Р е п у б л и к а б ъ л г а р и я министерство на здравеопазването наредба № …/ за определяне на подробни правила за представяне на информацията по чл. 19, пар. 4 на Регламент

За продукти, съдържащи около 6% (М/М) водороден прекис, разликата между резултатите от две определения, проведени паралелно върху една и съща проба, не трябва да превишава абсолютната стойност от 0,2%.

(¹) виж ISO 5725

ІХ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕНО ОПРЕДЕЛЯНЕ НА НЯКОИ ОКИСЛИТЕЛНИ БАГРИЛА В БОИ ЗА КОСА

1. Област на приложение

Методът се отнася за идентификация и полуколичествено определяне на следните субстанции в бои за коса в течна и кремообразна форма:

Субстанция	Означение
Фенилендиамини o-фенилендиамин m-фенилендиамин р-фенилендиамин	(о-ФДА) (м-ФДА) (п-ФДА)
Метилфенилендиамини 4-метил-1,2-фенилендиамин (толуен-3,4-диамин) 4-метил-1,3-фенилендиамин (толуен-2,4-диамин) 2-метил-1,4-фенилендиамин (толуен-2,5-диамин)	(о-ТДА) (м-ТДА) (п-ТДА)
Диаминофеноли 2,4-диаминофенол	(ДАФ)
Хидрохинон 1,4-бензендиол	(Х)
α-нафтол	(а-Н)
Пирогалол 1,2,3-трихидроксибензен	(П)
Резорцинол 1,3-дихидроксибензен	(Р)

Окислителните багрила, съдържащи се в бои за коса в течна и кремообразна форма се екстрахират с 96% етанол при рН 10 и се идентифицират с едно- и двупосочна тънкослойна хроматография.

За полуколичествено определяне на тези субстанции, хроматограмата на пробите се сравнява с тази на стандартни субстанции в 4 проявяващи системи (подвижни фази), получени едновременно и при същите условия.

3. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация „чист за анализ” (ч.з.а.), а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Етанол, безводен.

3.2. Ацетон.

3.3. Етанол, 96% (V/V).

3.4. Амонячен разтвор, 25% (d₄²⁰=0,91).

3.5. L(+)-аскорбинова киселина.

3.6. Хлороформ.

3.7. Циклохексан.

3.8. Азот, технически.

3.9. Толуен.

3.10. Бензен.

3.11. н-Бутанол.

3.12. Бутан-2-ол.

3.13. Хипофосфорна киселина, 50% (V/V).

3.14. Диазо реагент:

- 3-нитро-1-бензендиазониев хлоробензенсулфонат (стабилизирана сол),

- 2-хлоро-4-нитро-1-бензендиазониев нафталенбензоат (стабилизирана сол)

3.15. Сребърен нитрат.

3.16. п-Диметиламинобензалдехид.

3.17. 2,5-Диметилфенол.

3.18. Ферихлорид хексахидрат.

3.19. Солна киселина, 10% (V/V).

3.20. Стандартни субстанции.

Стандартнитe субстанции са посочени в т. 1 Област на приложение.

При аминосъединенията стандартната субстанция трябва да бъде или хидрохлорид (моно- или ди-) или свободна основа.

3.21. Стандартни разтвори, 0,5% (M/V).

Приготвя се 0,5% (M/V) разтвор на всяка стандартна субстанция (3.20).

Претеглят се 50 mg ± 1 mg от стандартната субстанция в мерителна колба от 10 cm³ (ml).

Добавят се 5 cm³ (ml) 96% етанол (3.3) и 250 mg аскорбинова киселина (3.5).

Разтворът се алкализира с амонячен разтвор (3.4), до рН 10 (тест с индикаторна хартия).

Долива се до 10 cm³ (ml) с 96% етанол (3.3) и се разбърква.

Разтворите могат да се съхраняват до една седмица на студено и тъмно място.

В някои случаи, след добавянето на аскорбинова киселина и амоняк, може да се образува утайка.

Преди работа тези разтвори се оставят да се утаят.

3.22. Системи разтворители за хроматографско разделяне (подвижни фази).

3.22.1. Ацетон : хлороформ : толуен = 35 : 25 : 40 (V/V/V).

3.22.2. Хлороформ : циклохексан : абсолютен етилов алкохол : 25% амоняк = 80 : 10 : 10 : 1 (V/V/V/V).

3.22.3. Бензен : бутан - 2-ол : вода = 50 : 25 : 25 (V/V/V).

Разклаща се добре след разделяне при стайна температура (20⁰C до 25⁰С)

и се използва горната фаза.

3.22.4. н-Бутанол : хлороформ : реагент М = 7 :70 : 23 (V/V/V).

