Програма за болнична хигиена "Хигия" Химиотерапията на инфекциозните заболявания е лечение с химични средства, насочено срещу причинителите им



Дата22.07.2016
Размер299.58 Kb.
ТипПрограма
ДИСКОВО-ДИФУЗИОНЕН МЕТОД ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ ЛЕКАРСТВЕНА ЧУВСТВИТЕЛНОСТ НА КЛИНИЧНО ЗНАЧИМИ МИКРООРГАНИЗМИ

А. Бъчварова, Ц. Велинов, Т. Кантарджиев, М. Петров

Национален Център по Заразни и Паразитни Болести
Настоящата инструкция е подготвена със съдействието и в рамките на Българо – Швейцарската програма за болнична хигиена “Хигия”
Химиотерапията на инфекциозните заболявания е лечение с химични средства, насочено срещу причинителите им.

Една от най-важните дейности на клиничната микробиологична лаборатория е определянето чувствителността на микроорганизмите към антимикробни химиотерапевтици. Целта на тестовете за чувствителност е in vitro определяне успеха на терапията с конкретен антимикробен агент на пациент с дадена, етиологично доказана инфекция. От друга страна, тестовете за чувствителност са необходими за откриване и проследяване на клинично значима антимикробна резистентност при микроорганизмите, предизвикващи инфекции.

При правилната клинична диагноза на инфекциозните заболявания, причинителят е известен и антимикробната терапия е емпирична. Емпирично се започва и лечението на животозастрашаващи инфекции (сепсиси, пневмонии, менингити), както и на други инфектни заболявания, причинени от условно патогенни микроорганизми, но винаги на базата на събраните данни за резистентността на микроорганизмите. След получаване на резултатите от тестовете за чувствителност, терапията задължително се съобразява с тях.

Европейският съюз изисква от всички присъединяващи се държави изготвянето на Национална антибиотична политика, съобразена с данните от локалните проучвания на резистентността.

В исторически план агар-дифузионният метод за установяване на чувствителността на различни микроорганизми към penicillin G е изведен от агар-дифузионния метод, използван за установяване плазмената концентрация на пеницилина. Принципът на метода се основава на използването на постоянна концентрация на антибиотик, натоварен в резервоар и поставен върху твърда хранителна среда. По наличието и ширината на чистата от бактериален растеж зона около резервоара се определя чувствителността на изследвания микроорганизъм към дадения антибиотик. Диаметърът на зоната е пропорционален на чувствителността на тестувания микроорганизъм.

Дисково-дифузионният метод е предназначен за изпитване чувствителността на бързо растящи аеробни бактерии. Методът може да се прилага и за взискателни микроорганизми (Haemophilus, N. gonorrhoae и др.), за които има въведени стандарти. Лабораторното изпитване на чувствителността на бързорастящите микроорганизми се извършва рутинно с дисково-дифузионния метод (ДДМ) на Бауер-Кърби. Когато е необходимо по-точно определяне на чувствителността се прилагат методите за определяне на минимални подтискащи концентрации (МПК) на антимикробните агенти чрез методи със серийни разреждания на антибиотика в бульон или агар.

Простотата за изпълнение на дисково-дифузионния метод, възможността за изпитване чувствителността към относително голям брой и разнообразни антимкробни агенти, както и ниската цена, е довела до широкото му прилагане в микробиологичните лаборатории. Дисково-дифузионния метод е един от най- задълбочено проучваните и обновявани тестове. Целта на тези изследвания е изграждането на стандарти, които гарантират възпроизводимост и точност на резултатите, получени с дисково-дифузионния метод.

В настоящето описание на дисково-дифузионния метод са представени всички основни елементи на антибиограмата, които трябва да бъдат контролирани, както и някои насоки за правилната интерпретация на резултатите от тестовете за чувствителност.



Филтърни дискове

Филтърните дискове за антибиограми трябва да с тегло 30  4 мг/см2 и трябва да абсорбират 2 до 3 пъти своето тегло във вид на вода. Дисковете, изработени от такава хартия трябва да са с диаметър 6.35 мм. За натоварването на дисковете с необходимата концентрация антибиотичен разтвор, те се поставят върху алуминиева телена мрежа и 0.02 мл от разтвора се пипетира внимателно в центъра им. Дисковете се поставят да изсъхнат в камера, предотвратяваща контаминация. След изсушаването им, дисковете се поставят между листове от подсушаваща хартия и десикатор и се съхраняват при температура -200С (3).

Дискове, съхранявани в интактни кутии при температура 20С - 80С могат да се използват до 6 месеца. Съхранението при температура -200С е по-подходящо, особено за дискове, натоварени с -лактами.

Поставянето на изсушен филтърен диск върху инокулирания агар e придружено с едновременното развитие на две събития: 1 дифузия на антибиотика от диска в агара и 2 растеж на микроорганизма. Дифузията на антибиотика води до образуването на предсказуем градиент на концентрацията, който зависи от началната концентрация, структурата и размера на антибиотичната молекула, температурата на инкубация и физикохимичните характеристики на агара.



Концентрацията на ръба на зоната отговаря на минималната подтискаща концентрация (МПК) на изследвания антибиотик.

Всеки антимикробен агент дифундира в агара в определена степен, зависеща от концентрацията на антибиотика в резервоара. С прогресирането на дифузията се получава широк градиент на концентрация в агара; постепенно концентрацията на антибиотика в резервоара намалява, което води и до спадане на градиента, от който зависи дифузията. В повечето случаи лекарствената дифузия е напълно приключила за 6 до 8 часа, тъй като количеството на антибиотика в резервоара се изчерпва.


