1. Молекулярно-генетичните изследвания при лимфоидни неоплазии целят:
Доказване на наличието на специфични или клонални туморни маркери, които са от значение за диагнозата и/или субкласифицирането на някои лимфомни подтипове;
Установяване на молекулярни аномалии с прогностична стойност или чието наличие е необходимо условие за провеждане на таргетна терапия;
Определяне на линейната пренадлежност на малигнената популация в случаи, при които фенотипизацията не е показателна;
Проследяване на минималната резидуална болест (МРБ)
Доказване на вируси, асоциирани с лимфопролиферативния процес.
Молекулярно-генетични изследвания (PCR и/или FISH) рутинно за диагноза се извършват в лаборатории, притежаващи необходимите апаратура и опит, участващи в подходящи програми за качествен контрол
Критични за резултатите от тези изследвания са начинът на вземане на биологичния материал за изследване, както и условията и времетраенето на неговия транспорт до съответната лаборатория. Необходимо е предварителното им уточняване с лабораторията, извършваща изследването.
Изборът на методичен подход и вид на изследваните маркери зависи от предполагаемата диагноза, възможностите и ограниченията на тестовете, тяхната чувствителност и специфичност.
Прилагането на полимеразна верижна реакция (PCR) позволява с относителна бързина, при минимални изисквания към количеството и вида на изследвания материал и висока чувствителност:
Доказване на пренареждания на гените на имуноглобулините (Ig) или Т-клетъчните рецептори (TCR) (клонални маркери);
Търсене на молекулярни еквиваленти на транслокации, характеризиращи някои лимфоми;
Скрининг на молекулярни аномалии с прогностична значимост (най-вече при прекурсорни лимфобластни левкемии/лимфоми);
Определяне на генна експресия;
Скрининг за вирусни нуклеинови киселини и др.
За целите на PCR може да се използва:
Свеж или замразен биологичен материал, получен чрез тъканна или тънкоигленна аспирационна биопсия; аспирация на костен мозък или от периферна кръв (за ДНК и РНК анализ);
Тъканни срезове от фиксирани и включени в парафин тъкани, хистологични препарати или клетки от натривки (само за ДНК анализ).
При интерпертацията на получените резултати трябва да се имат предвид:
Видът на използваната PCR (качествена или количествена; едноетапна или двуетапна),
Видът на изследвания маркер (фузионни транскрипти, генни пренареждания, мутации, генна експресия);
Чувствителността на реакцията.
Потенциална възможност от:
фалшиво-положителни реакции поради: контаминация с екзогенна ДНК; неспецифични продукти на реакцията при неподходящи температурни режими, брой цикли или избор на праймери; селективна амплификация на олигоклонове в проби, съдържащи малък брой лимфоцити и др.
фалшиво-отрицателни реакции поради: технически грешки при пипетиране; деградация на ДНК/РНК; неоптимален избор на праймери, невъзможност за обхващане на всички потенциални пренареждания; клонална еволюция; продължаващи соматични мутации в изследваните гени на Ig и др.
Резултатите от PCR винаги трябва да се интерпретират в светлината на клиничните данни и резултатите от морфологията и имунофенотипизацията.
Прилагането на флуоресцентна in situ хибридизация (FISH) позволява установяване на разнобразни хромозомни аномалии с относителна бързина; висока разделителна способност, възможност за анализиране на по-голям брой клетки в сравнение с конвенционалната цитогенетика, и възможност за съчетаване на генетичното изследване с морфологично характеризиране на тъканите и клетките в анализираните проби. Видът на аномалиите се определя от специфичността на използваните сонди:
Центромерни сонди - за бройни аномалии, особено за монозомии и тризомии,
Локус-специфични сонди - за делеции, дупликации, специфични транслокации и др.
В рутинната практика, FISH намира приложение за доказване на:
Молекулярни аномалии с прогностична значимост - най-вече при прекурсорни лимфобластни левкемии/лимфоми (като алтернатива на PCR);
Вирусни нуклеинови киселини (като алтернатива на PCR);
Бройни хромозомни аберации, които не могат да бъдат да бъдат установени с PCR;
Транслокации с диагностична стойност при лимфоми, при които точката на прекъсване е разположена в относително големи области и не могат да бъдат установени с PCR (при лимфом на Burkitt, дифузни В-едроклетъчни лимфоми и др.)
FISH позволява да се изследват както метафазни, така и интерфазни клетки.
Метафазният FISH позволява разграничаване на области с големина над 2-3 милиона бази. Недъстатък на метода е необходимостта от жизнеспособни клетки, което е проблем при лимфоми с нисък пролиферативен капацитет.
Интерфазният FISH е със значително по-висока разделителна способност (100-1000 бази) и е приложим за изследване както на свеж и замразен материал, така и на фиксирани тъкани и клетки.
Интерфазният FISH не позволява използване на хромозомни сонди.
При извършване на изследването върху тъканни срези, отчитането на флуоресцентния сигнал следва да бъде съобразено с възможността от наслагване на клетъчни ядра и/или срязването им.
