Р е п у б л и к а б ъ л г а р и я министерство на здравеопазването наредба № …/ за определяне на подробни правила за представяне на информацията по чл. 19, пар. 4 на Регламент

Инжектират се 2 до 3 µl в хроматографа, като се използват условията от 6.2.2.

Изчисляват се съотношенията на пиковите площи (метанол/етанол) или (метанол/пропан-2-ол) на всяка смес. Начертава се стандартна графика:

Х-ос: % метанол във връзка с етанол или пропан-2-ол.

У-ос: съотношение на пиковите площи (метанол/етанол) или (метанол/пропан-2-ол).

7.3. Стандартната крива трябва да има линеен характер.

За 5% съдържание на метанол, във връзка с етанол или пропан-2-ол, разликата в резултатите от две паралелни определения, извършени с една и съща проба не трябва да надвишават 0,25%.

(¹) виж ISO 5725

ХІV. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ДИХЛОРМЕТАН И 1,1,1-ТРИХЛОРЕТАН

1. Област на приложение

Методът се отнася за определянето на дихлорметан (метиленхлорид) и 1,1,1-трихлоретан (метилхлороформ) във всички козметични продукти, които вероятно могат да съдържат тези разтворители.

Съдържанието на дихлорметан и 1,1,1-трихлоретан в пробата, определени по този метод, се изразяват в % (M/M).

Определянето се извършва чрез газова хроматография с хлороформ като вътрешен стандарт.

Всички реактиви трябва да са с квалификация за “газова хроматография”.

4.1. Хлороформ (CHCl₃).

4.2. Тетрахлорметан (CCl₄) .

4.3. Дихлорметан (CH₂Cl₂).

4.4. 1,1,1-трихлоретан (CH₃CCl₃).

4.5. Ацетон.

4.6. Азот.

5.1. Стандартно лабораторно оборудване.

5.2. Газхроматограф с катарометър.

5.3. Бутилка за прехвърляне, 50 – 100 сm³ (ml) (виж т. ІІ. Лабораторно приготвяне на пробите за изпитване, 5.2)

5.4. Спринцовка за газ под налягане, 25 или 50 µl (виж т. ІІ. Лабораторно приготвяне на пробите за изпитване, 5.3.2.2).

6. Процедура

6.1. Проба, която не е под налягане: в конична колба със запушалка се претегля проба с точност 0,001g. Прибавя се точно претеглено количество хлороформ (4.1) като вътрешен стандарт, еквивалентно на предполагаемото количество дихлорметан или 1,1,1-трихлоретан, съдържащо се в пробата. Разбърква се добре.

6.2. Проба под налягане: използва се методът за взeмане на проби, описан в т. ІІ. Лабораторно приготвяне на пробите за изпитване, но със следните уточнения:

6.2.1. След прехвърляне на пробата в бутилката за прехвърляне (5.3), в нея се въвежда като вътрешен стандарт определен обем хлороформ (4.1), еквивалентен на предполагаемото количество дихлорметан или 1,1,1-трихлоретан, съдържащ се в пробата. Разбърква се добре. Мъртвият обем на вентила се промива с 0,5 сm³ (ml) тетрахлорметан (4.2). След изсушаване, по разликата се определя точната маса на прибавения вътрешен стандарт.

6.2.2. След напълване на спринцовката с проба, накрайникът на спринцовката се продухва с азот (4.6), така че да няма остатъци преди инжектиране в хроматографа.

6.2.3. След вземане на всяка проба, повърхността на вентила и съда за прехвърляне трябва да се промият няколко пъти с ацетон (4.5) (използвайки, както се изисква, спринцовка за подкожни инжекции) и след това се подсушават напълно с азот (4.6).

6.2.4. За всеки анализ се правят измервания с използване на две различни бутилки за прехвърляне и се правят по пет измервания за бутилка.

7. Хроматографски условия

7.1. Предколона

Тръба - неръждаема стомана.

Дължина - 300 mm.

Диаметър - 3 или 6 mm.

Пълнеж - същия материал, както в аналитичната колона.

7.2. Колона

Стационарната фаза е приготвена от Hallcomid M18 върху Chromosorb.

