ОТЧЕТ ЗА
Експериментално изследване
на хранителна добавка “МАОЛО”
върху мъжки и женски бели мишки след перорално прилагане и ин витро изследване за цитотоксичност
по договор от 03.07.2009 между Агенция по качество и безопасност на стоките – СМИЛО ЕООД и Фармацевтичен факултет на МУ- София
ПРОИЗВОДИТЕЛ: СМИЛО ЕООД, София, България
ДАТА : 20.07.2009
СЪДЪРЖАНИЕ
1. Въведение 4
2. Материали и методи 4
2.1. Материали и методи 4
2.2. Изследване за остра токсичност 5
2.2.1. Лабораторни животни 5
2.2.2. Наблюдавани параметри 6
2.2.3. Статистика 6
2.3. Изследване за цитотоксичност 7
2.3.1. Клетъчни култури 7
2.3.2. MTT-тест 7
2.3.3. Статистика 8
3. Резултати 8
3.1. Остра токсичност 8
3.1.1. Смъртност на животните 8
3.1.2. признаци на интоксикация 8
3.2. Изследване за цитотоксичност 9
4. Изводи 10
5. Литература 11
|
|
ТЕМА
|
|
Експериментално изследване на хранителна добавка “МАОЛО” върху мъжки и женски бели мишки след перорално прилагане и ин витро изследване за цитотоксичност
|
СПОНСОР
|
|
|
“Агенция по качеството и безопасност на стоките – СМИЛО” ЕООД, гр. София, ж.к. “Яворов” бл. 23, вх. 1 ап. 3., представлявано от д-р Атанас Смилов Смилов
|
ИЗследоватеЛИ
|
|
Доц. доктор Н. Данчев, дм
Гл.ас. доктор Георги Момеков, ДФ
Гл.ас. доктор И. Николова, дм
M. Йорданова - лаборант
М. Томова – техн. сътрудник
|
|
|
ИЗследователски центЪр
|
|
Катедра “Фармакология, фармакотерапия и Токсикология”
Фармацевтичен Факултет
София, България
Ул. Дунав 2
1000 София, България
Тел:+3592-9236582
e-mail: nikolai.danchev@gmail.com
|
1. Въведение
От фирмата “СМИЛО” ЕООД беше предоставена следната хранителна добавка в твърди желатинови капсули за изследване на остра токсичност след перорално прилагане на мъжки и женски бели мишки и ин витро изследване за цитотоксичност:
2. Материали и методи 2.1. Материали и методи
2.1.1. Хранителна добавка МАОЛО®:
Състав – растителни екстракти от:
Hibisci sabdariffae flos. 40 mg
Pinus sibirica DuTour 25 mg
Curcumae longae/xnthorrhizae rhizomа 18 mg
Origanum majorana 15 mg
Elettaria cardamomum 12 mg
Crocus sativus 10 mg
Artemisia dracunculus 10 mg
Coriandrum sativum
Levisticum officinale
Petroselinum crispum/neapolitanum
Hyssopus officinalis
Lichen islandicus < 4 mg
Помощни вещества: сорбитол, лактоза, силициев диоксид.
2.2. Изследване за остра токсичност 2.2.1. Лабораторни животни
За определяне на острата токсичност на продуктите бяха използвани 36 бели мишки линия Н – (18 мъжки и 18 женски) с тегло 18–20 g, получени от развъдника на БАН в Сливница, България. Мишките бяха разделени на 4 групи по 9 животни във всяка.
До началото на експеримента, животните бяха държани в продължение на една седмица във вивариума на Фармацевтичен Факултет, регистриран като животновъден обект, за да се аклиматизират, като беше поддържан режим на отглеждане и хранене както в развъдника. Всички използвани в експеримента животни бяха здрави и без каквито и да било физиологични отклонения.
Вид
|
мишки
|
Порода
|
Линия Н
|
Възраст (до експеримента)
|
8-10 седмици
|
Телесна маса
|
18-20 g
|
Пол
|
мъжки и женски
|
Брой животни
|
18
|
Храна
|
стандартна, сертифицирана
|
Пиене
|
вода, автопоилки
|
Температура на въздуха
|
20 – 24оС
|
Влажност
|
30-70%
|
Осветление
|
до 325 лукса на разстояние 1 м oт пода; 12 часов режим на светлина/тъмно
|
Шум
|
до 85 дБ
|
Път на въвеждане на изследваните вещества
|
перорален
|
Продължителност на въвеждането
|
еднократно
|
Продължителност на наблюдението на всяко животно
|
14 дни
|
Вид на разтворите
|
водни разтвори
|
Статистически метод на обработка на данните
|
ISO 10993 – 11 и Eur. Ph. – 4 ed.
