинова киселина.

2.7. Натриев ацетат (CH₃COONa.3H₂O).

2.8. Оцетна киселина (d₄²⁰ = 1,05 g/cm³ (ml).

2.9. Ацетонитрил.

2.10. Сярна киселина, 2 М.

2.11. Калиев хидроксид, 0,2 М.

2.12. 2-метоксибензоена киселина.

2.13. Смес етанол-вода : смесват се девет обема етанол (2.2) и един обем вода (2.1).

2.14. Разтвор на вътрешен стандарт.

Приготвя се разтвор, който съдържа около 1g с точност 0,001 g 2-метоксибензоена киселина (2.12) в 500 cm³ (ml) смес етанол-вода (2.13).

2.15. Подвижна фаза за ВЕТХ.

2.15.1. Ацетатен буфер: към 1 dm³ (l) вода се прибавят 6,35 g натриев ацетат (2.7) и 20,0 cm³ (ml) оцетна киселина (2.8) и се разбърква.

2.15.2. Подвижната фаза се приготвя чрез смесване на 9 обема ацетатен буфер (2.15.1) и един обем ацетонитрил (2.9).