Колоната трябва да показва разделяне R, равно или по-голямо от 1,5, като:

където:

Като примери, следните колони дават желаните резултати:

Колона	I	II
Материал	Стоманена тръба	Стоманена тръба
Дължина	350 сm	400 сm
Диаметър	3 mm	6 mm
Носител
Chromosorb	WAW	WAW-ДМЦС-HP
Ситов анализ	100-120 mesh	60-80 mesh
Стационарна фаза	HallcomidM1810%	Hallcomid M18,20%

Температурните условия могат да се различават в зависимост от апарата. За горните примери те са нагласени както следва:

Колона	I	II
Температури
Kолона	650C	750C
Инжектор	1500C	1250C
Детектор	1500C	2000C
Газ-носител
Дебит на потока от хелий	45 сm3 (ml)/min	60 сm3 (ml)/min
Налягане на входа	2,5 bar	2 bar
Инжектирана проба	15 µl	15 µl

В конична колба със запушалка се приготвя следната точно претеглена смес:

Дихлорметан (4.3), 30% (М/М).

1,1,1-трихлоретан (4.4), 35% (М/М).

Хлороформ (4.1), 35% (М/М).

9. Изчисления

9.1. Изчисляване на корекционния коефициент на вещество “р” спрямо вещество “а”, избрано като вътрешен стандарт:

Нека първото вещество е “р”, за което:

kp е неговият корекционен коефициент;

Мp е неговата маса в сместа;

Ap е площта на неговия пик.

Нека второто вещество е “а”, за което:

Тогава:

Като пример бяха получени следните корекционни коефициенти (за хлороформа k = 1):

Дихлорметан: k1 = 0,78 ± 0,03

1,1,1-трихлоретан: k2 = 1,00 ± 0,03

9.2. Изчисляване на % (М/М) на дихлорметан и 1,1,1-трихлоретан, присъстващи в анализираната проба

Нека:

Тогава:

За съдържание на дихлорметан и/или 1,1,1-трихлоретан от 25% (М/М), разликата между резултатите от две успоредни определения, извършени на една съща проба, не трябва да превишава по абсолютна стойност 2,5% (М/М).

Методът се отнася за идентификация и количествено определяне на хинолин-8-ол и неговия сулфат.

Съдържанието на хинолин-8-ол и бис (8-хидроксихинолиниев) сулфат в пробата, определени по този метод се изразява в % (M/M) като хинолин-8-ол.

3.1. Идентификация

Идентификация чрез тънкослойна хроматография.

3.2. Определяне

Определянето се провежда чрез спектрофотометриране на комплекса, получен при реакция с Fehling разтвор, при 410 nm.

4. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с квалификация “чист за анализ” (ч.з.а.), а водата дестилирана или с еквивалентна чистота.

4.1. Хинолин-8-ол.

4.2. Бензен.

Поради неговата токсичност трябва да се внимава много при работата с бензен.

4.3. Хлороформ.

4.4. Натриев хидроксид, 50% (M/M).

4.5. Меден сулфат пентахидрат.

4.6. Калиево-натриев тартарат.

4.7. Солна киселина, 1 М.

4.8. Сярна киселина, 0,5 М.

4.9. Натриев хидроксид, 1 М.

4.10. Етанол.

4.11. Бутан-1-ол.

4.12. Ледена оцетна киселина.

4.13. Солна киселина, 0,1 М.

4.14. Целит 545 или еквивалентен.

4.15. Стандартни разтвори.

4.15.1. В мерителна колба от 100 сm³ (ml) се претеглят 0.1 g хинолин-8-ол (4.1) с точност 0,001 g. Разтваря се в малко сярна киселина (4.8). Долива се до марката със сярна киселина (4.8) и се разбърква.

4.15.2. В мерителна колба от 100 сm³ (ml) се претеглят 0,1 g хинолин-8-ол (4.1) с точност 0,001 g. Разтваря се в етанол (4.10). Долива се до марката с етанол (4.10) и се разбърква.

4.16. Fehling разтвор

Разтвор А

В мерителна колба от 100 сm³ (ml) се претеглят 7 g меден сулфат пентахидрат (4.5). Разтваря се в малко вода. Долива се до марката с вода и се разбърква.

