Наредба №36 от 30 ноември 2005 Г. За изискванията към козметичните продукти



страница98/102
Дата22.07.2016
Размер8.7 Mb.
1   ...   94   95   96   97   98   99   100   101   102


3.8. Стъклени епруветки от 50 cm3 (ml) със запушалки на винт.

3.9. Филтърна хартия, диаметър 90 mm, Schleicher & Schull, № 5892, бяла лента или еквивалентна.

3.10. Универсална рН индикаторна хартия, рН 1-11.

3.11. Стъклени шишенца за проби от 5 cm3 (ml).

3.12. Ротационен изпарител (Rotavapor или еквивалентен).

3.13. Нагревателна плоча.

4. Процедура

4.1. Приготвяне на пробата.

В стъклена епруветка от 50 cm3 (ml) (3.8) се претегля около 1 g от пробата. Прибавят се 4 капки 4 M солна киселина (2.8) и 40 cm3 (ml) ацетон (2.2). За силноалкални продукти, като тоалетни сапуни, е необходимо да се прибавят 20 капки 4 М солна киселина (2.8). Проверява се стойността на рН дали е около 2 с индикаторна хартия (3.10). Епруветката се запушва и се разклаща енергично в продължение на 1 min.

Ако е необходимо да се улесни екстрахирането на консервантите в ацетоновата фаза, сместа се нагрява леко до около 60 °С за стопяване на течната фаза.

Разтворът се охлажда до стайна температура и се филтрува през филтърна хартия (3.9) в конична колба.

20 cm3 (ml) от филтрата се прехвърлят в конична колба от 200 cm3 (ml), прибавят се 20 cm3 (ml) вода и се разбърква. рН на сместа се довежда до около 10 с 4 М калиева основа (2.9), като за измерване на рН се използва индикаторна хартия (3.10).

Прибавя се 1 g калциев хлорид (2.10) и се разклаща енергично.

Филтрува се през филтърна хартия (3.9) в делителна фуния от 250 cm3 (ml), съдържаща 75 cm3 (ml) диетилов етер, и се разклаща енергично в продължение на 1 min. Оставя се да се разделят слоевете и водният слой се излива в конична колба от 250 cm3 (ml). Етерният слой се отстранява.

Като се използва индикаторна хартия (3.10), рН на водния слой се довежда до около 2 с помощта на 4 М солна киселина (2.8). Прибавят се 10 cm3 (ml) диетилов етер (2.3), колбата се запушва и се разбърква енергично в продължение на 1 min. Оставя се да се разделят слоевете и етерният слой се прехвърля в ротационен изпарител (3.12). Водният слой се изхвърля.

Етерният слой се изпарява почти до сухо и остатъкът се разтваря в 1 cm3 (ml) диетилов етер (2.3). Разтворът се прехвърля в шишенце за проби (3.11).

4.2. Тънкослойна хроматография.

За всички стандартни разтвори и от проби, които ще се хроматографират, се нанасят със спринцовка (3.5) по около 3 l от разтвора на литиев карбонат (2.20) на еднакви разстояния върху стартовата линия на концентриращата зона на плаката за ТСХ (3.4) и се изсушава в ток от студен въздух.

Плаката се поставя върху нагревателната плоча (3.13), загрята до 40 °С, за да остават петната колкото е възможно по-малки. С микроспринцовка (3.5) се нанасят по 10 l от стандартните разтвори (2.18) и от разтвора на пробата (4.1) върху стартовата линия на плаката точно върху петната от литиев карбонат.

Накрая се нанасят по около 15 l от реактива за дериватизация (2.19) (2-бром-2'-ацетонафтон) отново точно върху петната, където са нанесени стандартните разтвори и разтворът на пробата, както и разтворът на литиев карбонат.

Плаката се нагрява в сушилня (3.7) при температура 80 °С в продължение на 45 min. След охлаждане плаката се поставя в хроматографската вана (3.2), която предварително е доведена до равновесие за 15 min (без да се прилага облицоване с филтърна хартия) с подвижната фаза (2.21). Плаката престоява, докато фронтът на елуента достигне разстояние 15 cm от стартовата линия (това може да отнеме приблизително 80 min).