Разделя се внимателно при стайна температура (20⁰С до 25⁰С) и се използва долната фаза.

Реагент М:

Амонячен разтвор, 25% (V/V) - 24 обемни части

Хипофосфорна киселина, 50% (3.13) - 1 обемна част

Вода - 75 обемни части

3.23. Индикаторни спрейове (проявяващи реактиви).

3.23.1. Diaso реагент.

От избрания реагент (3.14) се приготвя непосредствено преди употреба 5% (M/V) воден разтвор.

3.23.2. Реагент на Ehrlich.

Разтварят се 2,0 g п-диметиламинобензалдехид (3.16) в 100 cm³ (ml) воден разтвор на солна киселина 10% (M/V) (3.19).

3.23.3. 2,5-Диметилфенол-ферихлорид хексахидрат.

Разтвор 1: Разтваря се 1,0 g диметилфенол (3.17) в 100 cm³(ml) 96% етанол (3.3).

Разтвор 2: Разтварят се 4,0 g ферихлорид хексахидрат (3.18) в 100 cm³ (ml) 96% етанол (3.3).

За проявяване хроматограмата се пръска последователно с разтвор 1 и после с разтвор 2.

3.23.4. Сребърен нитрат - амонячен разтвор

Към 5% (M/V) воден разтвор на сребърен нитрат (3.15), се добавя 25% амоняк (3.4), докато утайката се разтвори. Приготвя се непосредствено преди употреба. Остатъкът от разтвора се изхвърля.

4.1. Стандартна апаратура за тънкослойна хроматография.

4.1.1. Пластмасов или стъклен капак с конструкция, която осигурява хроматографската плака да е в азотна атмосфера при проявяване и сушене на петната. Тази предпазна мярка е необходима, поради податливостта на някои багрила към окисление.

4.1.2. Микроспринцовка от 10 µl, градуирана през 0,2 µl, с игла с квадратно сечение или препоръчително дозаторно устройство от 50 µl, монтирано върху скобата на статива, така че плаката да бъде под азот.

4.1.3. Тънкослойни силикагелни плаки 20х20 сm с дебелина на слоя 0,25 mm (Macherey and Nagel, Silica G-HR или еквивалентни).

4.2. Центрофуга, 4000 rpm.

4.3. Центрофужни епруветки, 10 cm³ (ml), с полиетиленови капачки на винт или еквивалентни.

5. Процедура

5.1. Подготовка на пробите

При изстискване на тубата, първите 2-3 cm се отстраняват. В центрофужна епруветка (4.3), предварително продухана с азот, се поставят 300 mg аскорбинова киселина и 3,0 g кремообразна или хомогенизирана течна боя. Добавя се 25% амоняк (3.4) на капки до рН 10. Долива се до 10 cm³ (ml) с 96% етанол (3.3), хомогенизира се под азот (3.8), ценрофугира се 10 min. при 4000 rpm. Изследва се горния слой на течната фаза.

5.2. Хроматографски анализ

5.2.1. Нанасяне на разтворите върху плаките

На хроматографската плака (4.1.3) се маркира стартова линия на 1,5 cm от ръба и. Върху 9 точки се нанасят по 1,0 µl от стандартните разтвори, в посочения ред:

Върху точки 10 и 11 се нанасят по 2,0 µl от разтвора на пробата (5.1).

Нанасянето на стандартите и пробите се извършва под азот (3.8) и плаката се държи под азот до момента на хроматографирането.

5.2.2. Хроматографско разделяне

Хроматографската вана е предварително продухана с азот (3.8) и наситена с една от четирите подвижни фази (3.22). Плаката се поставя във ваната при стайна температура (20⁰С до 25⁰С) на тъмно, докато фронта достигне 15 сm от стартовата линия, след което се изважда и изсушава под азот (3.8) при стайна температура.

5.2.3. Проявяване на петната

Плаката се напръсква веднага с един от четирите разтвора, описани в 3.23.

5.2.4. Идентифициране

Сравняват се R_f-стойностите и цветовете на получените петна от пробата с тези на стандартните разтвори.

В табл. 1 са представени R_f-стойностите и цветовете на петната на всички стандартни субстанции в съответните подвижни фази и използваните проявяващи реактиви.

По този методика понякога може да се получи спорна идентификация при сравняване на петната на съответните стандартни субстанции с тези на пробата.

5.2.5. Полуколичествено определяне

Сравнява се визуално интензивността на петната на всяко вещество, идентифицирано съгласно 5.2.4 със серия от стандартни разтвори с подходяща концентрация.