Характеристики на зоновия ръб (3)


Теоритично бактериалната популация е изложена на намаляващ градиент на антибиотична концентрация, при което бактериалния растеж е или напълно подтиснат, или напълно неподтиснат, поради което зоновият ръб е ясно изразен. На практика обаче, повечето антибиотици водят до образуването на зона с частично инхибиране. От ръба на лекарствения резервоар встрани се образува зона на пълна задръжка на растежа; следва пръстен на непълна задръжка. Периферно от него се наблюдава пръстен от “стимулиран” бактериален растеж, разположен преди зоната на нормален растеж. Зоната на стимулиран бактериален растеж се дължи най-вероятно на това, че бактериите на ръба са в достъп до по-голямо количество хранителни вещества, дифундирали от агара в съседство, където растежа е подтиснат, в сравнение с останалите, при които хранителните вещества се изчерпват по-бързо. Този феномен не е свързан със стимулиращия ефект на субинхибиращите концентрации на антибиотика в средата. Установява се наличието и на допълнителен вътрешен пръстен от забавен растеж, който се дължи на растежа на бактерии, първоначално подтиснати от концентрацията на антибиотика. С напредване на инкубацията инхибираните клетки започват да се развиват поради намаляване на лекарствената концентрация, като причината е или напредващата дифузия, или разграждането на антибиотика от температурата. Този вътрешен пръстен се наблюдава най-често при антибиотици, които са с бактериостатично действие. С напредване на инкубацията, вътрешният пръстен от забавен или частичен растеж става по-ясно видим, като това води до стесняване на зоната на задръжка. Това е причината за стандартизиране времето на инкубация, което трябва да бъде константно.

Мануално отчитане на резултатите: Диаметърът на всяка зона на задръжка се измерва до най-близкия диаметър с помощта на линия, шаблон, шублер или електронен инструмент. За постигане на възпроизводими резултати методите, използвани за отчитане размера на зоните се стандартизират.

Автоматизирано отчитане на резултатите: Няколко фирми произвеждат системи за автоматично отчитане размера на зоните на задръжка. Някои от тях дават краен резултат след 6-8 кратно измерване; някои могат да отчитат наличието на синергизъм между два диска.

Експертните системи могат автоматично да интерпретират резултатите; има възможност да се правят епидемиологични интепретации на резултатите, както и да се отчита наличието на резистентни нозокомиални щамове. Повечето от системите не могат да отчитат резултати върху шоколадов и кръвен агар.



Проблеми при мануалното отчитане размера на зоната на задръжка: Мануално зоните на задръжка не могат да се отчитат с висока прецизност. Във всички случаи е важно да се стандартизира интензитета на светлината и ъгъла на осветяване при измерване на зоните. При определени случаи, зоната на инхибиция не винаги е рязко отграничена. Когато има частичен или забавен растеж, външният ръб на зоната е неравен. Това е често явление и при отчитане се взема пред вид най-външния ръб, който показва равномерен и завършен растеж. Оформянето на ръба на зоната на задръжка се определя от механизма на действие на антибиотика, както и от наличието на инхибиращи антибиотика ензими, продуцирани от тестувания микроорганизъм. Например, при тестуване с пеницилин на пеницилиназа-негативни S.aureus се образува нежна зона от вътрешната страна на зоновия ръб. Тя се състои от плоски, неравномерни и прозрачни колонии, съдържащи бактерии с начална лиза на бактериалната стена. За разлика от това, при изследване на пеницилиназа-продуциращи S.aureus, се образува широка зона от разпръснати колонии, разположена между по-малката зона на пълна задръжка и външната зона, която е по-плътна от тази, образувана от пеницилиназа-негативните S.aureus. Колониите, разположени във вътрешната зона се състоят от интактни бактериални клетки. При пеницилиназа-продуциращите S.aureus, зоната на задръжка може да бъде широка, колкото при чувствителните стафилококи 20-28 мм. Наличието на неравномерна, назъбена зона, състояща се от разпръснати колонии на фона на широка зона на задръжка, предполага щам, продуциращ пеницилиназа, който трябва допълнително да бъде тестуван за продукцията на такъв ензим.

Агарова среда (2,3)


Агаровата среда влияе:

  • върху активността на антимикробните агенти

  • върху нивото на дифузия

  • върху растежа на микроорганизмите

Съставът на агара влияе върху размера на зоната на задръжка чрез повлияване скоростта и степента на дифузия на антибиотика. Използваната среда трябва да е подходяща за дифузията на антимикробните средства, да не променя активността им и да е подходяща за растежа на микроорганизмите.

Основните критерии, по които се определя дали една среда е подходяща за дифузионните тестове, са следните:

- средата трябва да осигурява добър растеж на по-голямата част от бързо растящите патогени, за които са предназначени тестовете за чувствителност

- средата трябва да е подходящо буферирана, за да може да компенсира всички значими промени в рН по време на растежа на микроорганизмите

- средата не трябва да влияе негативно на антимикробните агенти, с които се извършват тестовете за чувствителност

- средата трябва да е изотонична и подходяща за добавяне на кръв при изследване на взискателни микроорганизми (промени в осмотичното налягане на средата влияе върху резултатите от чувствителността към -лактами)

- средата трябва да дава възпроизводими резултати при тестуване с референтните щамове

Повечето критерии, описани тук са на базата на изследвания с Мюлер-Хинтон агар (МХА).

Среда, съдържаща големи количества тимидин и тимин, може да подтисне инхибиторния ефект на сулфонамидите и trimethoprim. Това ще доведе до получаване на по-малки, слабо отчетливи или липсващи зони на задръжка и отчитане на фалшива резистентност. По тази причина, когато се извършват тестове с тези антимикробни препарати е необходимо използването на Мюлер-Хинтон агар с минимално количество тимидин.

Някои взискателни микроорганизми не растат на суплементиран МХА. Въпреки, че триптиказа и brain-hart infusion агари с кръв, витамини и т.н. осигуряват растежа на тези микроорганизми, те не могат да се ползват за тестуване на антибиотикочувствителност, защото са установени неконтролируеми взаимодействия с различни антимикробни средства, които влияят върху зоната на задръжка.

