Окислителната вреда върху биологичните молекули. Действията на антиоксидантните витамини



Дата17.09.2017
Размер151.02 Kb.


СУ “КЛИМЕНТ ОХРИДСКИ”

БИОЛОГИЧЕСКИ ФАКУЛТЕТ

КУРСОВА РАБОТА

ТЕМА:Окислителната вреда върху биологичните молекули.Действията на антиоксидантните витамини.

1.Увод

Балансът между окислителните форми и антиоксидантната система която елиминира техните последствия е от значителна важност за нормалното функциониране на клетъчните междуклетъчните системи.Живата клетка съществува в среда с нормално насищане с кислород(О2) ,който дори във физиологично състояние е възможно да формира активни частици,образувани от окислението на биологичните молекули-липиди,белтъци,полизахариди,нуклеинови киселини.Молекулният кислород,разтворен в тъканите е превърнат чрез редица метаболични реакции в активни кислородни частици(имат по-висока реактивност от О2):супероксиден радикал(О 2;);водороден пероксид (Н2О2 ),хидроксиден радикал(ОН . ).С…… кислород (1О2 )се генерира при взаимодействието на кислород с фоточувствителни молекули.Всички тези частици са оксиданти и могат да предизвикат необратими промени в структурата на нуклеиновите киселини(НК) и протеини при първоначалното окисление на Cys(цистеин),метионина(Meth),хистидин(His) и триптофановите остатъци,а също остатъци от много чувствителните и податливи на окисление липиди.В някои случаи активните кислородни частици инициират верижна реакция на липидна пероксидация(LP),в резултат от това се образува…..



Активните кислородни форми се генерират главно в мембраните на митохондриите,които вземат около 90% от вдишвания О2 .Около 1-2% от О2 се редуцира от митохондриалните ензимни …….. системи,като се образува главно ………радикал.Неговото наличие може да доведе до генериране на хидролен пероксид,който е едни от най-мощните неспецифични агенти.Голямото напрежение на процеси,свързани с образуването на свободни радикали(СР) в клетката и недостатъчно активната компенсационна система води до оксидативен стрес,а тук и до редица патологии:артрит,рак,исхемия,катаракт и мн.др.[2-7].

Така обкновено се смята че окислителните патологични резултати са налице,когато генерирането на ROS и ROS продукти надхвърлят възможностите на клетката да се защити.

При редица изследвания се наблюдава влиянието на антиоксидантните витамини върху образуването на свободни радикали.Заключенията(изводите) от тези изследвания за действието на антиоксидантите се правят възоснова на подходящи биомаркери на in vivo оксидативната вреда.

Аеробните организми обаче са развили множество механизми за защита от вредния ефект на ROS: 1)ензимни и 2)неензимни.

Главните активни участници в тези механизми са “антиоксидантите”-съставки които се срещат в клетките в малки концентрации и инхибират свободно радикаловото оксление.Такива са- витамин С [аскорбинова киселина],витамин Е [алфа-токоферол] и бета-каротен (схема 1).В защитата се включват и ензими като каталаза,супероксиддисмутаза(SOD) и поправящ ензим-ДНК-гликозиаза.
2.ОКИСЛИТЕЛНАТА ВРЕДА ПРИ ЛИПИДИТЕ

Липидната пероксидация(ЛП) е комплекс процеси, които зависят от много фактори, и се състои от взаимодействие на активни кислоридни частици с ацилни остатъци от мембраните липиди, различноплътностните липопротини и свободни PUFA.В биологичните системи ЛП е предстажена от 2 типа :

1. ензимни реакции на ЛП

2. автоокисление

ЛП се извършва чрез отделяне на водороден атом от метиленовия въглерод на полиненаситена мастна киселина(PUFA) или неина странична верига.Полученият въглероден радикал може да бъде подложен на молекулно пренареждане,последвано от взаимодействие с О2 и получаване на пероксиден радикал.

Активните кислородни частици иницират верижна реакция наЛП , като резълтат се образуват и алкокси липидни производни,а също се формипат и алдехиди. Алкоксилните и пероксилнлте радикали са доста активни и могат да участват в инициирането на свободни радикали.