Плаката се изсушава в ток от студен въздух и получените петна се разглеждат под УВ светлина (3.3). За засилване на флуоресценцията на бледите петна плаката може да се потопи в сместа течен парафин/n-хексан (2.22).

5. Отчитане на резултатите

Изчислява се Rf стойността на всяко петно.

Сравнява се Rf стойността и поведението при УВ облъчване на петната от пробата и петната от стандартните разтвори.

Прави се предварително заключение относно присъствието и идентичността на наличните консерванти. Провежда се ВЕТХ, описана в част Б, или ако се докаже пропионова киселина - газова хроматография, описана в част Б. Сравняват се получените времена на задържане с тези на стандартните разтвори.

Обобщават се резултатите от ТСХ, ВЕТХ или ГХ и на тази база се определя окончателната идентификация на присъстващите в пробата консерванти.
Б. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА БЕНЗОЕНА КИСЕЛИНА, 4-ХИДРОКСИБЕНЗОЕНА КИСЕЛИНА, СОРБИНОВА КИСЕЛИНА И САЛИЦИЛОВА КИСЕЛИНА
1. Принцип

След подкисляване пробата се екстрахира със смес от етанол и вода. След филтруване консервантите се определят посредством високоефективна течна хроматография (ВЕТХ).

2. Реактиви

2.1. Всички реактиви трябва да са с квалификация "чист за анализ" (ч.з.а), а където е необходимо с чистота "за ВЕТХ".

Използваната вода трябва да бъде бидестилирана или с еквивалентна чистота.

2.2. Етанол, абсолютен.

2.3. 4-хидроксибензоена киселина.

2.4. Салицилова киселина.

2.5. Бензоена киселина.

2.6. Сорбинова киселина.

2.7. Натриев ацетат (CH3COONa.3H2O).

2.8. Оцетна киселина (d420 = 1,05 g/cm3 (ml).

2.9. Ацетонитрил.

2.10. Сярна киселина, 2 М.

2.11. Калиев хидроксид, 0,2 М.

2.12. 2-метоксибензоена киселина.

2.13. Смес етанол-вода : смесват се девет обема етанол (2.2) и един обем вода (2.1).

2.14. Разтвор на вътрешен стандарт.

Приготвя се разтвор, който съдържа около 1 g с точност 0,001 g 2-метоксибензоена киселина (2.12) в 500 cm3 (ml) смес етанол-вода (2.13).

2.15. Подвижна фаза за ВЕТХ.

2.15.1. Ацетатен буфер: към 1 dm3 (l) вода се прибавят 6,35 g натриев ацетат (2.7) и 20,0 cm3 (ml) оцетна киселина (2.8) и се разбърква.

2.15.2. Подвижната фаза се приготвя чрез смесване на 9 обема ацетатен буфер (2.15.1) и един обем ацетонитрил (2.9).

2.16. Основен разтвор на консервантите.
Претеглят се с точност 0,001 g около 0,05 g 4-хидроксибензоена киселина (2.3), 0,2 g салицилова киселина (2.4), 0,2 g бензоена киселина (2.5) и 0,05 g сорбинова киселина (2.6) в мерителна колба от 50 cm3 (ml) и се долива до марката със смес етанол-вода (2.13). Разтворът се съхранява в хладилник и е стабилен в продължение на една седмица.

2.17. Стандартни разтвори на консервантите.

В серия от мерителни колби от 20 cm3 (ml) се поставят съответно 8,00; 4,00; 2,00; 1,00 и 0,50 cm3 (ml) от основния разтвор (2.16). Във всяка колба се прибавят по 10,00 cm3 (ml) от разтвора на вътрешен стандарт (2.14) и по 0,5 cm3 (ml) 2 М сярна киселина (2.10). Допълва се до марката със смес етанол-вода (2.13). Тези разтвори се приготвят непосредствено преди употреба.

3. Апаратура

Стандартно лабораторно оборудване.

3.1. Водна баня, нагласена на 60 °С.

3.2. Високоефективен течен хроматограф с УВ детектор с променлива дължина на вълната и 10 ml дозираща капиляра.

3.3. Аналитична колона.