Агрът е комплексна субстанция и тъй като е натурален продукт, се очаква наличието на известна вариабилност в състава на различните агари. Съдържа най-малко два типа полизахариди: агароза и агаропектин. Повечето агари са с негативен заряд, дължащ се най-вече на киселинните и сулфатните групи на полизахаридите. Нормално различни метални катиони са свързани с негативно заредените радикали на полизахаридите. Концентрацията на тези катиони може да бъде намалена чрез диализа или чрез промиване на агара с голямо количество вода. Средата трябва да съдържа прецизно измерени количества калциеви, магнезиеви и други метални катиони, които могат силно да променят активността на някои антибиотици (аминогликозиди) към някои микроорганизми (Pseudomonas). Препоръките са средата да съдържа 20-25 mg/l магнезий и 50-200mg/l калций. Ниските концентрации калций и магнезий дават по-ниски МПК и по-широки зони на задръжка, т.е. резистентни микроорганизми могат да се отчетат като чувствителни. Обратно, високите концентрации на тези катиони водят до повишаване на МПК и стесняване на зоните на задръжка – чувствителни микроорганизми се отчитат като резистентни. Следите от калций са необходими за съхраняване на способността за желиране. В добавка към катионите, агарът съдържа следи и от други елементи, които могат да са както стимулатори, така и инхибитори на бактериалния растеж. Пълното премахване на всички контаминиращи субстанции може всъщност да има подтискащ ефект върху растежа на някои микроорганизми и в същото време да стимулира растежа на други.

Взаимодействие между антимикробния агент и агара (2,3)


Антимикробните агенти с катионна молекулна структура могат да се свържат електростатично с киселинните или сулфатните групи на агара, в резултат на което дифузията им да намалее. Полимиксините са пример за доста големи, силно катионни молекули, които дифундират в ниска степен и дават релативно по-тесни зони на задръжка при дисково дифузионния метод. По-големи зони при полимиксините могат да се получат ако агарът е третиран с протамин, който блокира активните сулфатни групи. Други антибиотици, като аминогликозидите, също имат тенденция за електростатично свързване с активните групи на агаровите молекули. Полимиксините и аминогликозидите дават по-широки зони при тестуване в агароза.
рH и електролити (2)

рН на средата на стайна температура след втвърдяване трябва да е между 7.2 и 7.4 . Разликите в рН, дължащи се на инкубацията в атмосфера с СО2 може да променят размера на зоната на задръжка и МПК на много антибиотици. Високото рН води до силно намаляване активността на някои антибиотици (аминогликозиди, хинолони, макролиди), докато за други (тетрациклини) – до повишаване на активността.


Дебелина на агара (2)

МХА се разлива в петриеви панички, като се изисква дебелината на слоя да е 4 мм. За петри с вътрешен диаметър 9 или 15 см., се разлива съответно 25 или 60 мл. агар до достигане на необходимата дебелина. Големи вариации в дебелината на агара влияят върху размера на зоната на задръжка. Много тънък слой агар води до драматично разширяване на зоната на задръжка.

Петриевите панички с МХА трябва да се съхраняват на 40 – 80С в пластмасови торбички като могат да се използват до една седмица след разливането на средата.
Гъстота на инокулума (2,3,4)

Скоростта на растеж на даден микроорганизъм е характеристика на този микроорганизъм и се повлиява от хранителните добавки в средта. Времето, което е необходимо на култивирания микроорганизъм да достигне “критична клетъчна маса” се дефинира като “критично време”. Критичната клетъчна маса на даден микроорганизъм е тази гъстота от клетки, която преодолява МПК на този микроорганизъм. Очевидно критичното време се определя от хранителните качества на средата, скоростта на растеж на микроорганизма върху тази среда и гъстотата на инокулума. За да бъде тестувана антибиотикочувствителността на даден микроорганизъм, неговото критично време трябва да бъде съпоставимо с установеното такова на конвенционален агар. Критичното време, установено за щамовете най-често тестувани микроорганизми, е между 4 и 10 часа при инокулум 107 до 108 кое/за петри МХА (9см в диаметър). Грешките в контрола на гореспоменатите фактори може да доведе до грешна интерпретация на резултата – чувствителност или резистентност. Големи зони на задръжка могат да се получат при тестуване върху бедна на хранителни вещества среда или ако самият микроорганизъм е бавно растящ.

Гъстотата на инокулума е един от най-важните елементи, който влияе върху резултатите от тестовете за чувствителност. Границите на зоната на задръжка се отчита при достигане на критичната клетъчна маса. При по-малък инокулум, достигането на тази маса е забавено, антибиотикът достига по-бързо критична концентрация, което води до получаване на по-широки зони на задръжка. По-гъстият инокулум води до получаване на по-тесни зони. Гъстотата на инокулума е особено важна при изследване на микроорганизми, които проявяват резистентност чрез продукция на инактивиращи ензими, като напр. -лактамази. Тези микроорганизми често се проявяват като чувствителни при рядък инокулум, но при по-гъст, образувания и преминал в средата ензим, осигурява бактериален растеж. Следователно, минимални промени в гъстотата на инокулума водят до силни промени в резултатите от тестовете за чувствителност.

Приготвяне и стандартизиране на инокулума

Могат да се използват няколко метода за приготвяне на стандартен инокулум:



  1. Метод на Бауер – Кърби: Избират се най-малко 4 колонии с еднакъв фенотип. Поставят се в епруветка, съдържаща 4 мл бульон триптиказа-соев, BHIB. Инкубират се 2-3 часа на 35 - 37С до получаване на лека видима мътнина. След това мътнината се коригира чрез добавяне на стерилен физиологичен разтвор, така че да съответства на 0.5 McF. Така суспензиятя съдържа 1-2 х 108 КОЕ/мл за E. coli ATCC 25922.

  2. Модифициран метод със стационарни култури: Този метод ускорява изследването, тъй като се избягва необходимостта от култивиране на бульонната култура. От първоначалната посявка на твърда хранителна среда се подбират 5-10 добре отграничени, морфологично еднакви колонии и се суспендират в 5 мл физиологичен разтвор до постигане на мътнина, отговаряща на стандарта от 0.5 McF. Колониите се вземат от неселективна среда (кръвен агар). Може да се изхожда и от чиста бульонна култура, която също с физиологичен разтвор се коригира до стандартната мътнина.

Не по-късно от 15 минути след приготвяне на стандартизираните суспензии е необходимо да се инокулира агара.

Мътнина от 1McF отговаря на 3х108 клетки/мл.

Мътнина от 0.5McF отговаря на 1 – 2 х108 клетки/мл.
Подсушаване на средата (2)

Преди употреба, повърхността на агара трябва да е леко влажна без да има капки както върху агара, така и по капака на петриевата паничка. При наличие на влага преди употреба е необходимо подсушаване, което се прави в термостат на 35С или в ламинарен бокс на стайна температура при леко открехнат капак на петриевата паничка, обикновено за 10 – 30 минути). При използване на метод с покриване overlay такова подсушаване не е необходимо.
Инокулиране на средата (2,3,4)

Постигането на полуконфлуентен до конфлуентен растеж върху агара е оптимален за повчето ДДМ. Висока гъстота на инокулума, водеща до образуване на плътен ръб на зоната на задръжка, както и ниска мътнина, водеща до образуване на отделни колонии, не трябва да се използват, защото дават грешни резултати при отчитане.



Посяване чрез щрихи: Цялата повърхност трябва да се инокулира; в противен случай се получава изкривяване на зоните на задръжка. Стерилен памучен тампон се потапя в бактериалната суспензия; излишъкът се отстранява чрез завъртане на тампона по стената на епруветката. Посяването става на три пъти, като всеки път петрито се завърта на 600. Накрая тампона се завърта по периферията на агара, което осугурава равномерното разсяване по цялата повърхност.

Инокулиране чрез заливка: От бульон с мътнина 0.5McF се прави десетократно разреждане с физиологичен разтвор. Два до четири милилитра от тази суспензия се пипетира върху повърхността на агара и се разнася чрез внимателно завъртане на петрито. Излишъкът се премахва с пипета. Петрито се оставя да изсъхне за 15 минути на стайна температура. Техниката е по-рискована и трябва да се избягва при работа с високо патогенни бактерии Brucella, Salmonella typhi и т.н.

Метод с покриване overlay method: Четири – пет колонии с еднакъв морфологичен тип се суспендират в 0.5мл BHIB до получаване на минимална мътнина. Половин милилитър от тази суспензия се инкубира на водна баня при 350С - 370С за най-малко 4 часа, но не повече от 8 часа. 0.001мл от суспензията се прехвърля в 9 мл 1.5 процентен агар, разтопен на 45 - 500С. Размесват се добре с внимателно въртене. Излива се върху повърхността на МХА. Агарът застива за около 3 – 5 мин.
Време за поставяне на дисковете

Антибиотичните дискове трябва да се поставят 3 до 5, но не повече от 15 минути след инокулиране на средата, така че дифузията и растежа на микроорганизма да става паралелно. През този период повърхността на агара се подсушава, което е необходимо за предотвратявене преминаването на антимикробния агент от диска във влагажния слой. Трябва да се има предвид, че по време на подсушаването микроорганизмите започват да се развиват, а времето за дифузия на антибиотика намалява. Някои процедури (инокулиране със заливка) изискват специфичен период на предифузия на стайна температура след поставяне на дисковете, за да се даде допълнително време на антибиотика да дифундира в агара. Периодът на предифузия удължава лаг-фазата на микроорганизмите и това увеличава времето, през което зоната на инхибиция се детерминират. Според приетите стандарти, интервалите между инокулирането на средата, поставянето на дисковете и продължителността на инкубацията трябва да са строго контролирани.

Разстоянието от диска до ръба на петрито трябва да е поне 15 мм, а разстоянието между дисковете – поне 15 до 20 мм. Това подреждане намалява вероятността от сливане на зоните на задръжка, което затруднява измерването и интерпретацията на зоните. Важно е да се избягва преместването на веднъж поставения диск, защото дифузията на антибиотика започва непосредсвено след контакта на диска със средата.
Температура на инкубация

ДДМ е стандартизиран за температура на инкубиране 350-370С, осигуряващи оптимален растеж на най-честите патогени.. Увеличаването на температурата от 350 С до 410С може да доведе до намаляване на МПК, поради което отчитането на чувствителността ще бъде съмнително. Скоростта на растеж е забавена при по-ниски температури, а също така за достигането на критична концентрация на антибиотика е необходимо повече време. Повечето антибиотици дифундират по-бавно при ниски температури, поради повишаване вискозитена на агара. Следователно, ниските температури по време на критично важните начални часове на инкубацията, имат два ефекта: от една страна – образуване на по-широки зони на инхибиция (от забавянето на скоростта на растеж на микроорганизма), а от друга – образуване на по-тесни зони, поради забавяне скоростта на дифузия на антибиотика. Установено е, че ефектът от забавяне скоростта на растеж на микроорганизма доминира и зоните се разширяват при ниски температури..

За едно петри, разположено самостоятелно върху металния рафт на инкубатора, е необходим 1 час, за достигане на температура, различаваща се с 1С от температурата на инкубатора. Ако петритата са на кубчина от напр. 5, на централното петри ще са необходими 4 часа, за да достигне същата температура. Това може сигнификантно да повлияе върху размера на зоната на задръжка. При стандартизирана работа, петритата трябва да са разпределени самостоятелно по рафта на инкубатора.


Растежни характеристики на тестувания щам (2,3)

Скоростта на растеж върху тест-средата влияе на резултатите. При тестовете за чувствителност, някои разлики в скоростта на растеж на различните щамове са неизбежни. Атмосферата за култивиране е стандартизирана за получаване на оптимални резултати за най-честите, бързо растящи бактериални патогени. Микроорганизми, които имат по-бавен растеж при тези условия, не могат да бъдат правдиво тестувани. При такива микроорганизми, широките зони на задръжка могат да са резултат както на чувствителност, така и на бавния растеж. От друга страна, малките зони показват реална резистентност.
Бързорастящи микроорганизми

За повечето тестове за чувствителност се препоръчва използването на Мюлер-Хинтон агар. Ако по определени причини се използва друга среда, е необходим адекватен контрол, който да даде информация дали тази среда влияе върху антимикробните агенти, които се изследват. За тази цел се използват стандартните контролни щамове, като се сравняват резултатите, получени със стандартната и новата среда.


Взискателни микроорганизми

Такива са бавнорастящите микроорганизми, микроорганизми със специфични хранителни изисквания или и двете заедно. Бавнорастящите микроорганизми не са подходящи за тестуване с дифузионните методи по две причини: (а) Бавният растеж влияе на резултатите от антибиограмата, защото критичното време е по-дълго от 8 – 10 часа; (б) Средата или допълнителните хранителни фактори, използвани за подобряване на растежа могат да имат антагонистичен ефект. Ако се изисква тестуване за чувствителност на микроорганизъм, чиито хранителни изисквания влияят на активността на антибиотиците, не трябва да се използва дисков метод. За тях се препоръчва търсене на МПК.

Изследването на антибиотикочувствителността на взискателни микроорганизми е важно, защото такива щамове обикновено са резистентни, а антибиотикочувствителността им не е достатъчно документирана

При тестуване на такива микроорганизми, за които има стандартизиран дисково дифузионен метод, трябва да се има пред вид, че не трябва да се поставят по повече от 4 антибиотични диска на едно 9 сантиметрово петри и повече от 9 диска на 15 сантиметрово петри. В повечето случаи интерпретацията се адаптира както спрямо микроорганизма, така и спрямо средата. Процедурите по изготвяне на антибиограмата не се различават от гореописаните.

Анаеробни бактерии не трябва да се тестуват с дисково дифузионен метод.


Streptococcus spp.

За тестуване на Streptococcus pneumoniae и други стрептококи е необходимо към Мюлер-Хинтон агара да се добави 5% дефибринирана овнешка кръв.

За антибиограмата се използва 16-18 часова култура върху кръвен агар. Колониите се суспендират в Мюлер-Хинтон бульон или във физиологичен разтвор до достигане на мътнина, отговаряща на 0.5McF.
Haemophilus influenzae

За изследване на H. influenzae, към Мюлер-Хинтон агара може да се добавят различни субстанции. Най-често използвани са NAD (15 g/ml), bovine hematin (15 g/ml), дрождев екстракт (5 mg/ml). При изследване на триметоприм и сулфонамиди може да се добави thymidine phosphorylase (0.2 U/ml). Това е съставът на Haemophilus Test Medium. Суспензията се подготвя от 24 часова култура върху шоколадов агар в Мюлер-Хинтон бульон или физиологичен разтвор до мътнина, отговаряща на 0.5 McF. Тази мътнина осигурява 1-4 х 108 КОЕ/мл. По-голяма гъстота ще даде фалшива резистентност към -лактамните антибиотици, особено при -лактамаза продуциращи щамове. Петритата се инкубират на 350С в атмосфера с 5% СО2 за 16-18 часа.


Neisseria gonorrhoae

За тестуване на N. gonorrhoae се използва GC агар. Към него се добавя 1% суплемент. Суплементът не съдържа цистеин, който може да инактивира някои -лактамни антибиотици. Съставът му е L-цистин, гуанин HCL, пара-аминобензоева киселина, кокарбоксилаза, вит В12, NAD, аденин, L-глутамин, глюкоза и железен нитрат. Бактериалната суспензия се подготвя от 24 часова култура върху шоколадов агар в Мюлер-Хинтон бульон или физиологичен разтвор до мътнина, отговаряща на 0.5 McF. Когато се тестуват антимикробни агенти, даващи много широки зони на задръжка (напр. хинолони), е желателно да се поставят по-малък от гореспоменатия брой дискове на едно петри. Петритата се инкубират на 350С в атмосфера с 5% СО2 за 20-24 часа.


Качествен контрол (2)

Качествен контрол се извършва, за да се установи прецизността при извършване на тестовете за чувствителност, годността на реагентите и подготовката на персонала, отчитащ резултатите. Използват се щамове, чиято антибиотична чувствителност е известна. Тези щамове са:



Enterococcus faecalis ATCC 29212 – използва се за контролиране съдържанието на тимидин в Мюлер-Хинтон агара, когато се тестуват сулфонамиди и trimethoprim (като алтернатива може да се използва щам Enterococcus faecalis ATCC 33186). Използва се също за контрол на дисковете, с които се изпитва високо ниво на аминогликозидна резистентност.

Escherichia coli ATCC 25922

Escherichia coli ATCC 35218 – използва се за контрол на комбинациите от -лактам с -лактамазен инхибитор.

Haemophilus influenzae ATCC49247

Haemophilus influenzae ATCC49766

Klebsiells pneumoniae ATCC700603 – използва се за контрол на тестовете за откриване на ESBL.

Neisseria gonorrhoae ATCC49226

Pseudomonas aeruginos

a ATCC27853

Staphylococcus aureus ATCC25923

Streptococcus pneumoniae ATCC49619

Качественият контрол се извършва по стандарта за дисково дифузионния метод.

Тест-щамовете трябва да се съхраняват при температури -20С (или по-добре на -60С или в течен азот), суспендирани в стабилизатор (50% фетален телешки серум в бульон, 10-15% глицерол в триптично-соев бульон, дефибринирана овнешка кръв или scim milk) или в лиофилизирано състояние. Работните контролни култури трябва да се съхраняват върху триптично-соев агар (за невзискателните микроорганизми) или върху шоколадов агар (за взискателните микроорганизми) при 2С - 8С и да се субкултивират ежеседмично. Работните контролни култури се опресняват най-много на 1 месец от замръзените или лиофилизирани култури. Преди тестуването, щамовете трябва да се субкултивират върху агарова среда за получаване на единични колонии. Субкултивирането от замръзените и лиофилизирани култури трябва да е двукратно преди тестуване с контролните щамове. Ако при отчитане на резултатите от контролните антибиограми се установят резултати, показващи промяна в контролните щамове, е необходимо подновяване на културите.

Контролни антибиограми се правят ежедневно или ежеседмично.

При ежедневно контролиране се допуска отклонение от стандартните норми при един от 20 теста за дадена комбинация от микроорганизъм/антибиотик. Всяко по-голямо отклонение изисква корекции – подмяна на дисковете, освежаване на контролната култура и т.н.

За преминаване от ежедневен към ежеседмичен контрол е необходимо тестуване в 30 последователни дни. Допустимото отклонение е 3 от 30 теста на дадена комбинация от микроорганизъм/антибиотик.

След преминаване на ежеседмичен контрол е необходимо да се обръща внимание на всеки резултат, излизащ от стандартните граници.

Контролно тестуване се извършва задължително при всяко постъпване на нови партиди Мюлер-Хинтон агар и дискове.

При въвеждане на нов антимикробен агент е необходимо тестуване последователно в 30 дни. При получаване на удовлетворителен резултат, тези дискове могат да се тестуват един път седмично. Такова 30 дневно тестуване е необходимо и при въвеждане на значителна промяна в метода на отчитенето на атибиограмите (напр. преминаване от мануално към автоматизирано).

При установяване несъвпадение на резултатите от контролните антибиограми със стандартните граници на зоните, грешките трябва да бъдат открити и отстранени. Такива грешки най-често са:



  • използване на негодни дискове;

  • използване на негодни контролни щамове;

  • замърсяване на контролните щамове;

  • неподходящи температура и атмосфера при инкубацията;

  • нестандартна дебелина на агара.

При отстраняване на тези фактори се прави повторно тестуване и ако резултатите са в рамките на стандарта не се налагат повече корекции.

Ако не се установи някоя от гореспоменатите грашки, в 5 последователни дни се тестуват комбинациите микроорганизъм/антибиотик, при които е имало отклонение. Ако всичките 5 тестувания показват резултати, отговарящи на стандарта, не е необходимо повече тестуване. Ако има едно или повече отклонения, са необходими допълнителни проверки, които имат за цел да установят дали:



  • зоните на задръжка са измерени и отбелязани правилно;

  • използвания стандарт за мътнина не е с изтекъл срок на годност, дали е правилно съхраняван и добре разбит преди употреба;

  • всички материали, използвани при залагане на контролните антибиограми са в срок на годност и правилно съхранявани;

  • температурата и атмосферата в инкубатора отговарят на изискванията;

  • дисковете са съхранявани с десикатор и на подходяща температура

  • суспензията е правилно подготвена и със стандартна мътнина;

  • инокулума за теста е подготвен от правилно инкубирана бактериална култура ( не повече от 24 часова).

Необходимо е подновяване на контролните щамове и на всички материали, използвани при подготвянето на антибиограмите. При установяване на грешка, произтичаща от производителя, е необходимо осъществяване на контакт с него. От полза е вземането на тест-щамове и материали от други лаборатории, както и, по възможност, използването на друг метод за изпитване на чувствителност до коригиране на отклоненията.

ДРУГИ ДИФУЗИОННИ МЕТОДИ (3)



Е- тест епсилометър : Е-тест е техника за определяне на МПК на различни антибиотици към бързорастящи и взискателни микроорганизми.

Принцип: Е-тестът представлява пластмасова лента върху която от едната страна е натоварен антибиотик с концентрационнен градиент. След инкубация пресичането на растежната елипса и лентата дава МПК при директно отчитане. Изборът на среда, изготвянето на инокулума, инкубацията и инкубационната температура са напълно еднакви с описания по-горе ДДМ.

Избор на ленти: Поради релативно високата цена на лентата, Е-тестът не може да замести стандартния ДДМ. Само ограничен брой от най-често използуваните антибиотици трябва да се тестуват в съответствие с клиничната ситуация.

Аплициране на лентите: При погрешно поставяне на лентите се получават множество грешки и несъответствия в резултатите. Петрито трябва да е напълно сухо. Лентите се поставят с пинсета, като се започва от ниската концентрация. При поставяне надписът върху лентата трябва да е от горната страна, т.е. да може да се чете. Един път поставена, лентата не трябва да се мести, тъй като дифузията на антибиотика започва веднага.

Интерпретация: След определен период на инкубация, обикновенно 12-18 часа или повече за взискателните бактерии, МПК съотвества на точката на пресичане между лентата и ръба на зоната на задръжка. Ако зоновият ръб е разлят, МПК трябва да се отчете на 2/3 от зоната на инхибиция. В някои случаи се наблюдава т.н. “dip-effect”-ефект на издължаване на долната част на елипсата, особено при пневмококи, ентерококи и стафилококи. В тези случаи МПК се отчита чрез образуване на мислена линия-продължение на гората част на елипсата, до пресичане с лентата. Грешно е в тези случаи да се отчита точката на истинското пресичане. Неспазването на това изискване води до несъответствие в резултатите от определяне на МПК чрез разреждане на антибиотика в агар и Е-тест.

Заключение: Според публикуваните данни, при стриктно спазване изискванията на техниката, резултатите от Е-тест се различават от референтните методи с 1 разреждане.
Директни тестове за чувствителност от клинични материали: При спешни клинични ситуации е предложен директен метод за тестуване на антибиотикочувствителност. Важно е да се знае, че данните от тази техника са валидни само при изследване на нормално стерилни телесни течности. Микроскопското изследване на материала ликвор, кръв, урина и др. показва, че той съдържа един тип бактерии и може да даде информация за количеството на бактериите. Част от материала се суспендира в бульон, като за получаване мътнина 0,5 McF се добавя бульон или стерилна дестилирана вода. Използуването на дестилирана вода елиминира въздействието на еритроцитите върху мътнината. Инокулира се върху агара и се поставят дисковете. Резултатите от това изследване са предварителни и е необходимо допълнително извършване на конвенционалните методи за антибиотик-чувствителност след изолиране на причинителя.

Резултатите от директният тест се сравняват с резултатите от стандартизираният ДДМ. Наблюдават се някои различия:



  1. Сулфонамидите и trimethoprime често показва резистентност, тъй като средата за хемокултури съдържа голямо количество тимидин и други антагонизиращи субстанции.

  2. Наличието на натриев полианетол сулфонат или други инактивиращи антибиотиците субстанции могат да антагонизират някои пеницилини, аминогликозиди и особено гликопептидите.


Бърз тест за чувствителност препоръчан метод: Най- важният фактор, определящ размера на зоната на задръжка е критичното време. Растежът извън зоната на достигнатата специфична концентрация на антибиотик продължава, независимо от продължаващата дифузия на антибиотик. Това показва, че резултатите от ранното отчитане на зоните на задръжка са съпоставими с тези, получени при отчитането след необходимото времетраене на инкубацията при стриктно спазване на метода на Kirby – Bauer. Отчитането след 5 – 8 часа е приложимо и следователно могат да се правят модификации на стандартния метод. Бързият метод се различава от метода по Kirby – Bauer по:

  1. Темпериране на петритата до 370 преди инокулацията

  2. Приготвяне на суспензия с мътнина 1 McF без преинкубация

  3. Добавяне на 5% кръв за грам+ микроорганизъм

  4. Отчитане след 5 часова инкубация

  5. Категоризиране на интермедиерните щамове със зони, близки до тези за чувствителност, като чувствителни.

Този метод може да се използва за ентеробактериацее, грам+ коки и пседвомонас, където съпоставимостта на резултатите е 98.9, 98.7 и 97.9% респективно. Според този метод щамовете са или чувствителни, или резистентни. Независимо, че след 5 часова инкубация зоните на задръжка са по-тесни, измерването им след 18 часова инкубация не променя категоризирането на щамовете като чувствителни, или резистентни. Резултатите могат да се отчетат и на 4 час, с изключение на M.morganii и пневмококи. Някои псевдомонаси изискват 5 до 6 часа инкубация за добро отчитане.

ИЗБОР НА АНТИБИОТИЧНИ ДИСКОВЕ (3)




Staphylococcus spp.

Streptococcus spp. (+pneumococci), Enterococcus spp.

Penicillin G

Oxacillin

Amoxicillin/Clav.acid

Gentamicin

Tobramycin

Amikacin

Tetracyclin

Erythromycin

Lincomycin или Clindamycin

TMP/SMX


Vancomycin

Teicoplanin

Chloramphenicol


Penicillin G

Oxacillin

Ampicillin

Cephalothin

Erythromycin

Clindamycin

Chloramphenicol

Tetracyclin

Vancomycin

Teicoplanin

Gentamicin HL

Streptmycin HL






Enterobacteriaceae

Pseudomonas spp.

Ampicillin Ciprofloxacin

TMP/SMX


Cephalothin

Cefuroxime Cefepime (при полирезистентност)

Cefoxitin

Cefotaxime или Ceftriaxone

Ceftazidime

Aztreonam

Amoxicillin/Clav.acid

Piperacillin

Piperacillin/Tazobactam

Imipenem


Gentamicin

Tobamycin

Amikacin

Chloramphenicol

Tetracyclin

Nalidix acid



Ticarcillin

Ceftazidime

Aztreonam

Piperacillin

Piperacillin/Tazobactam

Imipenem


Gentamicin

Tobamycin

Amikacin

Chloramphenicol

Tetracyclin

Ciprofloxacin

TMP/SMX





ВРОДЕНА РЕЗИСТЕНТНОСТ НА НЯКОИ МИКРООРГАНИЗМИ (1)




МИКРООРТАНИЗЪМ

АНТИМИКРОБНИ ПРЕПАРАТИ

Всички Enterobacteriaceae

Penicillin G, гликопептиди, MLS - група, Mupirocin

А. baumanii

Ampicillin, Amoxicillin, Cef-1

P. aeruginosa

Ampicillin, Amoxicillin, Amoxicillin/clav.ac, Cef-1,2 ,

Cefotaxime, Ceftriaxone, Nalidix acid, Trimethoprim



B. cepacia

Ampicillin, Amoxicillin, Cef-1, colistin, аминогликозиди

S. maltiphilia

всички -лактами с изкл. на

Ticarcillin/Clav. ac., аминогликозиди



F. meningosepticum

Ampicillin, Amoxicillin, Cef-1

Salmonella spp.

Cefuroxime

Klebsiella spp., C. diversus

Ampicillin, Amoxicillin., Carbemicillin, Ticarcillin

Enterobacter spp., C. freundii

Ampicillin, Amoxicillin, Amoxicillin/clav.ac, Cef-1, Cefoxitin

M. morganii

Ampicillin, Amoxicillin, Amoxicillin/clav.ac, Cef-1, Cefuroxime, Nitrofurantoin

Providencia spp

Ampicillin, Amoxicillin, Amoxicillin/clav.ac, Cef-1, Cefuroxime, Gentamicin, Netilmicin, Tobramycin, Nitrofurantoin

P. mirabilis

Nitrofurantoin

P. vulgaris

Ampicillin, Amoxicillin, Cefuroxime, Nitrofurantoin

Serratia spp.

Ampicillin, Amoxicillin, Amoxicillin/clav.ac, Cef-1, Cefuroxime

Y. enterocolitica

Ampicillin, Amoxicillin, Carbemicillin, Ticarcillin,

Cef-1


H. influenzae

Penicillin G, Erythromycin, Clindamycin

M. catarrhalis

Trimethoprim

Всички грам + бактерии

Aztreonam, Nalidix acid, Temocillin

Streptococcus spp

аминогликозиди изп. се само като синергисти

S. pneumoniae

Trimethoprim, аминогликозиди

MRSA

всички -лактами

Enterococcus spp.

Penicillin G, Carbemicillin, Ticarcillin, всички цефалоспорини, аминогликозиди, Mupirocin

Listeria spp.