Ако се пазгледа например окислението на арахидоничната киселина(клетъчната мембрана съдържа значително количестжо от нея).Под действието на мултиензимни комплекси, води до образуването на редица биологичноактивни метаболити.Първият ензим включващ метаболизма на киселината е фосфолипаза А2 По нататак той минава през 3 главни пътища:

1. Окислени под действие на прастагландиновата синтеза.Накрая в клетката се срещат две простагландин синтетазни изоформи. Едната от които иницира образуването на ендоензими.

2. Окислението се катализира липокиназата. Води до формирането на боилогично активни метаболити –левкотрипаени.

3. Води до формирането на епооксидни производни.

Продуктите от първоначалното липидно окисление могат да се образуват и без участие на ензими,чрез директно вз-вие с кислорода от въздуха т.нар.автоокисление.

В първият етап на ЛП вбиологичните системи се генерира супероксиден анион-радикал О2 Тои може да се образува и при други метаболитни реакции,например митохондриалната мембрана при дихателният цикъл.Една митохондрия от черен дроб на плъх може да произведе около 3*107 такива радикали .Може да се образува и под действието на ксантиноксидазата,и NAD(P)H оксидазата.

Значителни in vivo доказателства свързват липопротеиновото окисление с патогенезата.Окислените форми на LDL (нископлътностни липипротеини) са открити в поразени от атеросклероза места пти хората и животните.Докозано е ,че липифилните антиоксиданти забавят развитието на атеросклерозата при хиперхолестерични животни.

Увреждането започва с натрупване на натоварени предимно с LDL ‘фоамни’ клетки. Те се образуват,когато макрофагите от артериалната стена поемат ЛДЛ от плазмата,независимо от нископлътносните рецептори.Естествените ЛДЛ претърпяват оксидативно модификация под действието на свободни радикали.Следва натрупване на високо реактивни продукти в ЛДЛ.Те са силно цитотоксични и могат да увредят ендотелните клетки,позволявайки по този начин на циркулиращите моноцити и плазмените ЛДЛ да проникват в подендотелното пространство.Към увредения ендотел се прилепват тромбоцити, те отделят разтежни хормони,които стимулират

Мускулните клетки към пралиферация и надебеляване на атерома.

3.ОКИСЛИТЕЛНА ВРЕДА ПРИ БЕЛТЪЦИ

Доказателство ,че окислително модифицирани белтъци се акумулират с възраста и при различни болести като катаракт,атеросклероза, ит.н. фокусират вниманието вррхъ механизма и продуктете на белтъчно окислини.

С изключени на цистеина,аминокиселините(АК)не са поддатливи на окисление като PUFA(66).И затова се провеждат повече изследвания за ефекта на антиоксидантите върху ЛП.

Както и при липидите,и белтъчното окисление може да се генерират множество радикали (т.е.алкоксни ):различни пеактивни видове и устоичиви продукти.Показателите на белтъчното окисление вкючват :белтъчни карбонилни производни,окислени АК вериги,белтъчни фрагменти,и образувания от предварително глицифицирани краини продукти(AGE’s).

3.1.БЕЛТЪЧНО КАРБОНИЛНИ ПРОИЗВОДНИ

От различните индекси на белтъчно окисление образуването на карбанилните е най-добре изучено.(67). Концентрацията им се увеличава с взръста и различни заболявания(Алцхаймер).

Карбонилните се генерират от окислителното разцепване на главната пептидна верига или от окислението на верига със следната последователност:Arg,Lys,Pro,Theo[66,67].Могат да се генерират ио от алфа,бета-ненаситените алдехиди(HNE), формирани от ЛП.Карбонилнилте групи също могат да бъдат въвеждани в протеините от образувания между амино групата на лизина и някои диалдехидни продукти от ЛП(MDA);или редуцирани захари и техните окислени продукти.

Има разнообразие от начини,чрез които се формират карбонилните,но не всички зависят от дирекната окислителна модификация на белтъците.

Измерването им в сложните биологични молекули може да не е подходящо за измерването на директните ефекти от ROS.Но тъй като карбонилните обикновенно се формират чрез окисление би могло да се очаква ,че изследването на тази модификация ще бъде надежден показател на оксидативния стрес.