В мерителна колба от 100 сm³ (ml) се претеглят 35 g калиево натриев тартарат (4.6). Разтваря се в 50 сm³ (ml) вода. Прибавят се 20 сm³ (ml) натриев хидроксид (4.4). Долива се до марката с вода и се разбърква.

Непосредствено преди работа с пипета се вземат 10 сm³ (ml) от разтвор А и 10 сm³ (ml) от разтвор Б и се поставят в мерителна колба от 100 сm³ (ml). Долива се до марката и се разбърква.

4.17. Подвижни фази за тънкослойна хроматография:

I. Бутан-1-ол (4.11) : оцетна киселина (4.12) : вода = 80:20:20 (V/V/V).

II. Хлороформ (4.13) : оцетна киселина (4.12) =95:5 (V/V).

4.18. 2,6-дихлор-4-(хлоримино)циклохекса-2,5-диенон, 1 % (M/V) разтвор в етанол (4.10).

4.19. Натриев карбонат, 1 % (M/V).

4.20. Етанол (4.10), 30 % (V/V).

4.21. Динатриев дихидрогенетилендиаминтетраацетат, 5% (M/V).

4.22. Буферен разтвор, рН 7.

В мерителна колба от 1 dm³ (l) се претеглят 27 g безводен калиев дихидрогенортофосфат и 70 g дикалиев хидрогенортофосфат трихидрат. Долива се с вода до марката.

4.23. Готови плаки за тънкослойна хроматография.

Готови плаки за тънкослойна хроматография с дебелина 0,25 mm (Kieselgel 60 “Merck” или еквивалентни). Преди употреба се напръскват с 10 сm³ (ml) реактив (4.21) и се сушат при 80⁰С.

5.1. 100 сm³ (ml) облодънна колба с гърло на шлиф.

5.2. Мерителни колби.

5.3. Градуирани пипети, 10 и 5 сm³ (ml).

5.4. Фол-пипети, 20, 15, 10 и 5 сm³ (ml).

5.5. Делителни фунии 100, 50 и 25 сm³ (ml).

5.6. Нагъната филтърна хартия с диаметър 90 mm.

5.7. Ротационен изпарител.

5.8. Обратен хладник с шлиф.

5.9. Спектрофотометър.

5.10. Кювети с дебелина на слоя 10 mm.

5.11. Бъркалка с нагряване.

5.12. Стъклена хроматографска колона с размери: дължина 160 mm и диаметър 8 mm, с тампон от стъклен памук в долния край и адаптер за прилагане на налягане в горния край.

6. Процедура

6.1. Идентификация

6.1.1. Течни проби

6.1.1.1.Довежда се рН на част от пробата за изпитване до 7, след което от нея се нанасят 5 и 10 µl върху стартовата линия на предварително третираната плака за тънкослойна хроматография (4.23).

6.1.1.2. Накапват се 10 и 30 µl от стандартния разтвор (4.15.2) на още две точки на стартовата линия, след което плаката се поставя в една от двете подвижни фази (4.17).

6.1.1.3. Когато фронтът на разтворителя се придвижи на 15 сm, плаката се суши при 110⁰С (за 15 min). Петната на хинолин-8-ол флуоресцират в жълт цвят при УВ светлина (366 nm).

6.1.1.4. Плаката се напръсква с разтвор на натриев карбонат (4.19). Изсушава се и се напръсква с разтвор на 2,6-дихлор-4-(хлоримино) циклохекса-2,5-диенон (4.18). Хинолин-8-олът се проявява като синьо петно.

6.1.2. Твърди проби или кремове

6.1.2.1. 1 g от пробата се диспергира в 5 сm³ (ml) буферен разтвор (4.22) и се разклаща. След това се прехвърля с 10 сm³ (ml) хлороформ (4.3) в делителна фуния и се разклаща. След отделяне на хлороформения слой, водният слой се екстрахира още два пъти с по 10 сm³ (ml) хлороформ (4.3). Обединените и филтрувани хлороформени екстракти се изпаряват почти до сухо в облодънна колба от 100 сm³ (ml) (5.1) на ротационен изпарител (5.7). Остатъкът се разтваря в 2 сm³ (ml) хлороформ (4.3) и от получения разтвор се нанасят 10 и 30 µl върху плака за тънкослойна хроматография със силикагел (4.23) съгласно метода, описан в т. 6.1.1.1.