|
За определяне на средната летална доза (LD50), изследвания продукт беше разтварян в изотоничен (0.9%) разтвор на натриев хлорид и въвеждани перорално, еднократно в обем 0.2 мл/10 г телесна маса. През първият ден след въвеждането всяко животно бе наблюдавано непрекъснато за общо състояние, промяна в поведението, интензивност и характер на двигателната активност, наличие и характер на гърчове, координация на движенията, тонус на скелетната мускулатура, реакция към тактилни, звукови и светлинни дразнители, честота и дълбочина на дишането, състояние на на кожата и космената покривка, положение на опашката, количество и консистенция на фекалиите, честота и цвят на урината. Всяко животно бе наблюдавано в продължение на 14 дни. Всички животни (умрели и останали живи след 14ия ден) се подлагат на патологоанатомично изследване.
Изследването за остра токсичност и обработката на получените данни е по метода ISO 10993 – 11 и Eur. Ph. – 4 ed.. Този метод е одобрен от ЕМЕА, отговаря на изискванията на Евросъюза и при него се използват малко на брой животни с оглед спазване на етичните и екологичните изисквания. .
При провеждането на експеримента, екипът се ръководеше от хуманно отношение към животните в съответствие с международните препоръки, както и в съответствие с препоръките на Етичния Комитет към МУ, София, България за използване и работа с лабораторни животни.
2.2.2. Наблюдавани параметри
Гибел на животните: леталитета се отчиташе ежедневно.
признаци на интоксикация: през първият ден животното се наблюдава постоянно за първични признаци на интоксикация; в следващите дни животните се наблюдават ежедневно за признаци на интоксикация.
2.2.3. Статистика
Обработката на получените данни за остра токсичност е по метода ISO 10993 – 11 и Eur. Ph. – 4 ed..
2.3. Изследване за цитотоксичност 2.3.1. Клетъчни култури
Човешката клетъчна линия HT-29 е закупена от Немския център за онкологични изследвания (DKFZ, Хайделберг, Германия). Клетките са култивирани в стерилни култивационни матрачета при стандартни условия (37°C, 5% CO2) в хранителна среда RPMI-1640 обогатена с L-глутамин и 10% фетален телешки серум. За поддържане на клетъчните култури в експоненциална фаза на растеж, 20% от клетъчната суспензия се отнема и се добавя 30% пълноценна среда, след отлепване от дъното на матрачето, последством обработка с трипсин (5-7 min при 37С) 2-3 пъти седмично.
2.3.2. MTT-тест
MTT-тестът се базира на редукцията на жълтото тетразолово багрило (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2H-тетразолиевия бромид (MTT) под действие сукцинатдехидрогеназите на функционално-интактните митохондрии на виталните клетки. Сукцинатдехидрогеназите катализират редукцията на до синьо-виолетови формазанови кристали. Процедурата бе проведена по класическия метод на Мosmann (1983), с някои модификации (Konstantinov et al, 1999). Клетките бяха поставени в 96-ямкови микроплаки при гъстота 1104 клетки/ямка и оставени да се адаптират в продължение на 24 ч преди добавянето на тестваното съединение. Разтворите на тествания продукт бяха приготвени непосредствено преди третирането (в DMSO) и подложени на серийно разреждане с хранителна среда RPM1640. 72 ч след третирането бе добавен разтвор на МТТ (в PBS) така, че крайната концентрация на реагента в хранителната среда бе 0.5 mg/ml. След 4 ч получените формазанови кристали бяха разтворени посредством добавяне на 5% HCHO в изопропанол. Абсорбцията бе измерена с помощта на вертикален спектрофотометър за отчитане на микроплаки (Labexim LMR-1) при 580 nm.
2.3.3. Статистика
Есприменталните данни са прдставени като средна аритметична стойност ± стандартно отклонение (SD). Статистическата значимост е оценена с помощта на t-test, при P 0,05 възприето за ниво на достоверност.
