Програма „развитие на човешките ресурси bg051PO001 06 -0059

ИБИР-БАН

“Опасен” (danger) модел (Matzinger P : Science 2002 ;296 :301-5) е актуална концепция в имунологията, която постулира, че вродената имунна система (дендритни клетки с рецептори за молекулни мотиви) се активира от “опасни” danger) сигнали от патогени или от “свои” умиращи/мъртви клетки. Активираната сигнализация има капацитет да регулира гени с роля в клетъчния растеж/смърт (апоптоза), възпаление (привличане на сегментоядрени левкоцити, ангиогенеза, тъканна дезинтеграция) и анти-възпаление/тъканна регенерация.

Овулацията с образуване на жълто тяло наподобява “стерилно” (неинфекциозно) възпаление. То се контролира от гранулозни клетки с вродена имунна функция: експресия на вродени имунни TOLL рецептори за разпознаване и активиране от danger сигнали (“незрели” дендритни клетки в пре-овулаторен фоликул), експресия на клас II MHC молекули за представяне на овариални антигени и “обучаване” на “наивни” Т-клетки (“зрели” дендритни клетки в жълто тяло, които комуникират с адаптивната имунна система). Ако балансирано активиране на вродената гранулозо-клетъчна имунна функция обезпечава нормалната овулация/лутеогенеза, то небалансираното й активиране може да причини хронично тъканно увреждане и да провокира развитие на овариален автоимунитет. Данни от научната литература са за нарушена овариална функция във връзка с: повишени оксидативен стрес и гранулозо-клетъчна апоптоза (наднормено тегло), потисната и свръхактивирана вродена гранулозо-клетъчна имунна функция (PCOS, LUFS и съответно OHSS, атипична фоликуларна руптура), нарушена комуникация между вродена гранулозо-клетъчна имунна функция и адаптивна имунна система (идиопатично безплодие, POF с овариален автоимунитет).

Резултатите от предложените в този научен проект експерименти (вж. ЗАДАЧИ/ПЛАНИРАНИ ЕКСПЕРИМЕНТИ) ще помогнат за изясняване на фундаментални аспекти от механизми на модулиране на вродената имунна функция на човешки гранулозни клетки, а в перспектива- за разработване на нови стратегии за терапия на овариални нарушения.

“Опасни” (danger) сигнали/алармини се секретират активно и/или отделят пасивно при всяко увреждане на тъкан/клетки и се акумулират в “стареещи” и предразположени към увреждане от оксидативен стрес тъканни/клетъчни структури, каквато структура на практика е пре-овулаторният фоликул- финален етап от фоликулогенезата. Данни от научната литература са за danger сигнали във фоликуларна течност/фоликуларни клетки: остро-фазови протеини, IL-1 beta, оксидиран LDL (OxLDL), S100 протеини, HMG-b1, крайно-гликирани продукти. Те могат да активират TOLL рецептор-4 (TLR-4), IL-1R, рецептор за OxLDL (LOX-1) и рецептор за крайно гликирани продукти (RAGE). Danger сигналът OxLDL индуцира оксидативно увреждане на гранулозни клетки и авторегулира експресията на своя рецептор LOX-1. В този т. нар. “Порочен цикъл” се генерира повишено ниво на OxLDL, под което ниво се активира вродената имунна функция на гранулозни клетки с TLR-4 за започване на овулацията.

Рецепторът за крайно-гликирани продукти RAGE е имуноглобулинов тип рецептор, който може да взаимодейства с: калции-свързващи S100 протеини; транскрипционен фактор HMG-b1; крайно-гликирани продукти. RAGE е единствения познат сигнал-трансдуциращ рецептор за крайно-гликирани продукти. Крайно гликираните продукти се образуват след неензимно гликиране/оксидиране на протеини и липиди. Образуването/акумулирането им в тъканите, клетките и циркулацията е в пряка зависимост с: ниво на оксидативен стрес, хипергликемия, хипоксия; полиолен метаболизъм на глюкозата; процес на естествено стареене (aging); тип на консумирана храна. Данни от научната литература за активиране на RAGE от крайно-гликирани продукти са основно за ендотелни и гладко-мускулни клетки, и мононуклеарни фагоцити, при които активиране на RAGE индуцира NAD(P)H оксидаза, MAP кинази и GTPази, и редокс-сензитивни транскрипционни фактори (NF-kappa B, AP-1) за гени за адхезивни молекули, ангиогенни фактори, хемокини, цитокини, RAGE.

Данните за RAGE и крайно гликирани продукти в яйчник са ограничени. С имунохистохимичен подход RAGE е локализиран в ендотелните, гранулозните и лутеалните клетки в нормална и поликистозна овариална тъкан. Повишено е акумулирането на крайно-гликирани продукти в гранулозни клетки в поликистозна овариална тъкан. Съобщава се за отрицателна корелация на фоликуларните нива на крайно-гликирани продукти с качеството на яйцеклетките/ембрионите и с нивото на успешна бременност на жени участвали в програма за асистирана репродукция.