3.2.СТАБИЛНИ АМИНОКИСЕЛИННИ МОДИФИКАЦИИ

Въпреки факта,че продуктите от окислението на някои Ак вериги не са напълно характеризирани,някои стабилни модификации могат да бъдат предложени као биомаркери на оксидативната вреда върху белтъците.Такива са:метионинсулфоксид,2-оксо-хистидин,ортп- и мета-тирозин, дитиризин и 3-хлортирозин.(66,68-70).Определянето на окислените АК странични вериги в даден белтък е потенциално мощен инструмент,тъй като може да предостави специфична информация за участващите ROS .А те могат да ни насочат към пътища за защита .Пример за такъв специфичен показател е 3- хлортирозинът.Присъствието на тази модификация показва,че белтъкът е бил подложен на извлечена от миелопероксидация хипохлорна к-на.(68).Но разходите и сложността на този анализ в момента го ограничават.

3.3 ГЛИЦИРАНИ БЕЛТЪЧНИ ПРОДУКТИ

Смята се,че неензимните реакции на редуциране на захарите(глюкозата) и техните оксидативни продукти с белтъчни амино групи (реакция на Майлард) играят важна роля при стареенето и патологичните състояния.(66,67,71).

Белтъчните продукти от глицирането и гликоокислението се предлагат като биомаркери на оксидативния стрес.Но някои от тях стават проблем,тъй като се формират множество нестабилни съединения.Някои от AGE’s са идентифицирани: карбокси-метил-лизин(CML) и карбокси-етил-лизин(CEL);както и двуосновни’crosslinks’като пентосидин и глиоксал-лизин димери.(71-74).

Наскоро бе доказано,че аминогрупата във фосфолипиди като фосфатинетаноламин също могат да допринесът за формирането на AGE’s .(71,75).Доказано е също ,че CEL и CML ,и пентосидина увеличават колагена в кожата с напредването на възраста.Предполага се,че това се дължи на увеличената концентрация на глюкозата(70).

Въпреки,че измерването на AGE’s потенциално би могло да се окаже полезно, за сега е технически трудно.Това може частично да обясни защо няма надежни изследвания,които да изучават показателите на белтъчното окисление и влиянието на ‘антиоксидантните витамини’.Можеби ако се научи повече за специфичността на AGE’s могат да бъдат разработени имунохимични

Методи,които да позволят по-точно измерване на тези продукти в човешките тъкани и урина.

4.ОКСИДАТИВНА ВРЕДА ВЪРХУ ДНК

Като се има предвид ракът,вероятно най-важния обект за ROS e ДНК.На молекулярно ниво вредата върху ДНК може да варира в различни граници от окислени пуринови и пиримидинови бази, до значителни промени в ДНК като скъсване на нишката,обмяна на сестрински хроматиди,формиране на микронуклеоси.(2,77,78).Специфичните ДНК продукти се натрупват в зависимост от участващите ROS , степента на производство и способноста на клетката да защити и възтанови своята ДНК от окислението.

Определянето на окислените продукти в кръвта и урината се смята,че отразява общата степен на поражение.Докато измерването на оксидативнота вреда в достъпните тъкани(левкоцити,ендотелни клетки) отразява балансът между вредата и възтановяването(стабилното състояние-‘steady stage’).

5.ИЗСЛЕДВАНИЯ С АНТИОКСИДАНТНИ ВИТАМИНИ

Епидемологичните изследвания и клиничните опити изучават ефикасността на ‘антиоксидантните витамини’-вит.С, вит.Е и бета-каротен,върху различните заболябония,въвеждани както по отделно така и в различни комбинации.

В тези изследвания често се допуска,че антиоксидантите действат като нанасят по-малка оксидативна вреда,но тази теза не е напълно доказана.

Данните от диетата с вит.С,вит.Е и бета-каротен показват понижение на оксидативната вреда върху белтъци, липиди,ДНК.И те се базират на измерването на окислените биомаркери , не на резултат от заболяванията.

5.1.ИЗСЛЕДВАНИЯ ПРИ ЛИПИДИТЕ

Оценката на пероксидацията на PUFA става чрез измерване формирането на липидни прекиси или спрегнати двоини връзки(т.е.спрегнати липиди).(1).Именно тези индекси се използват интензивно при in vitro изследвания,обаче използването им е ограничено.

Окислителната вреда се отчита чрез TBARS анализ. Образуваните ендопероксиди при загряване в силно кисела среда се образуват малоналдехид(МДА).При вз-вие с ТВА(тиобарбитинова киселина) се образува цветно съединение.Анализът се основава на измерването на ТВА-МДА връзката и се осъществява чрез високоефективна течна хроматография(HPLC).При него липсва специфичност,но все още широко се използва паради това,че е евтин и лесен за изпълнение.

Като показатели се използват още МДА,HNE,F2-изопрени, етан и пентан.

5.1.1.Използването на TBARS анализа най-общо потвърждава хипотезата ,че дисбалансът между прооксидативния и антиоксидативния статус води до оксидативния стрес(9-13).Това допринася за развитието на атеросклерозата и рак,при тези пациенти.

Тестовете с пушачи показани на Тав.1,които са подложени на диета с вит.Е(280-600мг/ден) показват значително намаление на TBARS нивата в плазмата и урината.(9,10,12).

Например изследванията на Brown (10) покказват,че при диета с 280мг/ден вит.Е 10 седмици при пушачи,води до намаление на всички индекси на ЛП.

Обаче изследванията с вит.С отчитат само ограничени доказателства за намалението на TBARS нивата в плазмата. Взети заедно тези данни предполагат,че вит.Е и в по- малка степен вит.С са полезни при субекти изложени на хроничен оксидативен стрес,какъвто е цигареният дим.Излиза също,че диетата с антиоксидантни витамини,подпомага ограничението на оксидативния стрес и при непушачи.(Calenas[14]).

5.1.2.Освен МДА като индикатор в редица изследвания се използват и други алдехиди, например HNE (4-хидроксиноненал)(7).Количественото му определяне, както и на другите специфични алдехиди е технически трудно, и като резултат използването им като биомаркери е ограничено.HNE и MDA са имуногенетични, така,че имуноклоналните антитела разпознават алдехидните продукти в плазмата и белтъците.И тези тела се използват като маркери на липидното и белтъчно окисление.Антителата подготвени срещу HNE- и MDA-модификацирани протеини,разпознават ЛДЛ и другите окислени продукти(7,19).

Запознати сме само с едно изследване,при което се използват имуногенетични’endpoints’за проверка ефикасността на антиоксидантите Meraji[20]изследва плазмените нива на MDA(HPLC) и автоантитела към окислените ЛДЛ ,при здрави мъже.Преди и след 10 седмици от допълнението с бета-каротен(30мг/ден) или комбинация от вит.Е(400IU/ден) и бета-каротен(30мг/ден).Двете добавки намаляват плазмените нива на МДА,подсказвайки за,че предпазват от ЛП.От друга страна бета-каротена сам по себе си няма ефект върху плазмените нива на автоантителата.Интересно е,че наблюдаваното понижение в МДА нивата,след комбинирано тпетиране се асоциира с увеличение на циркулативните нива на антителата към окислените ЛДЛ.

Взети заедно тези данни са трудни за обобщение,тъй като в ЛП би могло да се очаква ако бъде съроводено от намаление на ЦАА.Така,че за момента не може да бъде използвано като надежден маркер на ЛП.

5.1.3. В последно време,количественото определяне на F2-изопростани се предлагат като надежден показател на генерирането на свободни радикали.(21,22).Те са изомери на простагландин и се получават от циклооксигеназата – независима пероксидация на арахидоничната к-на.

От всички простагландини,формиращи се in vivo 8-епи- или 8-изо-PGF22 е най-добре изследван и е относително стабилен.

На скоро Reilly[29] изследва нивата на 8-епи- PGF22 в урината при хронични пушачи преди и след кратка терапия с вит.Е иС (Тав.1) и не толкова страсни пушачи.Установява, че нивата на 8-епи-PGF22 значително намаляват (р<.05) при терапия само с вит.С в комбинация с вит.Е.

Вземайки, предвид факта,че лечението с аспирин(инхибитор на циклооксигеназата) неуспява да подтисне продукцията на 8-епи- PGF, по гарните данни са доказателство за полезния ефект на антиоксидантите върху ПОЛ при пушачите.

5.1.4 ИДИШВАНЕ ЕТАН/ПЕНТАН

Пероксидацията на п-3 и п-6 PUFA води до отделянето на етан и пентан;устойчиви газове ,които се отделят при дишането поотделно или в комбинация.Количеството на тези газове се увеличава с напредването на възрастта,тютюнопушенето,липсата на вит.Е и особено при исползването на успокоителни.Така измерването им се предлага като ефикасен и лесен начин за измерване на ЛП.

Зависимостта между състоянията на антиоксидантните витамини и нивата на етан/пентан не е била изследвана в детайли (таb 1.)(33-36).Hoshino (33) третира 13 пушачи с 800мг. на ден вит.Е в продължение на две седмици и отчита значително намаление на етан/пентан нивата.В друго изследване субектите се третират с комбинация от бета-каротен,вит.С и вит.Е (36).От всички тези данни следва че може би само вит.С и Е значително намаляват нивата на етан/пентан.

Така приемането на вит.С и вит.Е би могло да помогне за понижение на ЛП при пушачите.

5.1.5. LDL ОКИСЛЕНИЕ

Има множество изследвания за ефекта на антиоксидантите (в комбинация или поотделно) върху ex-vivo окислението на LDL ( таb 2)(12,13,15,30,46-59) с малки изключения се доказва че вит.Е има защитно действие върху окислението при малки клинични опити.От тестовете(62-65) става ясно че плазмения вит.С играе основна роля при предпазването на плазмените липиди от пероксидните радикали,полиморфнонуклеарните лефкоцити,супероксиди и пероксиди,желязо и цигарен дим.Вит.Е показва по-малка ефикасност от вит.С в предпазването на плазмените липиди.

5.2. ИЗСЛЕДВАНИЯ ПРИ ДНК

Измежду най-обещаващите биомаркери на оксидативната вреда при ДНК 8-охо-guanine (8-oxo-Gua).С 8-хидролизата на гуанина е една от най-честите модификация на ДНК базите наблюдавана при оксидативен стрес.(2).Това поражение може да се породи,или чрез директно окислиние на базата(чрез ОН или пероксинитрид),или чрез съединение на оксилен нуклеозид трифосфат(НТФ) с ДНК повреме на репликацията.Образуването на 8-охо-ГУА е мутагенно и потенциално канцерогенно събитие,тъй като окислената база е променила водородните връзки или ‘кодораната специфика’ на формираните основни двоики с аденина(А) вместо цитозина(Ц).Обратни мутации (Г в Т) се появяват в резултат на репликацията на модифицираната ДНК.

Днещните методи използват за измерването на продуктите на С8-хидролизата са 8-охо-ГУА и нуклеозидите (8-оксод-Г).Те вкючват изолациата на ДНК и смилане (за клртки и тъкани)или множество фаси на екстракция(за урината) преди количественото измерване на продукта. А то става чрез газова хромотография(Г-Ц)/масово спектроскопия(МС);селективно йонно наблюдение или HPLC След това става УВ или електрохимична детекция. Тези 2 аналитични метода дават напълно различни абсолютни стоиности за 8-охо-ГУА или 8-оксод-Гв една и съща тъкан.

Методологичните проблеми свързани с това наблюдение са едва напоследък изяснени и включват окисление по време на подготовката за анализ,Също е важно да се отбележи ,че има конфликтни мнения относно надеждността на тези биомаркери(80,81).Тъй като изучаването им изисква допускането на много параметри:репликация на ДНК,роля на умиращите клетки и т.н.

Алтернативен подход към детерминирането на окислените ДНК бази използва репарационни ензими(ендонуклеаза-3) за разрушаване на веригата на места където има окислени бази(82).Нарушенията в структурата на ДНК в единични клетки(лимфоцити) могат да бъдат изчислени чрез електрофоретични техники,тъй като нарушенията в нишката на ДНК са податливи на разширение,като се осигури ел.поле.Така интензитета на флуоресцентно оцветената ДНК в разширенията (“конски опашки”) могат да бъдат полуколичествено установени и използвани като индекс на ОВ.Този метод може да се окаже полезен тъй като може да се използва за изследване на индивидуална клетка.

5.2.1 ОБЩА СТЕПЕН НА ВРЕДА ВЪРХУ ДНК БАЗИТЕ

Доказателство за ролята на антиоксидантните витамини в предотвратяването на рака идва първоначално от епидемологичните изследвания(4).

Съвременните тестове,използващи биомаркери на ОВ върху ДНК(net rate) за мутационни и патогенни събития не отговарят на първоначалните (таb.3)(83-86).

Например в един placebo-контролиран опит на Prieme(86) не установява никакъв ефект.Изследването се основава на двумесечна диета с вит.Е (100мг. два пъти дневно),вит.С(250 мг. два пъти дневно или Q-ензим 30мг. два пъти дневно) при пушачи.Тези резултати отговарят на по-ранните,които изследват връзката между уринарната секреция на 8-оксод-Г със и/или плазмената концентрация на бета-каротена,вит.С и вит.Е.

5.2.2 УСТОЙЧИВО СЪСТОЯНИЕ НА УВРЕДЕНИТЕ ДНК БАЗИ.

Обратно на изследванията “net rate”,”steady state”оценките на окислението дават потвърждение за ролята на антиоксидантите в предпазване от икислително ДНК увреждане(тав.3). При тези опити се прави “comet”анализ,който използва разширена ДНК нишка като специфично се откриват окислени пиримидинови бази.Duthie (87) открива,че допълването на диетата на пушачи и непушачи с вит.С (100мг/ден) , вит.Е (280мг/ден) и бета-каротен(25мг/ден),значително редуцира вредата на ДНК базите при лимфоцитите.

Fraga [88] също показваче допълнинието с вит.С намалява оксидативните увреждания.Anderson[16] обаче неуспява да открие значителен ефект на вит.С(60мг или 6г/ден за 14 дни).

Правени са още много изследвания от различни автори(Podmore[89];Rehman[90]),които също представят прооксидативния ефект на вит.С,данните обаче са противоречиви.Нивата на двата показателя се повлияват твърде различно.Това показва,че действието н авит.С не е напълно доказано.Тези изследвания под чертават несъответствията свързани с количественото определяне и/или валидността на текущите in vivo биомаркери на оксидативната вреда върху ДНК.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно е,че свободните радикали са доректно включени в патогенезата.Присъствието им нарушава нормалното функциониране на клеткета и води до различни патологии в организма(исхемия,прекламсия,рак и др.)

Концентрацията им може да се увеличи в случай на недостатъчна активност на антиоксидантната система.Това води до повишаване на оксидативния стрес върху биологичните молекули,промяна в посоката на боисинтеза.

Подходящите биомаркери на in vivo оксидативната вреда са доказазани трудно.Както трябва да бъде очаквано , има сравнително малко сигурни показатели на in vivo окислението.Правят се изследвания използващи тези маркери за оценка ефикасността от допълването с бета-каротен и/или антиоксидантни витамини.

От представените данни излиза,че при непушачите и пушачите,диетата с вит.Е и можеби вит.С,редуцира окислителния стрес при липидите.Обратно, бета-каротена има малък защитен ефект.Изследванията на LDL ex vivo окислението съдържателно показват действието на вит.Е,а in vivo смисълът е под въпрос.

Антиоксидантните диети при човека изглежда,че нямат ефет върху “net rate”оксидативна вреда при ДНК.Но вит.С диетата намалява “stesdy state’нивата на 8-охо-ГУА в клетъчната ДНК.Няма валидни данни за ефекта на антиоксидантите върху белтъците.

Дозите от вит. Е(100мг/ден)и вит.С(1000мг/ден)редуцурат повечето показатели на ПОЛ при пушачите и непушачите,без изключение.Количеството им е много по-високо от присъстващите RDA’s за тези витамини (съответно 60мг и10 мг).Тъй като по голяма част от изследванията не се опитват да дефинират оптимална доза за защита,вероятно това количество е по-ниско от използваното, които също са доказано ефективни.

Все още има много неизяснени въпроси относно действието на антиоксидантните витамини върху оксидативния стрес,и съответно различните заболявания,но с развитието и утвърждаването на по-добри индекси на in vivo окислението ще бъде утвърдена оптималната концентрация на антиоксидантите в плазмата и различните тъкани.А това ще доведе може би до по-ефикасно лечение на редица сериозни заболявания.

ЛИТЕРАТУРА

“Can antioxidant vitamines materially reduce oxidative damage in humans”,Mark McCall,1998.

“Vitamine E as a universal antioxidant and stabilizer of biological membranes”,12.1998.

“Antioxidant ensyme levels in cancer”,1997-Hystology and hystopatology.

ПРИЛОЖЕНИЯ





База данных защищена авторским правом ©obuch.info 2016
отнасят до администрацията

    Начална страница