3. Резултати 3.1.1. Смъртност на животните
Получените данни представени на таблица 1, не позволяват да се определи стойността на средната летална доза - LD50 при еднократно перорално приложение на мъжки и женски животни, т.к. дори в най-високата доза от 10 g/kg т.м. не се наблюдава леталитет на мишките:
МАОЛО
-
Доза mg/kg
|
Път на въвеждане - перорален
|
Мъжки мишки
(умрели/живи)
|
Женски мишки
(умрели/живи)
|
5000
10000
|
0/9
0/9
|
0/9
0/9
|
3.1.2. признаци на интоксикация
Не са наблюдавани признаци на интоксикация през първите 24 часа, освен известно потискане на мускулния тонус, който се проявява между 2ия и 4ия час след инжектирането. По-нататъшна промяна в мускулния тонус не е наблюдавана. Не са наблюдавани промени в размера на зениците, положението на опашката, координацията на движенията, поведението, лакримация и саливация. Пероралното въвеждане на разтворите не променя честотата и дълбочината на дишането, не променя честотата и консистенцията на фекалиите, както и не се променя количеството, цвета и прозрачността на урината.
При патологоанатомичните изследвания не са установени макроскопски изменения на вътрешните органи.
3.2. Изследване за цитотоксичност
Цитотоксичността на МАОЛО е проучена върху човешката клетъчна линия (HT-29), която е валидирана моделна система, репрезентативна за клетките от чревния епител - клетъчна популация, която нормално е изложена на високи концентрации ксенобиотици при перорален прием. Резултатите от проведеното проучване за антипролиферативна и цитотоксична активност на МАОЛО са представени на таблица 2.
TAБЛИЦА 1. Проучване на цитотоксичната активност на МАОЛО върху HТ-29 клетки.
-
Концентрация (mg/ml)
|
% Витални клетки
|
0
|
100,0 ± 5,6
|
0,0125
|
101,2 ± 4,4
|
0,025
|
102,1 ± 2,5
|
0,05
|
100,5 ± 1,7
|
0,1
|
99,3 ± 4,1
|
0,2
|
97,8 ± 4,7
|
Както се вижда от представените данни, в условията на подбраната експериментална система (72 ч непрекъсната експозиция, концентрация на тестваните продукти от 0,125 до 0,200 mg/ml) изследваният продукт МАОЛО® не повлиява жизнеността и пролиферативната активност на проучваната клетъчна линия. Дори при най-високата изследвана концентрация (съответстваща на 0,103 mg/ml активни субстанции) не се наблюдава статистически значимо намаляване на виталността на клетките, в сравнение с нетретираната контрола.
4. Изводи
Хранителната добавка МАОЛО беше изследвана за остра токсичност при мишки и ин витро за цитотоксичност при модел на чревен епител.
Съгласно ISO 10993-11, LD50 стойността представлява количеството материал даван еднократно, който предизвиква гибел на 50% от третираните с тестваното вещество животни. Тази стойност позволява да се определи краткосрочния токсикологичен потенциал (остра токсичност) на изследваните субстанции, при определен път на въвеждане в случая перорално, който е бъдещия път на прилагане на добавките при хора. При определяне на острата перорална токсичност беше установено, че LD50 на МАОЛО е > 10 000 mg/kg т. м. По класификацията на Hodge и Sterner тази стойност се отнася към клас V, т.е. към групата на практически нетоксичните вещества, след перорално прилагане на бели мъжки и женски мишки.
Получените резулати за цитотоксичност дават основание да се направи заключение, че хранителна добавка МАОЛО® е нетоксичeн продукт по отношение на човешка клетъчна линия - модел на чревен епител ин витро дори при прилагане във супрафизиологични концентрации.
В заключение, предоставеният от “Агенция качеството и безопасност на стоките – СМИЛО” ЕООД продукт - хранителна добавка МАОЛО е практически нетоксична при перорално приложение върху мъжки и женски бели мишки и не проявява цитотоксичност при ин витро модел на чревен епител (клетъчна линия HT-29).
20.07.2009 Подпис:
Доц. доктор Н. Данчев, ДМ, Зав. Катедра “Фармакология, Фармакотерапия и Токсикология, Фармацевтичен култет, София
Гл. ас. доктор Герги Момеков
Гл.ас. доктор И. Николова, ДМ
Медицински лаборант М. Йорданова
Hodge HC, Sterner JH. Tabulation of toxicity classes. Am. Ind. Hyg. (1949) 10:93 –96.
ISO. 2006. Biological Evaluation of Medical Devices - Part 11: Tests for SystemicToxicity
(First edition 1993-12-15). ISO 10993-11. Geneva:International Organization for
Standardization (ISO
Eur. Ph. – 4 ed..Testing for acute systemic toxicity. Strasbourg, France: Council of Europe - European Directorate for the Quality of Medicines, 1999.
Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Meth. 1983; 65 (1-2): 55–63.
Konstantinov S.M., Eibl H., Berger M.R. BCR-ABL influences the antileukemic efficacy of alkylphosphocholines. Br. J. Haemato.l 1999; 107 (2): 365-374.
с.
Сподели с приятели: |