6.1.2.2. Нанасят се 10 и 30 µl от стандартния разтвор (4.15.2) на плаката и се продължава по начина, описан от т. 6.1.1.2 до т. 6.1.1.4.

6.2. Определяне

6.2.1. Течни проби

6.2.1.1. В облодънна колба от 100 сm³ (ml) се претеглят 5 g от пробата с точност 0,001 g, прибавят се 5 сm³ (ml) разтвор на сярна киселина (4.8) и сместа се изпарява почти до сухо при понижено налягане и температура 50⁰С.

6.2.1.2. Остатъкът се разтваря в 20 сm³ (ml) топла вода. Прехвърля се в мерителна колба от 100 сm³ (ml). Промива се три пъти с по 20 сm³ (ml) вода. Долива се до марката с вода и се разбърква.

6.2.1.3. С пипета се вземат 5 сm³ (ml) от разтвора и се поставят в делителна фуния от 50 сm³ (ml) (5.5). Прибавят се 10 сm³ (ml) Fehling разтвор (4.16). Медният комплекс на хинолин-8-ола [оксин мед (ISO)] се екстрахира три пъти с по 8 сm³ (ml) хлороформ (4.3).

6.2.1.4. В мерителна колба от 25 сm³ (ml) (5.2) се събират обединените и филтрирани хлороформени извлеци. Колбата се долива до марката с хлороформ (4.3) и се разклаща. Измерва се оптическата плътност на оцветения в жълт цвят разтвор срещу хлороформ при 410 nm.

6.2.2. Твърди проби или кремове

6.2.2.1. В облодънна колба от 100 сm³ (ml) (5.1) се претеглят 0,500 g от пробата с точност 0,001 g. Прибавят се 30 сm³ (ml) бензен (4.2) и 20 сm³ (ml) солна киселина (4.7). Съдържанието на колбата се кипи 30 min на обратен хладник при разбъркване.

6.2.2.2. Съдържанието на колбата се прехвърля в делителна фуния от 100 сm³ (ml) (5.5). Промива се с 5 сm³ (ml) 1 N солна киселина (4.7). Водната фаза се прехвърля в облодънната колба (5.1), а бензеновия слой се промива с 5 сm³ (ml) солна киселина (4.7).

6.2.2.3. В случай, че се получи емулсия, която затруднява по-нататъшната обработка, 0,500 g от пробата се смесва с 2 g целит 545 (4.14) за получаване на свободно сипещ се прах. Сместа се прехвърля на малки порции в стъклена хроматографска колона (5.12).

След всяко прибавяне, пълнежът на колоната се набива. След като цялата смес се прехвърли в колоната, тя се елуира със солна киселина (4.13), така че 10 сm³ (ml) елуат да се получат за около 10 min. (ако е необходимо, елуирането може да се проведе под слабо налягане от азот). По-време на елуирането трябва да е сигурно, че над пълнежа на колоната винаги има известно количество солна киселина. Първите 10 сm³ (ml) от елуата се обработват по-нататък, както е описано в т. 6.2.2.4.

6.2.2.4. Събраните водни фази (6.2.2.2) или елуатът (6.2.2.3) се изпаряват почти до сухо на ротационен вакуум изпарител.

6.2.2.5. Остатъкът се разтваря в 6 сm³ (ml) разтвор на натриев хидроксид (4.9). Прибавят се 20 сm³ (ml) Fehling разтвор (4.16) и съдържанието се прехвърля от колбата в делителна фуния от 50 сm³ (ml) (5.5). Колбата се промива с 8 сm³ (ml) хлороформ (4.3). Разклаща се и хлороформеният слой се филтрува в мерителна колба от 50 сm³ (ml) (5.2).

6.2.2.6. Екстракцията се повтаря три пъти с по 8 сm³ (ml) хлороформ (4.3). Хлороформените фази се филтруват и се събират в мерителната колба от 50 сm³ (ml). Допълва се до марката с хлороформ (4.3) и се разклаща. Измерва се оптическата плътност на оцветения в жълт цвят разтвор при 410 nm спрямо хлороформ (4.3).