Цефалоспорини трета генерация, флуорохинолони


НЕОБИЧАЙНА РЕЗИСТЕНТНОСТ, КОЯТО ИЗИСКВА ДОПЪЛНИТЕЛНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ (1)


МИКРООРТАНИЗЪМ

АНТИМИКРОБНИ ПРЕПАРАТИ

S. aureus

Vancomycin, Teicoplanin, Linezolid,

Quipristin/Dalfopristin


CNS

Vancomycin, Linezolid
С. jeikejum

Vancomycin, Teicoplanin, Linezolid

S. pneumoniae

Meropemem,Vancomycin, Teicoplanin, Linezolid,

-Strptococcus gr. A, B, C, G

Penicillin, Vancomycin, Teicoplanin, Linezolid

Enterococcus spp.

Quipristin/Dalfopristin и

Ampicillin, Linezolid, Teicoplanim но не Vancomycin



Enterobacteriaceae

Meropenem, Imipenem (освен Proteus spp.)

H. influenzae

Цефалоспорини 3 генерация, карбапенеми

M. catarrhalis

Ciprofloxacin

N. meningitidis

Penicillin, Ciprofloxacin

N. gonorrhoeae

Цефалоспорини 3 генерация

Acinetobacter; P. aeruginosa

Colistin

Всички анаероби

Метронидазол

Bacteroides

Метронидазол, Amoxicillin/Clav.ac., карбапенеми

C.difficile

Метронидазол, Vancomycin

При изолиране на щамове с описаната в таблицата резистентност трябва да се направи следното:



  1. Да се провери идентификацията на щама

  2. Да се контролира метода за определяне на лекарствената чувствителност

  3. Ако щамът е правилно идентифициран и резистентността е потвърдена, да се изпрати в НРЛ по Контрол и Мониториране на Антибиотичната Резистентност



РЕЗИСТЕНТНОСТ ПРИ НЯКОИ МИКРООРГАНИЗМИ КЪМ НЯКОИ АНТИБИОТИЦИ, КОЯТО МОЖЕ ДА ВЪЗНИКНЕ В СЛЕДСТВИЕ НА МУТАЦИИ (1)

МИКРООРТАНИЗЪМ

АНТИМИКРОБНИ ПРЕПАРАТИ

Staphylococci

Rifampin, Fluoroquinolones

ER-R Staphylococci

Clindamycin
S. pneumoniae

Ciprofloxacin

P. aeruginosa

Всички антипсевдомонасни

антибиотици



Enterobacter

Citrobacter

Serratia

Всички Cef-3

Колиформи с ESBL

Цефамицини

Всички колиформи

Nalidixic acid

Serratia marcescens

Netilmicin, Tobramycin,

Amikacin, Kanamycin


Литература:


1. David M. Livermore, Trevor G. Winstanley, Kevin P. Shannon, Interpretative reading: racognizing the unusual and inferring resistance mechamisms from resistance phenotypes, Journal of Antimicrobial Chaemotherapy, (2001) 48, Suppl.S1, 87-102,

2. National Committee for Clinical Laboratory Standarts, Performance Standards for Amtimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard – Seventh Edition; M-2-A7, Vol. 20 No.1, January 2000.

3 Victor Lorian , MD, Antibiotics in laboratory medicine, Fourth edition, , 1996.

4. Сборник от инструктивни материали по микробиологична диагностика на бактериалните инфекции, Том ІІ, 1990.


ИНДИКАТОРНИ АНТИБИОТИЦИ (1)



МИКРООРГАНИЗЪМ


R към

ПОКАЗВА…

Staphylococci


Oxacillin

Резистентност към всички -лактами

Staphylococci

Erythromycin

Индуцибелна CC-R. Да се избягва използването на CC или да се използва внимателно.

Staphylococci

Erythromycin + Clindamycn

Конститутивна MLS – R.

Pneumococci

Oxacillin зона 18мм

Вероятна Pen-R. Да се изследва МПК.

E. faecalis

Ampicillin

Да се провери идентификацията – вероятно се касае за E. faecium, но е възможна придобита R.

H. influenzae

Cefaclor

Не--лактамазна R.

N. gonorrhoeae/

H. influenzae

Nalidixic acid

Редуцирана чувствителност или резистентност към флуорохинолони.

Klebsiella/E. coli

CAZ или CPD

Вероятна ESBL. Да не се използват Cef, с изключение на цефамицини.

Enterobacteriaceae

Cef-2

-лактамаза. Да не се използват и Cef-1.

Enterobacteriaceae

Cef-3

-лактамаза. Да не се използват и Cef-1,2. с изключение вероятно на цефамицини.

Enterobacteriaceae

R към уреидопеницилини

Пеницилиназа. Да не се използват и амино- и карбокси-пеницилини.

Enterobacteriaceae

R към комбинации на -лактам с инхибитор

R и към -лактами без инхибитор.

Легенда: CAZ – Ceftazidime; CPD – Cefpodoxime; Cef-1,2,3 - Цефалоспорини 1,2,3 генерация; CC – Clindamycn; MLS – макролиди, линкозамиди, стрептограмини, Pen - Penicillin
Каталог: pages
pages -> Джошкун кьокел
pages -> V здравноосигурителни вноски
pages -> Проф д-р Георги Ончев, дмн
pages -> St cyril and st methodius
pages -> Инструкция за реда и условията за предоставяне на стипендии за успех и специални стипендии по проект bg051PO001 06 „студентски стипендии, осъществяван с финансовата подкрепа на оперативна програма
pages -> Аржентина водопадите игуасу бразилия не просто танго, вода и самба
pages -> Закон за оръжията, боеприпасите, взривните вещества и пиротехническите изделия (извлечение) в сила от 17. 09. 2010 г. Обн. Дв бр. 73 от 17 Септември 2010г., изм. Дв бр. 88 от 9 Ноември 2010г., изм. Дв б
pages -> 1. един важен въпрос
pages -> Отчет за развитието на
pages -> Класическа Grand Prix звездите на 111-годишната история на Opel в света на моторните спортове


Поделитесь с Вашими друзьями:


База данных защищена авторским правом ©obuch.info 2019
отнасят до администрацията

    Начална страница