Неръждаема стомана, дължина - 12,5 до 25 cm, вътрешен диаметър - 4,6 mm, пълнеж - Nucleosil 5C18 или еквивалентен.

3.4. Филтърна хартия, диаметър 90 mm, Schleicher & Schull, № 5892, бяла лента или еквивалентна.

3.5. Стъклени епруветки от 50 cm3 (ml) със запушалки на винт.

3.6. Стъклени шишенца за проби от 5 cm3 (ml).

3.7. Парченца карборунд за кипене, размер 2 до 4 mm или еквивалентни.

4. Процедура

4.1. Приготвяне на пробата.

4.1.1. Приготвяне на проба без добавяне на вътрешен стандарт.

В стъклена епруветка (3.5) от 50 cm3 (ml) се претегля 1 g от пробата с точност 0,001 g. С пипета в епруветката се прибавя 1,00 cm3 (ml) 2 М сярна киселина (2.10) и 40 cm3 (ml) смес етанол-вода (2.13). Прибавя се около 1 g карборунд (3.7), епруветката се затваря и се разклаща енергично поне 1 min, докато се получи хомогенна суспензия. За улесняване на екстракцията на консервантите в етанолната фаза епруветката се поставя във водна баня (3.1), нагласена на 60 °С точно за 5 min.

Епруветката се охлажда незабавно със студена вода и екстрактът престоява 1 h при температура 5 °С и се филтрува през филтърна хартия (3.4). Около 2 cm3 (ml) от екстракта се прехвърля в шишенце за проби (3.6). Екстрактът се съхранява при 5 °С и се анализира чрез ВЕТХ в рамките на 24 h от приготвянето.

4.1.2. Приготвяне на проба с добавяне на вътрешен стандарт.

В стъклена епруветка от 50 cm3 (ml) (3.5) се претегля 1 g от пробата с точност 0,001 g. С пипета в епруветката се прибавя 1,00 cm3 (ml) 2 М сярна киселина (2.10) и 30 cm3 (ml) смес етанол-вода (2.13). Прибавя се около 1 g карборунд (3.7) и 10,00 cm3 (ml) разтвор на вътрешен стандарт (2.14), епруветката се затваря и се разклаща енергично поне 1 min, докато се получи хомогенна суспензия. За улесняване на екстракцията на консервантите в етанолната фаза епруветката се поставя във водна баня при 60 °С точно за 5 min.

Епруветката се охлажда незабавно със студена вода и екстрактът престоява 1 h при температура 5 °С и се филтрува през филтърна хартия (3.4). Около 2 cm3 (ml) от екстракта се прехвърля във шишенце за проби (3.6). Екстрактът се съхранява при 5 °С и се анализира чрез ВЕТХ в рамките на 24 h от приготвянето.

4.2. Високоефективна течна хроматография.

Подвижна фаза: ацетонитрил/ацетатен буфер (2.15).

Скоростта на подвижната фаза през колоната се нагласява на 2,00,5 cm3 (ml)/min. Детекторът се настройва на 240 nm.

4.2.1. Стандартна крива.

В течния хроматограф (3.2) се дозират по 10 l от всеки от стандартните разтвори на консервантите (2.17). За всеки разтвор се определя отношението между височината на пиковете на изследваните консерванти към височината на пика на вътрешния стандарт, получени от хроматограмите. Построява се графика за всеки консервант, като се нанасят отношенията на височините на пика спрямо съответните концентрации на всеки стандартен разтвор.

Проверява се дали получените зависимости за всеки стандартен разтвор са линейни.

4.2.2. Определяне.

В течния хроматограф се дозират 10 l от екстракта на пробата (4.1.1) и се записва хроматограмата. Дозират се 10 l от стандартния разтвор на консерванти (2.17) и се записва хроматограмата. Сравняват се получените хроматограми. Ако в хроматограмата на екстракта на пробата (4.1.1) няма пик с приблизително същото време на задържане както това на 2-метоксибензоената киселина (препоръчвания вътрешен стандарт), в течния хроматограф се дозират 10 l от екстракта на пробата с добавен вътрешен стандарт (4.1.2) и се записва хроматограмата.

Ако на хроматограмата на екстракта от пробата (4.1.1) се наблюдава пречещ пик, който има време на задържане като на 2-метоксибензоената киселина, трябва да се избере друг подходящ вътрешен стандарт. (Ако един от изследваните консерванти отсъства от хроматограмата, този консервант може да бъде използван като вътрешен стандарт.)

Получените хроматограми на стандартния разтвор и на разтвора на пробата трябва да отговарят на следните изисквания:

- Разделянето на пиковете в най-лошо разделената двойка трябва да бъде не по-малко от 0,90 (за дефиниция на коефициента на разделяне виж фиг. 1).

Ако не е постигнато необходимото разделяне, трябва да се използва по-ефективна колона или друга по състав подвижна фаза, чийто подбор продължава до задоволяване на изискванията.

- Коефициентът на асиметрия (AS) на всички получени пикове трябва да бъде в интервала от 0,9 до 1,5 (за дефиниция на коефициента на асиметрия виж фиг. 2). Препоръчва се хроматограмата за определяне коефициента на асиметрия да се записва при скорост най-малко 2 cm/min.

- Базовата линия трябва да бъде стабилна.

5. Изчисления

За изчисляване на концентрацията на киселините-консерванти в разтвора на пробата се използват отношенията на височините на пиковете на изследваните консерванти към височината на пика на вътрешния стандарт (2-метоксибензоена киселина) от стандартната крива.
Фиг. 1. Коефициент на разделяне на пиковете
Фиг. 2. Коефициент на асиметрия на пика
Съдържанието на бензоена киселина, 4-хидроксибензоена киселина, сорбинова киселина или салицилова киселина се изчислява в % (M/M) (xi) по формулата:






където:

М е масата на изпитваната проба (4.1.2) в g;

М' - концентрацията на консерванта в екстракта на пробата (4.1.2), получена от стандартната крива, в g/cm3 (ml).

6. Повторяемост (Виж ISO 5725.)

За съдържание на 4-хидроксибензоена киселина 0,40 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,035 %.

За съдържание на бензоена киселина 0,50 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,050 %.

За съдържание на салицилова киселина 0,50 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,045 %.

За съдържание на сорбинова киселина 0,60 % разликата между резултатите от две успоредни определяния на една и съща проба не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,035 %.

7. Забележки

7.1. Резултатите от проведения тест за допустими отклонения от методиката показват, че количеството сярна киселина, която се добавя при екстракцията на киселините от пробата, е критично и границите за количеството на обработваната проба трябва да се поддържат в посочения интервал.

7.2. По желание може да се използва подходяща предколона.
В. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ПРОПИОНОВА КИСЕЛИНА
1. Област на приложение

Този метод е подходящ за определяне на пропионова киселина с максимална концентрация 2 % (M/M) в козметични продукти.

2. Дефиниция

Концентрацията на пропионова киселина, измерена по този метод, се изразява като % (M/M) от масата на продукта.

3. Принцип

След екстракция на пропионовата киселина от продукта определянето се извършва чрез газова хроматография с използване на 2-метилпропионова киселина като вътрешен стандарт.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация "за газова хроматография".

4.1. Етанол, 96 % (V/V).

4.2. Пропионова киселина.

4.3. 2-Метилпропионова киселина.

4.4. Ортофосфорна киселина, 10 % (M/V).

4.5. Стандартен разтвор на пропионова киселина.

В мерителна колба от 50 cm3 (ml) се претегля около 1,00 g (p) с точност 0,001 g пропионова киселина и се долива до марката с етанол (4.1).

4.6. Разтвор на вътрешен стандарт.

В мерителна колба от 50 cm3 (ml) се претегля около 1,00 g (М') с точност 0,001 g 2-метилпропионова киселина и се долива до марката с етанол (4.1).

5. Апаратура

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Газов хроматограф с пламъчно-йонизационен детектор.

5.3. Стъклена епруветка (2 x 15 сm) със запушалка на винт.

5.4. Водна баня, нагласена на 60 °С.

5.5. Стъклена спринцовка от 10 cm3 (ml) с мембранен филтър (диаметър на порите 0,45 mm).

6. Процедура

6.1. Приготвяне на пробата.

6.1.1. Приготвяне на проба без вътрешен стандарт.

В стъклена епруветка (5.3) се претегля около 1 g с точност 0,001 g от пробата (M). Прибавят се 0,5 cm3 (ml) фосфорна киселина (4.4) и 9,5 cm3 (ml) етанол (4.1).

Епруветката се затваря и се разклаща енергично. Ако е необходимо, епруветката се поставя на водна баня, нагрята до 60 °С (5.4) за 5 min за пълно разтваряне на липидната фаза. Охлажда се бързо на течаща вода. Част от разтвора се филтрува през мембранен филтър (5.5). Филтратът се хроматографира същия ден.

6.1.2. Приготвяне на проба с вътрешен стандарт.

В стъклена епруветка (5.3) се претегля 1 g с точност 0,001 g от пробата (M). Прибавят се 0,5 cm3 (ml) фосфорна киселина (4.4), 0,50 cm3 (ml) от разтвора на вътрешен стандарт (4.6) и 9,0 cm3 (ml) етанол (4.1).

Епруветката се затваря и се разклаща енергично. Ако е необходимо, епруветката се поставя на водна баня, нагрята до 60 °С (5.4) за 5 min за разтваряне на липидната фаза. Охлажда се бързо на течаща вода. Част от разтвора се филтрува през мембранен филтър (5.5). Филтратът се хроматографира същия ден.

6.2. Условия за газова хроматография.

Препоръчват се следните работни условия:

Колона

Тип - неръждаема стомана

Дължина - 2 m

Диаметър - 1/8"

Пълнеж - 10 % SPTM 1000 (или еквивалентна) + 1 % H3PO4 върху Chromosorb WAW 100 до 120 mesh.

Температура

Инжектор - 200 °С

Колона - 120 °С

Детектор - 200 °С

Газносител - азот

Скорост на потока - 25 cm3 (ml)/min.

6.3. Хроматография.

6.3.1. Стандартна крива.

В серия мерителни колби от 20 cm3 (ml) се поставят съответно 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 и 4,00 cm3 (ml) разтвор на пропионова киселина (4.5). Във всяка колба се добавя с пипета 1,00 cm3 (ml) от разтвора на вътрешен стандарт (4.6), доливат се до марката с етанол (4.1) и се разбъркват.

Приготвените по този начин разтвори съдържат М/ mg/cm3 (ml) 2-метилпропионова киселина като вътрешен стандарт (т.е. 1 mg/cm3 (ml) и р/4, р/2, р, 2р и 4р mg/cm3 (ml) пропионова киселина (т.е. 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 и 4,00 mg/cm3 (ml).

Инжектират се по 1 l от всеки от тези разтвори и се построява стандартна крива, като на абсцисата се нанасят отношенията на масите на пропионовата киселина към 2-метилпропионовата киселина, а по ординатата - отношенията на съответните площи на пиковете им.

За всеки разтвор се правят по три инжектирания и се изчислява средната площ на пиковете.

6.3.2. Определяне.

Инжектира се 1 l от филтрата на пробата 6.1.1. Получената хроматограма се сравнява с тези на стандартните разтвори (6.3.1). Ако пикът има приблизително същото време на задържане както 2-метилпропионовата киселина, се сменя вътрешният стандарт. Ако не се наблюдава пречене, се инжектира 1 l от филтрата на пробата 6.1.2 и се измерват площите на пика на пропионовата киселина и на пика на вътрешния стандарт.

Правят се три инжектирания за всеки разтвор и се изчислява средната площ на пиковете.

7. Изчисления

7.1. От стандартната крива, получена в 6.3.1, се отчита отношението на масите К, съответстващо на отношението на площите на пиковете, получени в 6.3.2.

7.2. От така полученото отношение на масите се изчислява съдържанието на пропионова киселина (x) в % (M/M), използвайки формулата:


 

 

0,5 x 100 x М'

 

М'

x %(M/M) =

К

--------------------

= К

----- ,

 

 

50 x M

 

M
1   ...   94   95   96   97   98   99   100   101   102


База данных защищена авторским правом ©obuch.info 2016
отнасят до администрацията

    Начална страница