Имунохистохимично изследване

Имунофенотипизация чрез флоуцитометрия

1. 
   Лаборатория, която оформя окончателна диагноза при лимфоидни неоплазии трябва да е в състояние да идентифицира и характеризира имунофенотипно чрез флоуцитометрия неопластично разраснали хемопоетични клетки от различни линии на лимфоидна диференциация или да има добре функциониращ механизъм за връзка с флоуцитометрична лаборатория, осъществяваща имунофенотипизацията.
   

1. 
   Всеки биологичен материал, изпратен за имунофенотипизация, трябва да бъде изследван морфологично и при необходимост – цитохимично.
   
2. 
   Всяко несъответствие между данните от морфологичното и имунофенотипното изследване следва да бъде изяснено.
   

2. 
   За имунофенотипизация чрез флоуцитометрия към диагнозата на лимфоидни неоплазии, проби за изследване се препоръчва да бъдат получени от периферна кръв или костен мозък, и по изключение от ликвор, малигнени изливи, свеж материал от лимфни възли или туморни формации след изготвяне на клетъчна суспензия.
   

1. 
   При имунофенотипизация на клетъчни суспензии, изготвени от лимфен възел, слезка или туморна формация трябва да се има предвид, че не могат да бъдат оценени топографските характеристики на изследваните популации и не винаги е възможно отграничаване на примеса от нормални резидуални и реактивни лимфоидни клетки. Интерпретацията на резултата изисква особена предпазливост и тясна колаборация с морфолог.
   
2. 
   При имунофенотипно изследване чрез флоуцитометрия на материал от клетъчни суспензии, изготвени от лимфни възли и други органи, задължително се провежда хистологично изследване на същия клиничен материал.
   
3. 
   При несъответствие на данните от имунофенотипното изследване чрез флоуцитометрия на материал от клетъчни суспензии, изготвени от лимфни възли и други органи, и хистологичното изследване на същия клиничен материал, за показателен се приема хистологичният резултат, съчетан с имунохистохимично изследване.
   
2. 
   Имунофенотипизация на лимфоидни неоплазии чрез флоуцитометрия предоставя възможност за бързо, чувствително и възпроизводимо определяне на имунофенотипа на неопластичната популация в част от нозологичните субтипове:
   
   1. 
      имунофенотипизацията чрез флоуцитометрия е диагностичен подход от първа линия (заедно с морфологията) при прекурсорни лимфобластни левкемии, хронична лимфоцитна левкемия, трихолевкозата, пролиферациите от големи гранулирани лимфоцити, като значимо повишава диагностичната прецизност и възможностите за отграничаване от други лимфопролиферативни процеси, и по този начин дава съществена информация за по-нататъшното клинично поведение.
      
   2. 
      имунофенотипизацията чрез флоуцитометрия има по-ограничено приложение за първоначално диагностициране на плазмоклетъчни дискразии или миелом, но е практически полезна за валидиране на диагнозата и проследяване
      
   3. 
      имунофенотипизацията чрез флоуцитометрия не е показателна за определяне на неопластичната популация при болни с Ходжкинов лимфом
      
   4. 
      имунофенотипизация на периферна кръв се препоръчва при възрастни с неясна персистираща лимфоцитоза преди костно-мозъчно изследване
      
   5. 
      имунофенотипизация на периферна кръв не се препоръчва като скринингово изследване за лимфопролиферативно заболяване при липса на абсолютна лимфоцитоза, морфологични данни за абнормни лимфоидни клетки или спленомегалия
      
   6. 
      при вземане на материал от костен мозък за стадиране на болни с лимфоми е уместно отделяне на част от него за евентуално имунофенотипно изследване чрез флоуцитометрия.
      
3. 
   Имунофенотипизиране на лимфоидни неоплазии с флоуцитометрия трябва да се провежда минимум с валидирана двуцветна имунофлуоресценция (4-параметърна флоуцитометрия). С използването на 5- или 6-параметърен анализ се увеличава възможността за идентифициране и характеризиране на абнормна популация в рамките на хетерогенната проба.
   
4. 
   Лаборатория, която провежда флоуцитометрия при болни с неоплазии на лимфоидната тъкан, трябва да разполага с оптимален панел от антитела за имунофенотипизация (Табл. 3.).
   

Консенсусен задължителен панел за диагноза на остри левкемии

За бърза ориентация и проби с нисък клетъчен брой

cCD3, MPO, cCD79a, TdT CD7, CD2, CD10, CD19, CD22 (s or c), sIg, CD13, CD33, CD34 CD45 за „определяне на гейта за анализ”

За определяне на линия на диференциация и подгрупи (на базата на адаптирана стратегия за определяне на гейт)

HLA DR, CD1a, CD4, CD5, CD8, CD3 (m), IgM (c), CD14, CD117, CD56, CD65, (CD41, CD61, CD238, CD36).

Панел за остри левкемии – други полезни маркери

Kappa/Lambda: (i) мембранни за определяне на клоналност, (ii) цитоплазмени за редки случаи на B-IV ОЛЛ CD58: за отграничаване на нормални регенериращи B-клетки и B-клетъчни бласти CD99 : за отграничаване на бластни и нормални T-клетки CD123 : IL-3 R, при pDC и ОМЛ, някои NK TCR вериги при T-ALL, c и/или s Терапевтични таргети: CD20, CD52, CD45, CD33, CD123, CD87, CD44, uPAR (CD87)/ uPA(CD116) Tези панели са предвидени за диагностични цели при остри левкемии. За проследяване на минималната резидуална болест в хода на терапията може да е необходимо допълването им.

--Задължителен панел за хронични лимфопролиферативни заболявания

Клинични проби от: периферна кръв, костен мозък, ТАБ от лимфен възел • Маркери за определяне на гейта: CD19, CD3, CD56* • B-клетъчно ориентиран панел, основан на гейт на CD19 : CD5, CD20, CD22, CD23, CD103, FMC7, CD10, K, L, Ig, CD25, CD79b, CD38 • T-клетъчно ориентиран панел, основан на гейт на CD3 (или друг Т-клетъчен маркер): CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD7 *Внимание : CD56 има по-широка специфичност извън рамките на NK – линията; *Аберантните панели са полезни за проследяване в хода на терапията

Допълнителни маркери при хронични лимфопролиферативни заболявания

• B-клетъчно ориентирани: CD2, CD7, CD123, CD138, DR, CD24*, CD43, Ig(G, A, M, D), CD81* Цитоплазмени : Bcl2, Zap70 (съпоставен с вътрешна контрола) • T-клетъчно ориентирани: TCRs*, CD30, CD10 • NK-клетъчно ориентирани, на базата на които да се изключат CD19+ и CD3+/ CD56+ клетки : CD57, CD16, CD94, perforin, granzyme B Липса на CD24 при маргинално-зонови лимфоми и трихолевкемия *CD81/CD22 представлява полезна комбинация за проследяване на ХЛЛ на базата на ниски нива на ко-експресия

Маркери при мултиплен миелом

CD38, CD19, CD138, CD56, CD45 Цитоплазмени леки вериги Цитоплазмени тежки вериги

Съкращения: c – цитоплазмен; m или s – мембранен; pDC – плазмацитоидни дендритни клетки; К - kappa леки вериги; L – lambda леки вериги

2. 
   Тест панелът следва да бъде подбран така, че да включва поне един антиген с ярка експресия върху повечето клетки в пробата, какъвто е CD45.
   
3. 
   Като отрицателна контрола на неспецифичното свързване на антителата трябва да се използуват контролни изотипни антитела, специфични спрямо антигени, които не се срещат и не могат да бъдат индуцирани в тъкани на бозайници, конюгирани със съответните флуорохроми.
   
4. 
   Резултатите при повтарящо се антитяло (антитела) в рамките на тест панела на пациента трябва да са устойчиви (в границите на 5%), освен ако рутинно не се получава по-голяма разлика, поради използването на различни флуоресцентни маркери или антитела, разпознаващи различни антигенни епитопи, което се препоръчва да бъде отразено в резултата.
   
5. 
   Резултатите се представят като процент положително маркирани клетки в електронния прозорец на предполагаемите неопластични клетки и включва коментар за линейната принадлежност и степен на съзряване.
   
   1. 
      При получаване на абнормална реактивност (по-висок или по-нисък интензитет на светене от наблюдавания върху нормални клетки, аберантно съчетаване на линейно-асоциирани антигени и др.) резултатът би трябвало да включва и описание (слабо или с нисък интензитет и/или ярко или с висок интензитет, линейно-кръстосана или асинхронна експресия и т.н.).
      

1. 
   Хромозомният лентов анализ се основава на морфологичното характеризиране на хромозоми в оцветени метафазни фигури, получени от малигнени клетки, претърпяли деление in vivo (директен метод) и/или след култивирането им in vitro (индиректен метод).
   
2. 
   Методът позволява едновременно доказване на бройни и структурни хромозомни аберации, и служи за установяване на глобалните промени в кариотипа на малигнената популация.
   
3. 
   Анализът изисква жизнеспособни клетки от свеж материал от костен мозък, периферна кръв или лимфни възли.
   
   1. 
      За постигане на оптимални резултати материалът за изследване (костномозъчен аспират или част от свеж биопсиран лимфен възел) се транспортира до цитогенетичната лаборатория след предварително съгласуване възможно най-бързо в стерилна среда за тъканни култури.
      
   2. 
      При изследване на лимфен възел или друга туморна тъкан е необходимо изготвяне на клетъчна суспензия чрез механична дезагрегация със стерилен скалпел или игла.
      
   3. 
      Оптимални резултати се получават след кратковременно култивиране в среда RMPI 160, обогатена с 10–20% фетален телешки серум, ако е проведено в деня на вземане на материала.
      
   4. 
      При изследване на материал от лимфопролиферативни заболявания с нисък спонтанен митотичен индекс и ниска чувствителност към рутинно използваните митогени (ХЛЛ, зрялоклетъчни лимфоми), оптимални резултати се постигат чрез стимулиране чрез TPA и EBV.
      
4. 
   При кариотипизация на лимфоми трябва да се има предвид, че липсата на видими хромозомни аберации в повечето случаи не изключва наличието на клонални генетични промени в малигнената популация, а по-скоро отразява невъзможността те да бъдат доказани чрез използваната техника на лентово оцветяване. В част от случаите това е свързано с ниския пролиферативен индекс на малигнените клетки и примеса на нормални резидуални и реактивни миелоидни клетки. Интерпретацията на резултата изисква особена предпазливост и опит.
   
5. 
   При цитогенетично изследване на материал от клетъчни суспензии, изготвени от костен мозък, лимфни възли и други органи, задължително се провежда морфологично (цитологично и/или хистологично) изследване на същия клиничен материал.
   
6. 
   За да се приемат промените в кариотипа като клонални е необходимо наличие на поне две клетки с идентични структурни промени или с наличие на допълнителна хромозома, или на три клетки със загуба на една и съща хромозома.
   
7. 
   Описанието на установения кариотип се представя съгласно изискванията на International System for Human Cytogenetic Nomenclature (1995).
   
8. 
   Изследването е задължително при прекурсорни лимфобластни левкемии (ОЛЛ). Поради висок дял на неуспех методът има ограничено приложение при останалите заболявания.