Ако концентрацията на една или повече субстанции в пробата е много висока, пробата се разрежда и определението се повтаря.

1. о-ФДА се проявява слабо; трябва да се използва подвижна фаза (3.22.3), за да се разграничи ясно от о-ТДА.

2. (*) показва най-добро развитие на цвета.

6. Изпитване с двупосочна тънкослойна хроматография

Двупосочната хроматографска процедура изисква употребата на допълнителни стандарти и реактиви.

6.1. Допълнителни стандартни разтвори и субстанции

6.1.1. β-Нафтол (β-Н).

6.1.2. 2-Аминофенол (о-АФ).

6.1.3. 3-Аминофенол (м-АФ).

6.1.4. 4-Аминофенол (п-АФ).

6.1.5. 2-Нитро-1,4-фенилендиамин (2-НПФДА).

6.1.6. 4-Нитро-1,2-фенилендиамин (4-НОФДА).

Приготвят се 0,5% (M/V) разтвори на всички допълнителни стандартни субстанции, както е описано в 3.21.

6.2. Допълнителна подвижна фаза

6.2.1. Етилацетат : циклохексан : амонячен разтвор (25%) = 65 : 30 : 0,5 (V/V/V).

6.3. Допълнителна индикаторна система за проявяване на петната

Във ваната за тънкослойна хроматография се поставя стъклен съд с 2,0 g йодни кристали и ваната се затваря с подходящ капак.

6.4. Хроматографиране

6.4.1. Върху абсорбиращата повърхност на плаката за тънкослойна хроматография (4.1.3) се начертават две линии, както е показано на фиг.1.

6.4.2. Под азотна атмосфера (4.1.1) се нанасят от 1 до 4 µl от екстракта на пробата на стартова точка 1 (фиг. 1), която е на 2 сm от двете страни на плаката.

Количеството на нанесения екстракт зависи от интензивността на петната върху хроматограмите 5.2.

Фиг. 1

6.4.4. Повтаря се операция (6.4.3) за стартови точки 4 и 5 (фиг.1) - разстояние между точките 1,5 cm и се оставя плаката под азот до момента на хроматографиране.

6.4.5. Хроматографската вана се продухва с азот (3.8) и се насища с подвижна фаза (3.22.2).

Плаката (6.4.4) се поставя във ваната в първата посока (фиг.1) на тъмно.

Хроматографирането продължава докато фронта на подвижната фаза достигне маркираната линия върху плаката (приблизително 13 cm).

6.4.6. Плаката се изважда от ваната и се поставя в друга, предварително продухана с азот, където престоява поне за 60 min, за да се изпарят разтворителите.

6.4.7. В следваща хроматографска вана, също предварително продухана с азот (3.8) и наситена с подвижна фаза (6.2), плаката се поставя обърната на 90⁰.

Хроматографира се във втората посока (също на тъмно), докато фронтът на подвижната фаза достигне начертаната линия върху абсорбиращата повърхност (фиг. 1), след което се изважда от ваната и се оставя на въздух да се изпарят разтворителите.

6.4.8. Плаката се поставя за 10 min. в хроматографската вана с йодни пари (6.3). Двупосочната хроматограма се тълкува, като се използват R_f-стойностите и цвета на стандартните субстанции, хроматографирани по същото време. В табл. 2 са посочени цветовете на петната на стандартните субстанции.

Забележка: За да се получи максимално оцветяване на петната, хроматограмата се оставя на въздух за половин час след проявяване на петната.

6.4.9. Наличието на окислителни багрила, открити в 6.4.8, може окончателно да се потвърди с повторение на операциите, описани в 6.4.1 до 6.4.8 и добавяне в стартова точка 1, върху количеството нанесена проба (6.4.2), на 1 µl от стандартните разтвори, идентифицирани в т.6.4.8.

Ако не се открие друго петно, сравнено с получената хроматограма в 6.4.8, тълкуването й е правилно.

Таблица 2

Методът се отнася за определяне на нитрити в козметични продукти, в частност в кремове и пасти.

Присъствието на нитрити се установява чрез образуване на цветни производни с 2-аминобензалдехид фенилхидразон (Nitrin^).

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а), а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

3.1. Разредена сярна киселина: 2 cm³ (ml) концентрирана сярна киселина (d₄²⁰=1,84) се разреждат с 11 cm³ (ml) дестилирана вода.

3.2. Разредена солна киселина: 2 cm³ (ml) концентрирана солна киселина (d₄²⁰=1,19) се разреждат с 11 cm³ (ml) дестилирана вода.

3.3. Метанол.

3.4. Разтвор на 2-аминобензалдехид фенилхидразон (реактив Nitrin^) в метанол.