В четири облодънни колби от 100 сm³ (ml) (5.1), всяка от които съдържа 3 сm³ (ml) 30% разтвор на етанол (4.20), се поставят с пипета 5, 10, 15 и 20 сm³ (ml) порции от стандартния разтвор (4.15.1), съответстващи на 5, 10, 15 и 20 mg хинолин-8-ол. Процедира се както е описано в 6.2.1.

8.1. Течни проби

Съдържание на хинолин-8-ол %(М/М) =

където:

Съдържание на хинолин-8-ол % (М/М) =

където:

a е хинолин-8-ол в mg, отчетено от стандартната крива (7);

М е масата на изпитваната проба (6.2.2.1) в mg.

9. Повторяемост(¹)

За съдържание на хинолин-8-ол от около 0,3%, разликата между резултатите от две успоредни изпитвания, проведени с една и съща проба, не трябва да надхвърля по абсолютна стойност 0,02%.

(¹) виж ISO 5725

ХVІ. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА АМОНЯК

1. Област на приложение

Определяне на свободен амоняк в козметични продукти.

Съдържанието на амоняк в анализираната проба, определено по този метод е изразено в % (M/M).

Към разредената във водно-метанолова среда анализирана проба, се добавя разтвор на бариев хлорид. Утайката, която може да се образува, се филтрува или центрофугира. Така по време на парната дестилация се избягва загубата на амоняк от някои амониеви соли като карбонат и бикарбонат (хидроген карбонат) и тези на мастните киселини, с изключение на амониев ацетат. Амонякът се отделя от филтрата с парна дестилация. Определя се потенциометрично или чрез друго титруване.

4.1. Метанол

4.2. Бариев хпорид дихидрат, 25% (M/V)

4.3. Ортоборна киселина, 4% (M/V)

4.4. Сярна киселина, 0,25 М

4.5. Анти-разпенваща течност

4.6. Натриева основа, 0,5 М

4.7. Индикатор при обратно титруване: смесват се 5 сm³ (ml) 0,1 % (M/V) разтвор на метилрот в етанол с 2 сm³ (ml) 0,1 % (M/V) воден разтвор на метиленово синьо

5.1. Стандартно лабораторно оборудване

5.2. Центрофуга с добре затварящи се епруветки от 100 сm³ (ml)

5.3. Дестилационен апарат

5.4. Потенциометър

5.5. Измерващ стъклен електрод и сравнителен каломелов електрод.

6.1. В мерителна колба от 100 сm³ (ml) се претегля с точност 0,001 g проба (М), съответстваща на 150 mg максимално количество амоняк.

6.2. Прибавят се 10 сm³ (ml) вода, 10 сm³ (ml) метанол (4.1) и 10 сm³ (ml) разтвор на бариев хлорид (4.2). Долива се до 100 сm³ (ml) с метанол (4.1).

6.3. Разбърква се и се оставя за една нощ в хладилник (5⁰C).

6.4. Все още студеният разтвор се филтрува или се центрофугира за 10 min. в епруветки (5.2), за да се получи бистър филтрат.

6.5. В парния дестилатор (5.3) последователно се отпепетирват 40 сm³ (ml) от този разтвор и 0,5 сm³ (ml) анти-разпенваща течност (4.5).

6.6. Дестилирането продължава, докато се събере приблизително 200 сm³ (ml) дестилат в бехерова чаша от 250 сm³ (ml), съдържаща 10 сm³ (ml) стандартна сярна киселина (4.4) и 0,1 сm³ (ml) индикатор (4.7).

6.7. Излишъкът от киселина се титрува със стандартен разтвор на натриева основа (4.6).

6.8. Забележка: При потенциометричното определяне дестилирането се извършва като за приемник на дестилата се използва бехерова чаша от 250 сm³ (ml), съдържаща 25 сm³ (ml) ортоборна киселина (4.3). Дестилирането продължава докато се събере 200 сm³ (ml) дестилат. Титрува се с разтвора на сярна киселина (4.4), като се записва кривата на неутрализация (кривата на титруване).

7.Изчисления

7.1. Изчисления в случай на обратно титруване (остатъчно титруване)

където:

7.2. Изчисления в случай на директно потенциометрично титруване

където: