Председателя на Научното жури определено със заповед

Председателя на Научното жури

определено със заповед

№І-153/20.07.2011

от Директора на Институт по микробиолиогия

към БАН

на тема: „Биосинтез на галантамин от растителни in vitro системи на Leucojum aestivum L.”

Научна специалност „Технология на биологично активните вещества”, шифър 02.11.11. Институт по микробиология „Стефан Ангелов” към Българска Академия на науките,

Автор на дисертационния труд: Иван Георгиев Иванов, асистент към лаборатория по Промишлени биотехнологии - Пловдив

Научен ръководител: проф.д.т.н. Атанас Иванов Павлов

Рецензент: доцент, д-р. Виолета Савова Кондакова, АгроБиоИнститут,София

Дисертационния труд на Иван Георгиев Иванов е предмет на мултидисциплинарно проучване върху възможността за прилагане на съвременни биотехнологични подходи

за извличане на вторични метаболити от естествени растителни източници.

Целта на дисертационния труд е насочена към създаване на интегриран подход за извличане на алкалоида галантамин от растението блатно кокиче / Leucojum aestivum L./, което позволява оптимизиране и контрол на биосинтезирания продукт.

Основните аргументи, които могат да дефинират актуалността на дисертационния труд могат да бъдат резюмирани в няколко направления, както следва:

• 
  През последните години международната научна общност регистрира значителен прогрес в разширяване на методологичната основа за анализ на вторични метаболити с биологична активност. Развитието и усъвършенстването на голям брой аналитични технологии се превърна в сериозна предпоставка за развитието на метаболомикса.
  

Понастоящем в метаболитните проучвания се използват два допълващи се подхода: метаболитно профилиране (metabolic profiling) и метаболитен фингерпринт

(metabolic fingerprinting). Метаболитното профилиране е насочено върху анализиране на групи от вторични метаболити свързани с основни биосинтетични пътища, директни подходи целящи определянето на биомаркери за болести или токсична експозиция, или субстрати и продукти от съответни ензимни реакции. При този подход се сравняват метаболитните диаграми или профили променящи се в резултат на инфекция, токсично влияние или генетични промени.

Получаването на подробна информация по отношение на биохимичния състав на растителните тъкани предоставя голям потенциал както в чисто научен, така и в приложен аспект.

Съдържанието на вторични метаболити присъстващи във всички видове е в пряка връзка с индивидуалната фенотипна експресия на образците.

Разработването и усъвършенстването на метаболитните технологии предоставя възможност за оценката им в приложен аспект.

• 
  Болестта на Алцхаймер се определя като болестта на века и засяга все повече хора във всички части на света. Броят на болните нараства с бързи темпове и през последните години се съобщава за 30 милиона души засегнати от нея.
  

През последните десетилетия за превенция от болестта Алцхаймер се прилагат препарати включващи алкалоида галантамин, които се изолира и пречиства от растения принадлежащи към сем. Amaryllidaceae (Кокичеви). Един основен представител е вида Leucojum aestivum L., източник за изолиране и пречистване на

алкалоида галантамин. В България има регистрирани 35 естествени находища на блатно кокиче и във връзка с неговото значение като естествен ресурс е обявен за защитен вид през 1989 г. От тях 25 находища са от галантаминов тип. Всички естествени находища на блатно кокиче са характеризирани от български изследователи и е определен техния хемотип.

• 
  Алтернативен метод за изолиране на галантамин от блатно кокиче е използването на in vitro култури. In vitro размножаването е процес който е по-бавен и не много ефективен за някои растителни видове като луковичните. По класическата схема на in vitro размножаване не е възможно осигуряване на достатъчно количество биомаса за нуждите на промишленото изолиране на галантамин. Развитието на растителните биотехнологии в посока на въвеждане на биореакторни системи позволява пълен контрол и управление на биосинтетичния процес и получаване на стабилни добиви от метаболити за кратък период от време.
  

Той е написан върху 256 страници и в композиционно отношение включва седем части по приетата класическа схема- увод, литературен обзор, цел и задачи, материал и методи, резултати и дискусия, изводи и библиография.

Литературния обзор като структура и съдържание показва отлична осведоменост на докторанта по разработваната тема. Информацията включена в обзора е много ценна и надвишава нужната за разработваната тема. Направена е задълбочена характеристика на основни типове алкалоиди като биологично активни природни съединения и тяхната биологична, физиологична и фармакологична активност а също и на биосинтеза на галантамин в in vitro системи.

Литературния преглед включва много информация – цитирани са 306 литературни източници, написан е професионално и се чете с лекота. Съдържанието на прегледа и богатата илюстрация с фигури, таблици и графики ми дава основание да препоръчам на автора да го публикува. И двете части включени в него- за алкалоидите и биореакторните системи ще бъдат от голяма полза на четящите учени. Обзора завършва с изводи от литературния обзор- този край показва високата компетентност на докторанта, а на четящите дава възможност за прозрения в потенциалната значимост на подбраната тема.

Богатият литературен обзор и компетентната интерпретация на получените до сега експериментални резултати са позволили на автора да формулира ясно целта и конкретните задачи на дисертационния труд.

В методично отношение дисертационния труд е построен прецизно, използваната методология е адекватна на експерименталните задачи /shoot тип in vitro култивиране на Leucojum aestivum линия G80, култивиране в RITA апарат и модифициран колонен биореактор, HPLC и GC-MS анализи, екстракционни и ензимни методи, статистически анализи и използване на голям брой софтуерни продукти/. Изследователската работа е свързана с различни научни направления- Растителни биотехнологии, Микробиология, Фитохимия, Фармакология и впечатлява с богатството на използвания методичен арсенал което позволява прилагането на мултидисциплинарен подход при решаване на научни цели.

Резултатите, дискусиите и приносите могат да бъдат коментирани последователно по реда на тяхното изложение.

• 
  Изследователската работа на докторанта стартира с оптимизиране параметрите на приложение на HPLC анализа за количествено определяне на алкалоидите съпътстващи галантамина /норгалантамин и ликорин/ които се синтезират от линия G80 на Leucojum aestivum L.. Чрез промяна на подвижната фаза /неорганичния и органичен компонент/ и скоростта на потока, докторанта дефинира параметрите за приложение на HPLC анализа при количественото определяне на алкалоидния комплекс, промяната на алкалоидния профил на линия G80 култивирана при различни условия. Този резултат е с голяма стойност и показва професионална компетентност и владеене на аналитичните методи какъвто е високоефективната течна хроматография и може да се определи като значим научен принос.
  
• 
  Изпитано е влиянието на различнии култивационни системи /система за временно разбъркване тип RITA и колонен биореактор с вътрешни секции/ върху синтеза на галантамин от блатно кокиче.
  

Установени са параметрите за развитие на линията G80 на Leucojum aestivum L. За доказване предимствата на тази система са направени и анализи за определяне на алкалоидния профил на екстракти. Регистрирани са 15 съпътстващи алкалоиди в минимални количества и 3 алкалоида се различават количествено- галантамин, ликорин и хамаин. Значението на показателя честота на разбъркване и температура на култивиране определят shoot култури от L. aestvum като добра биологична матрица за определяне относителното съдържание на ценни алкалоиди. Използването на тази система за биосинтез на вторични метаболити е ценен научен принос в дисертационния труд.

Оригинален подход в дисертационния труд е статистическата оптимизация на условията на култивиране в биореакторната система и доказана достоверност на теоритичните и експериментални стойности на изследваните показатели.

• 
  Изследван е и колонен биореактор с вътрешни секции - чрез тази система е получен максимален добив от галантамин- 1.7 мг/л, който не е съобщаван досега в литературата. Изследователския подход е същия като при система за временно разбъркване тип RITA и резултатите показват стабилни растежни и морфологични характеристики и при двата типа биореактори , но като по –подходящ за биосинтез на галантамин е модифицирания колонен биореактор.
  
• 
  Оригинален изследователски подход в изследванията е използването на елистирането за оптимизиране процесите на биосинтез на алкалоидите. Доказано е че добавянето на 40 µМ жасминова киселина като елисатор не само индуцира но и пренасочва вторичния метаболизъм на клетката по посока биосинтез на алкалоиди и влияе върху съотношението на отделните алкалоиди на ниво вътре- и външно- клетъчен екстракт. Тези изследвания са част от изграждане на цялостен технологичен процес с доказана ефективност за увеличаване добивите на галантамин.
  
• 
  Селекционирането на високопродуктивни линии е много важен етап в разработването на цялостна технология. Тази част от дисертационния труд включва серия от експерименти в колонен биореактор с вътрешни секции и изпитване на серия от показатели. Доказано е, че селекционираната линия LaR 28 се характеризира с биосинтез на галантамин с висока честота и осигурява по-евтин и бърз процес на пречистване от съпътстващите го алкалоиди.
  
• 
  Тази линия е определена като най-подходяща за разработване на двуфазен метод за биосинтез на галантамин. Изследванията свързани с разработването на тази система /анализ на растежните параметри,определяне на антицетилхолинестеразна активност, масспектрални анализи/ дават основание на докторанта да предложи двуфазния метод за култивиране на shoot култури на L .aesivum като добра база за промишлено in vitro получаване на галантамин и има научно-приложна стойност.
  
• 
  Като резултат от дисертационния труд на докторанта е предложена технологична схема за получаване на галантамин от растителни in vitro системи на L.aesivum включваща нови и ефективни подходи които осигуряват висок добив на галантамин, /5.6 мг/л/ и продуктивност на системата 168.6 мкг/л /ден за който до сега няма съобщения в литературата.
  

Към дисертационния труд нямам критични бележки. Това което мога да кажа, че за мен беше голямо удоволствие да се запозная с изследванията и резултатите на докторанта Иван Иванов и искрено съжалявам, че правилниците за присъждане на степени и звания в България не позволяват прескачането в по-горно степен. А тази дисертация заслужава такава висока оценка.

Представената за рецензиране дисертация впечатлява с цялостната си концепция за

изследване на възможностите за проучване и добиване на биологично активни вещества в растителни in vitro системи.

Получените резултати включени в дисертационния труд са много убедителни и отговарят на изискванията на закона за развитие на академичния състав в РБ за дисертация за придобиване на образователната и научна степен „Доктор”

На основание на горепосоченото убедено препоръчвам на членовете на журито да

гласуват положително за присъждане на образователната и научна степен „Доктор” на асистент Иван Георгиев Иванов.

29.09.2011

Рецензент