Целта на планираните в настоящия научен проект експерименти е молекулярно-биологичното характеризиране на сигнален път на рецептор за крайно-гликирани продукти и проследяване на включването му в механизъм на авторегулация на RAGE, в индуцирането на оксидативен/нитрооксидативен стрес, в експресията на апоптичен/про-възпалителен фенотип, и в крос-сигнализация с LOX-1 (рецептор за danger сигнал) и TLR4 (вроден имунен рецептор) в ин витро култивирани човешки гранулозни клетки.

Планираните експерименти са във фундаментално направление. Те ще бъдат проведени върху ин витро модел- култури на човешка гранулозо-клетъчна линия (COV434) и/или първични гранулозо-клетъчни култури. Като крайно-гликиран продукт ще бъде използван гликиран човешки албумин (GlycALB).

Третиране на групи от клетъчни култури с: GlycALB; нативен човешки албумин (контрола/ефект на гликиране); GlycALB+анти-оксидант/NF-kappa B инхибитор [caffeic acid phenethyl ester, C17H16O4] (контрола/ефект на ROS); GlycALB+ азотен оксид синтетазен инхибитор [L-NAME] (контрола/ефект на RNS).

Визуализиране/измерване: ROS (флуоресцентен H₂DCFDA тест); RNS (флуоресцентен DAF-FM DA тест); Активиране на NF-kappa B (индиректен имунофлуоресцентен [IIF] и/или western blot [WB] тест); експресия на RAGE (IIF и/или WB тест).

ЗАДАЧА 2 Да се характеризира протеин киназен модул от сигнален път на RAGE.

Третиране на групи от клетъчни култури с: GlycALB; GlycALB + C17H16O4; GlycALB+ ERK 1/2 MAPK инхибитор [PD 98059] (контрола/изключване на ERK 1/2); GlycALB+ P38 MAPK инхибитор [SB203580] (контрола/изключване на P38 MAPK).

Визуализиране/измерване: Активиране на NF-kappa B (IIF и/или WB тест).

ЗАДАЧА 3 Да се проследи включване на активиран от RAGE оксидативен/нитрооксидативен стрес в експресия на апоптотичен гранулозо-клетъчен фенотип.

Третиране на групи от клетъчни култури с: GlycALB; GlycALB+ C17H16O4; GlycALB+ L-NAME.

Визуализиране/измерване: ROS/RNS; оксидативен стрес (TBRS тест за липидна пероксидация); апоптотични клетки (флуоресцентен DAPI тест и/или TUNEL); експресия на проапоптотичен/антиапоптотичен маркер [p53, bcl-2] (IIF и/или WB тест).

ЗАДАЧА 4 Да се проследи включване на активиран от RAGE сигнален път в експресия на про-възпалителен гранулозо-клетъчен фенотип.

Третиране на групи от клетъчни култури с: GlycALB; GlycALB+ C17H16O4.

Визуализиране/измерване: активиране на NF-kappa B (IIF и/или WB тест); експресия на адхезивна ICAM-1 молекула (IIF и/или WB тест); секреция на про-възпалителни цитокини [TNF-alpha, IL-6] (ELISA).

ЗАДАЧА 5 Да се проследи потенциална крос-сигнализация RAGE:LOX-1 и RAGE:TLR-4 .

Третиране на групи от клетъчни култури с: GlycALB; човешки OxLDL (активиране на LOX-1); липополизахарид [LPS] (активиране на TLR-4).

Визуализиране/измерване: активиране на NF-kappa B (IIF и/или WB тест); експресия на RAGE, LOX-1, TLR-4 (IIF и/или WB тест); секреция на про-възпалителни цитокини (TNF-alpha, IL-6) (ELISA).

ОЧАКВАНИ РЕЗУЛТАТИ

От изпълнение на ЗАДАЧА 1 и 2 ще бъдат получени данни за основни звена (вторичен [second] посредник, киназен модул, транскрипционен фактор) от активиран от крайно-гликирани продукти сигнален път на RAGE в човешки гранулозни клетки; данни за механизъм за авторегулация на RAGE от RAGE (посредством транскрипционен фактор NF-kappa B). Получените данни от изпълнение на ЗАДАЧА 3 ще са за активиран от RAGE оксидативен/нитрооксидативен стрес във връзка с експресия на апоптотична гранулозо-клетъчна морфология и молекулни маркери за апоптоза, а от ЗАДАЧА 4- за експресия на про-възпалителни молекулни маркери (адхезивни молекули и цитокини). От изпълнение на ЗАДАЧА 5 ще бъдат получени данни за потенциална крос-сигнализация между рецепторите RAGE, LOX-1 и TLR-4 (посредством транскрипционен фактор NF-kappa B). Те ще помогнат за изясняване на ролята на RAGE в модулация на: ниво на danger сигнали за активиране на вродена гранулозо-клетъчна имунна функция (RAGE:LOX-1); ниво на активиране на вродена гранулозо-клетъчна имунна функция (RAGE:TLR-4).

Резултати от изпълнение на настоящия проект могат да бъдат докладвани на научни форуми и публикувани в научни списания с насока молекулярна и клетъчна биология, биохимия, имунология и биология на репродукцията.

ПЛАНИРАНИ КОНСУМАТИВИ

За реализиране на настоящия проект е планирано закупуване на следните консумативи: