Рнк интерферeнция

Биологически факултет

Катедра Биохимия

2011г.

Изготвил:

Лидия Димова, фн 9813, Iгр. МБ
Курсов ръководител:

доц. Мариела Оджакова

Съдържание
Увод
Какво е RNAi

Исторически бележки

siRNAs,

Участници - характеристики и механизъм на действие

Dicer

Drosha

RISC

РНК интерференция при бозайници

Приложения

РНК интерференция и HIV

РНК интерференция и вирусен хепатит

РНК интерференция и рак

РНК интерференция и генетични заболявания

Откриване на гени и идентификация на функцията им

РНК интерференцията е механизъм в молекулярната биология, изразяващ се в това, че при присъствие на определени фрагменти от двойноверижна РНК се прекъсва експресията на определен ген, чиято секвенция е хомоложна с тази на двойноверижната РНК.

Преди РНК интерференцията да бъде добре изучена, е била позната още като пост транскрипционно генно заглушаване или трансгенно заглушаване. Едва след като тези феномени са били описани на молекулярно ниво, станало ясно, че те представляват едно и също явление.

Използването на РНК, за да се намали експресията на определени гени при растенията, е процедура, която се прилага от много години. Едноверижни антисенс РНК са били вкарвани в растителните клетки с цел хибридизацията им към едноверижни сенс матрични РНК. Докато тогава учените вярвали, че двойноверижната резултантна структура не може да бъде транслирана в белтък, сега е ясно тази двойноверижна РНК предизвиква РНК интерференция. Употребата на двойноверижни РНК се разширява след разкриването на механизмите на РНК интерференцията, и се прилага първо при петуниите, а после и при кръглите червеи.

РНК интерференцията се оказва високоефективен и специфичен процес, който в клетката се извършва от сложен организационен апарат. Въпреки че не всички негови компоненти са известни, е ясно че веднъж след като апарата попадне на двойноверижна РНК молекула, той я нарязва чрез ензим известен като Dicer, разделя двете вериги и тогава продължава да разгражда други двойноверижни РНК които са комплементарни на един от тези сегменти. Двойноверижните РНК диктуват създаването на малки интерфериращи РНК (siRNAs), които се включват в РНК разграждащи ензимни комплекси и стимулират разграждането на комплементарните на тях транскрипти.

Жизненият цикъл на много вируси включва двойноверижна РНК-етап, така че е възможно РНК интерференцията да се е развила като защита срещу тези вируси. Същият апарат е използван от клетката за регулиране на генната активност: определени части от генома са транскрибирани в микро РНК (miRNAs), къси РНК молекули, които се нагъват около самите себе си, образувайки двойноверижна фуркетоподобна структура. Когато РНК интерферентната машинария засече тези двойноверижни фрагменти, тя разрушава всички матрични РНК, комплементрани на тях, предотвратявайки тяхната транслация и понижавайки активността на много други гени. Този механизъм първо е бил показан при Arabidopsis като чрез него се осъществява регулацията на няколко гени, контролиращи формата на растението. Досега около 330 микроРНКи са били открити и при човека.

РНК интерференцията е свързвана и с различни други клетъчни процеси, включително образуването на центромерите и генната регулация чрез микроРНКи и формирането на хетерохроматин.
Исторически бележки
Революционното откритие на РНК интерференцията е неочакван резултат от експерименти, извършвани с растения от американски и холандски учени (Napoli et al., 1990). Тяхната цел била да създадат петунии с подсилен цвят на венчелистчетата. За да постигнат това те предствили в растенията допълнителни копия на гена, кодиращ ключов ензим за пигментацията на венчелистчетата. Изненадващо, много от петуниите, носещи допълнителните копия на въпросния ген не показали очаквания тъмночервен цвят, а носели напълно или частино бели цветове. При задълбочено разглеждане учените открили, че и двата вида гени, ендогенните и изкуствено внесените трансгени, са били изключени. Поради това наблюдение явлението първоначално е наречено „ко-супресия”, но молекулярните механизми, по които то се осъществявало оставали неизвестни.

Няколко години по-късно растителни вирусолози извършили подобни наблюдения. В техните изследвания те целели подобряване резистентността на растения спрямо определен вирус. По това време се знаело, че растения, експресиращи белтъци, специфични за вируса, показват по-силна толерантност и дори резистентност към вирусната инфенция. Те също установили, че растения, носещи единствено къси фрагменти от вирусната РНК, които не кодират белтъци, показват същата резистентност. Тяхното заключение било, че вирусната РНК, синтезирана от трансгените може също да атакува навлизащите вируси и да възпрепятства тяхното възпроизводство. Те направили обратния експеримент, поставяйки къси фрагменти от гени с растителен произход в генома на растителни вируси. Резултатът бил, че след инфекция на растения с тези модифицирани вируси експресията на прицелните растителни гени била подтисната. Това явление било наречено „вирусно индуцирано генно заглушаване”, (virus-induced gene silencing, VIGS).

След тези начални наблюдения в много лаборатории започнали изследвания на различни моделни организми.

Определението на РНК интерференцията като реакция към двойноверижна РНК идва от експерименти с двойноверижна РНК (dsRNA) проведени при неметода Caenorhabditis elegans. Инжектирането на двойноверижна РНК се окзало, че води до заглушване на гените, чиито поседователности били комплементарни на тези на внесената РНК. Сега е ясно, че РНК интерференцията се среща при много, дори при повечето еукариоти. Двойноверижните РНКи се обработват до къси интерфериращи РНКи (small interfering RNAs, siRNAs), с дължина около 22 нуклеотида, от РНКазния ензим Dicer. Тези къси интерфериращи РНКи после биват включени в заглушителен комплекс, наречен RISC (RNA-induced silencing complex), който идентифицира и заглушава комплементарните информационни РНК.

Малките РНК молекули попадат в две категории, miRNAs и siRNAs, разграничими помежду си по различната си биогенеза, не и по своето действие. miRNAs произлизат от дълги едноверижни РНК (ssRNA), които имат способноста да се навиват около себе си и да образуват несъвършенни двойноверижни РНК (dsRNA), които се процесират последователно от RNaseIII eнзимите Drosha и Dicer. Обратно, популациите от siRNAs са процесирани само от ензими, членове на семейството на Dicer, като изходните молекули които се обработват са перфектни двойноверижни РНК, получени след транскрипцията на обърнати повтори, конвергентна транскрипция на сенс-антисенс генни двойки, или са синтезирани от РНК зависима РНК полимераза (RNA dependent RNA polymerases, RDRs).

miRNAs винаги действат „транс”, което означава, че не могат да регулират гените, от които произлизат, тъй като те са идентични с тях, а не са комплементарни с техните прекурсорни РНКи. От друга страна siRNAs могат потенциално да действат както „цис” така и „транс”, прицелвайки се в елементите, от които те произлизат, също така както в неродствени елементи, показващи значителна комплементарност с тяхната послдователност, подобно на „транс” действието на miRNAs. miRNAs преди всичко подтискат генната експресия на пост транскрипционно ниво, докато siRNAs могат да показват активност, както по време на транскрипционна, така и при пост транскрипционна репресия.
siRNAs – биогенеза и действие
siRNAs нямат единствено екзогенен произход. Поне три вида ендогенни siRNAs съществуват при растенията.

Транс-действащите siRNAs (ta-siRNAs) произлизат от дълги некодиращи едноверижни РНКи (ssRNAs), които са разрязвани от miRNAs и като резултат се получават скъсени РНКи, които се трансформират в двуверижни РНК (dsRNAs) от клетъчния ензим РНК зависима РНК полимераза, и са процесирани до фрагменти с дължина 21нуклеотидни двойки от подобен на Dicer ензим. ta-siRNAs, произлизащи от положителни и отрицателни вериги действат „транс”, направлявайки нарязването на ендогенна матрична РНК, подобно на miRNAs. Ta-siRNAs, произлизащи от отрицателните вериги могат също да действат и „цис”, направлявайки нарязването на техните прекурсорни РНК; по този начин те участват в регулацията на своя метаболитен път чрез обратна връзка.

Вторият тип siRNAs, nat-siRNAs, произлизат от естествени антисенс РНКи. Област от dsRNA, получена при транскрипцията на припокриващи се гени, се разпознава и процесира от дайсероподобен ензими до един вид siRNA, 24 нуклеотидни двойки дълъг. В последствие той се процесира до 21нд. Досега nat-siRNAs са показвали единствено „цис”- действието си, направлявайки разрязването на една от двете матрични РНКи в „цис”- антисенс двойката.

Третия тип ендогенни siRNAs са свързани с хетерохроматина и ДНК повтори, като транспозоните. Продукцията на тези siRNAs направлява ремоделиране на хроматина и в някои случаи метилиране на ДНК в локусите, от които те произлизат.

И при растения и при животни, miRNAs произлизат от дълги едноверижни (ssRNAs), които се нагъват и образуват несъвършенни фуркетни двойноверижни РНКи (dsRNAs). При животните първичните прекурсори на miRNAs (pri-miRNAs) в ядрото се изрязват първо в основата на стъблото на бримката от Drosha, която е подпомагана dsRNA – свързващият ензим Pasha. При това се образува прекурсорни РНКи (pre-miRNAs), които са изнасяни в цитоплазмата от експортин-5. На този етап, Dicer, подпомаган от друг dsRNA – свързващ белтък – Log, отрязва бримките на pre-miRNAs и освобождава зрелите дуплекси на miRNAs, които се зареждат около белтък от семейството на Argonaute. Дуплексите се разделят, позволявайки на целият комплекс да взаимодейства с частично комплементарните матрични РНКи. В някои случай животинските miRNAs направляват транслационна репресия.

При животни miRNAs се счита, че контролират директно експресията на повече от 1/3 от гените и по този начин оказват влияние върху целия геном. При растения броя на известните miRNAs е по-малък, отколкото при животни, но спектъра на тяхното действие е изключително широк, включващ регулация на развитието, на адаптивните отговори към стрес и други.

Участници – характеристики и механизъм на действие
Двойноверижната РНК (dsRNA), която стартира процеса може да бъде предоствена отвън или да призлиза от генома под формата на микроРНК (miRNA). Генното заглушаване може да бъде резултат от разграждане на информационна РНК (mRNA) или в следствие на подтисната транслация. Централна роля по пътя на RNAi заемат две рибонуклезни машини. Рибонуклезата ІІІ, наречене Dicer инициира RNAi генерирайки активни малки интерфериращи форми на РНК. Заглушаването се осъществява от комплексът RISC (RNA-induced silencing complex) и ензимът RnaseH, наречен Argonaute, който се намира във сърцевината на комплекса.

RNAi като рибонуклеазен двигател

Fire и Mello откриват, че dsRNA може да индуцира генно заглушаване при нематода Caenorhabditis elegans. Преди това са правени изследвания при растения и гъби, които разкрили пътища за генно заглушаване, отключвани от трансгенна експресия или репликацията на вирусен геном. Малките интерфериращи РНК (siRNAs) първо са били засечени в растителни системи и тяхната връзка с RNAi при животните осигурява аналогията в пътищата на генно заглушаване между отделните царства. Първата miRNA, която е открита е тази, която блокира експерсията на mRNA на гена lin-4 при C.elegans, вземащ участие в регулацията на развитието на червея.

Опростеният модел на пътя на RNAi се базира на две стъпки, всяка включваща рибонуклезна машина. При първата стъпка стартовата РНК (или dsRNA или предшественик на microRNA) се процесира до превръщането й в siRNA от RNaseIII енсимите Dicer и Drosha. Така наречените dsRDB белтъци (dsRNA binding domain proteins), Pasha, Loquacious и R2D2 са кофактори при процесинга. При втората стъпка siRNAs се зареждат в ефекторния комплекс RISC, като същевременно с асемблирането си те се преминават в едноверижни. Различията между двете вериги продопределят коя от тях ще се включи в комплекса. Едноверижнaта siRNA локализира прицелната mRNA на базата на комплементаността й. Генното заглушаване е резултат от разгражданенто на mRNA oт RnaseH ензимът Аrgonaute, наречен още Slicer. Ако дуплексът siRNA/mRNA съдържа несъответствия в мястото на рязане, както е случаят при miRNAs, тогава mRNA не се разгражда и генното заглушаване е резултат от блокране на транслацията.

Инициираща машинария

Целта на инициаторната стъпка при RNAi е гененрирането на siRNAs oт дълги dsRNAs или продукция на зрели miRNAs от техните първични транскрипти. Това се постига под действието на две семейства от RNaseIII ензимите – Dicer и Drosha.

Откриването на siRNA започва с изследване на ко-супресията. Това е близък до RNAi път за генно заглушаване, чиито пускови механизми включват транскрипти, получени от трансгенни повтори или вируси. Трансгенът или вирусът бива подтиснат и хомоложните гени също биват подтиснати, откъдето идва и термина ко-супресия.

Dicer

Ензимите от групата на RNaseIII попадат в три класа. Клас І ензимите, срещащи се при бактерии и дрожди, съдържат един домен с RNaseIII активност, свързан с един dsRDB. Ензимите от клас ІІ и клас ІІІ се характеризират още с хеликазен домен и с PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille) домен. Последният домен присъства и в белтъците от семейството на Аrgonaute, за които вече се знае, че са изключително важни за RNAi. Това води до предположението, че ензимите от клас ІІІ са инициатори за RNAi.

Генерирането на siRNA от dsRNA изисква протичането на 4 ендонуклеолитни реакции. Как Dicer постига това? Ранните модели са базирани на предположението, че Dicer формира димер върху субстрата и извършва четири реакции на разрязване. Сегашната информация обаче предполага модел, при който Dicer действа като мономер, използвайки две нуклеолитни реакции, при което създава един нов край на веригата. Това е възможно при положение, че Dicer е свързан към съществуващ вече край и прави развязвания на разстояние 21 нуклеотидни двойки от края. Това предположение идва от опити с dsRNA субстрати с блокирани крайща. Ако ензимът не може да инициира процесинга откъм края то тогава бива принуден да прави разрези във вътрешността на молекулата, в следствие на което реакцията значително се забавя. Изводите са, че свързването на Dicer по средата на молекулата е по-малко ефективно и причинява забавянето. При свързването му се създава нов край и процесинга от тук нататук протича с нормална скорост.

От кристалографски данни е изграден структурен модел на ензимите от клас І, който е с два активни центъра за всеки мономер, които допринасят за формирането на сложен активен център. Така димерът може да се свързва вътрешно с dsRNA субстрат и да генерира два нови края.

Ензимите от това семейство освен, че участват процесирането на dsRNA до siRNA, но и играят роля при зреенето на miRNAs. Toва е още една точка, която изяснява връзката между microRNAs и siRNAs – и двата вида са нетранслиращи се РНК с приблизително еднакви размери, които редуцират експресията на гени с комплементарна последователност.

Скоро след откриването на Dicer се разбрало и че този ензим участва в оформянето на miRNAs. Това осигурило обяснение за ендогенната роля на RNAi хърляйки светлина върху появата на фенотипове при мухи и растения, резултат от мутации в RNAi машинарията.

Връзката между пътищата на siRNAs с тези на miRNAs придава вълнуваща роля на RNAi при регулацията на генната активност. microRNAs се транслират от RNA pol II като дълги първични транскрипти. Активните miRNAs, наричани още зрели, съществуват в първичните транскрипти като структура със стъбло-бримка, която може да бъде локализирана, както в екзон, така и в интрон. След транскрипцията miRNAs са изрязани и изнесени от ядрото. Последователният процесинг на първичният транскрипт от RNaseIII ензимите Drosha и Dicer освобождава зрелите РНК. Разрязването от Drosha освобождава стуктурата стъбло-бримка, която след това се нарича прекурсор. Той напуска ядрото с помощта на Exportin-5. в цитоплазмата прекурсорът се среща с Dicera, koйто го нарязва до структури подобни на siRNA. При действието си Drosha генерира в прекурсора 3’опашки с дължина 2 нуклеотидни двойки, който се разпознават от PAZ домена на Dicer. Двойноверижната miRNA се влкючва в RISC комплекс подобно на siRNAs.

Фиг.1: Етапи на РНК интерферентния процес в клетката

Съществуват доказателства, че експресията на microRNAs се регулира на ниво транскрипция. Регулация от страна на концентрационните нива на Dicer и Drosha досега не е била забелязана.

Drosha досега не е била открита при растения и се предполага, че нейните функции се изпълняват от Dicer.

dsRBD кофактори

Това са допълнителни белъци, спомагащи на процесиращите ензими Dicer и Drosha да разпознаят своите субстрати. При Drosophila Dicer-1 и Dicer-2, асоциират съответно с факторите Loquacious и R2D2, а Drosha се свързва с Pasha.

Ролята на R2D2 е свързана с направляването на инкорпорирането на правилната верига на siRNA в RISC комплекса. Предполага се, че Loquacious изпълнява подобна роля при зареждането на miRNA в RISC. Функцията на Pasha е по-малко изяснена и едно от предположенията е, че тя регулира експресията на miRNAs на ниво процесинг от Drosha.

RISC

В края на пътя на RNAi се извършва нуклеолитно разграждане на прицелната информационна РНК. Това се извършва от сложният белтъчен комплекс RISC. В центъра на този комплекс стои белтък от групата на Argonaute, притежаващ нуклеазна активност, на която се дължи нярязването на mRNA. RISC може да действа и по друг начин, подтискайки транслацията без да нярязва mRNA. Това е по-характерно за RNAi осъществена с посредничеството на miRNAs.

Размерите на RISC може да варират от 500 до 360 или 140кD, в зависимост от моделната система и наличието или отсъствието на някои несъществени кофактори за асемблирането.

Първият идентифициран компонент на RISC комплекса при Drosophila е Argonaute2 (Ago2). Toва е член на силно консервативно семейство белтъци, което се среща при повечето еукариоти и някои прокариоти. Аналог на Ago2 при C.elegans e rde-1. Структурно това белтъчно семейство се характеризира с два домена – PAZ и PIWI. Съществуват и други копоненти на RISC комплекса с още наизяснени функции. Част от тях включват РНК свързващият белтък VIG, хеликази, Tudor-SN (стафилококна нуклеаза) и други.

Дълго време съществували противоречия относно това на кой компонент се дължи слайсерната активност. Отначало тази функция била приписвана на Tudor-SN, но скоро се разбрало, че като екзонуклеаза, продуктите от нейната дейност са 5’ОН и 3’ фосфатна група, докато при реакцията катализирана от Slicer се получават 5’ фосфат и 3’ хидроксилен край. В момента няколко линии на експерименти посочват Аrgonaute като най-вероятен изпълнител на длъжността Slicer.

П
ри човека се срещат четири члена на Аgo семейството, кръстени Аgo1-4. Всичките четири типа свързват siRNA както и miRNA с приблизително еднаква ефективност и имат високи експресионни нива, но само Аgo2 e бил открит като компонент на RISC koмплекса. Кристалографските данни показват, че в PIWI домена на Ago2 се намира една гънка с RnaseH aктивност. Това е ендонуклеаза, която типично разрязва РНК веригата от ДНК/РНК дуплекс. Когато дълъг РНК субстрат е свързан с къс ДНК олигонуклеотид, ензимът срязва РНК през средата. Същaта операция се извършва и от Slicer, макар че в случая siRNA играе ролята на ДНК олигонуклеотида.

Фиг.2: Модел на слайсерната катализа. siRNA е свързана в своя 5’край към PIWI домена,а в 3’края към PAZ домена.5’фосфата се координира пространствено от силно консрвативен райнон на PIWI. Матричната РНК първоначално се срързва в 5’края на siRNA и последствие се образуват водородни връзки по дължината на комплементарния участък към 3’края. След това RnaseH доменът извършва разрязването, чрез катион-зависима катализа и освобождава продуктите.
Този модел обяснява и свързването на microRNA RISC с прицелната mRNA. Най-силният модел за действието на miRNAs бива предложен наскоро и представя доказателства, че miRNAs блокира кеп-зависимата инциация на транслацията. Прицелните mRNAs за miRNAs са локализирани в цитоплазмени образувания, заемащи отношение към процесинга, т.нар. Р-телца.

Интересен факт е, че при хората се среща само един ген кодиращ Dicer, който има голяма степен на сходство с Dicer-1 гена при Drosophila. По подобен начин човешките белтъци Ago1-4 са близки до Ago1 при Drosophila, но в човешкия геном липсва ортолог на Аgo2 (Drosophila). Това предполага, че в еволюционно отношение човешкият геном преференциално е запазвал miRNA подпътя на интереференцията. Тъй като dsRNAs са токсични за клетките на бозайниците, пътя за процесинг на този вид стартови молекули е излишен. Единствения белтък със запазена слайсерна функция при човека е Ago2.

Ako в клетката директно се внесат siRNA тогава не би имало нужда от функциите на Dicer. Но въпреки това не-участието му намалява ефективността на интерференцията. Има още доказателства, че изкуствено синтезирани РНК с фуркетна форма, които служат като субстрат за Dicer, са по-ефективни като стартови молекули за RNAi. Тези наблюдения сочат за едно важно взаимодействие между Dicer и RISC комплекса. Данните показват, че за да се извърши многостъпалния процес на асемблиране на RISC e необходим Dicer. Той, заедно със своя dsRDB, се свързват към siRNA. Така получената структура се нарича RLC (RISC loading complex). Често това е многостъпален процес, изискващ участието и на други фактори. Ориентацията на R2D2 e асиметрична, благоприятствайки зареждането на водещата верига от siRNA в RISC комплекса. Има доказателства, които подсказват, че асемблирането се извършва върху белтъчен комплекс в цитозола, който може да е свързан с рибозома или да е свободен. Така формирания холоензим е активен и може да обработва прицелните си молекули mRNA.

Пост-транскрипционното генно заглушаване, осъществено от siRNAs и miRNAs постига специфичност благодарение на РНК-РНК комплементарно взаимодействие. Но също така РНК може да формира базови двойки и с ДНК. Нарастващ е броя на доказателствата, че процесът на РНК интерференция повлиява функционирането на гените на ниво геномна ДНК, в което основна роля играят двойноверижните РНК.

Досега в ядрото са открити четири метаболитни пътя, оказващи влияние в нивата на експресия на определени гени, в които посредници са dsRNAs.

Два от тях, РНК-направляваното метилиране на ДНК (RdDM) и формиране на хетерохроматин, са епигенни¹ процеси, чиито резултат са ковалентни модификации на цитозините в ДНК или на самите хистони. РНК-направляваното метилиране на ДНК е било описано най-подробно при растенията, докато образуването на хетерохроматин с помощтта на основните участници в РНК интерференцията е било наблюдавано както при Schizosaccharomyces pombe, така и при животни и растения. Въпреки, че и двата процеса са инициирани от dsRNA не е ясно дали те са два отделни пътя или имат общи етапи помежду.

Третият механизъм – ДНК елиминирането, които се среща при някои ресничести представители на Protozoa, се приема като продължение на РНК-направляваното образуване на хетерохроматин: последователностите във вътрешносттта на гена, които са били заглушени посредством механизмите на РНК интерференцията, и са били пакетирани под формата на хетерохроматин, биват изхвърлени по време на развитието от транскрипционно активния макронуклеус. Този първоначално епигенен процес, следователно, накрая резултира в реконструкция на генома.

И накрая, заглушаването на несдвоената ДНК, което се случва с някои ораганизми по време на мейоза, също се дължи на белтъците изграждащи РНК интерферентната машинария. Мейотичното заглушаване започва в ядрото, но за разлика от другите три механизма в основата си е пост-транскрипционен процес, който не включва забележими промени в хроматина на прицелния локус.

За повече от 30 години се е знаело, че представянето на дълги двойноверижни РНКи в клетки от бозайници предизвиква реакция на имунната защита, включително регулирани от интерферон отговори, служещи като антивирусни механизми. Ензимът двойноверижна РНК зависима протеин киназа (PKR) се активира от двойноверижната РНК, локализира я и я свързва, разграждайки я, назависимо от секвенцията й, но освен нея може да свърже и молекули информационна РНК, принадлежащи на клетката, в следствие, на което се подтиска синтеза на белтъци. Съществуването на тези пътища на имунната защита изглеждало несъвместимо с употребата на двойноверижна РНК за заглушаването на определени прицелни гени.

Доказателство за наличието на РНК интерференция при бозайници дошло от наблюдения върху консервативността на ключови биохимични компоненти на метаболитния път. Било показано, че дълги двойноверижни РНКи могат да отключат генно-специфични реакции, когато са представени в ембриони или линии от ембрионални клетки на бозайници, в които неспецифичните антивирусни реакции към dsRNAs не са често срещани.

През 2001г. е открито, че химически синтезирани къси dsRNAs с дължина 21-24 bp, наречени малки интерфериращи РНКи могат да бъдат използвани, за предизвикването на РНК интерференция при бозайници, като се избегне интерферонната реакция. Скоро било направено друго техническо подобрение, което демонстрирало, че ендогенната експресия на siRNAs под формата на къси фуркетоподобни РНКи (short hairpin RNAs, shRNAs), които носят нагънат участък с бримка и стъбло, може да индуцира генно заглушаване в клетки на бозайник. shRNAs съдържа съвършенно двойноверижно стъбло от 19-29 bp, което е идентично по секвенция с таргетната информационна РНК; двете вериги на стъблото са свързани чрез бримка с дължина 6-9 bp, която се отстранява in vivo от Dicer за да се генерират ефективни siRNAs. Въпреки, че тези shRNAs в повечето случаи не предизвикват интерферонна реакция, има данни че това е възможно, което налага допълнителни разработки в дизайна на shRNAs и подобрения в начина на доставянето им в клетката, при което да се избегнат неспецифичните ефекти.

Важното наблюдение, че всеки RISC комплекс съдържа само една от двете вериги на siRNA дуплекса, и че антисенс веригата на една siRNA може да направлява разграждането на сенс матричната РНК, довело до съществени изводи относно дизайна на ефективните siRNAs. 5’ края на веригата, която се инкорпорира в RISC комплекса по-ефективно, е по-слбо свързана с комплементарната си верига и започва с А=U двойки, докато по-неефективно инкорпорираната в RISC верига, има богат на G≡C двойки 5’ край. Това води до хипотезата, че RISC преферентно включва в състава си тази верига от siRNA дуплекса, която има по-нестабилен 5’край. При изследване на термодинамичните профили на голям брой miRNAs прекурсори, било открито наличието на нестабилен 5’антисенс край. Подобни темодинамични характеристики са наблюдавани само при напълно функционалните siRNAs. Така, че ефективни siRNA дуплекси могат да бъдат създадени чрез модифициране на сенс веригата на siRNA дуплекса, по такъв начин, че антисенс веригата преферентно да навлезе по пътя на РНК интерференцията.

В друго изследване, Rana посочва други две важни изисквания за ефективното функциониранне на siRNAs: фосфорилиране на 5’края на антисенс вригата и образуване на А-спирална структура при формиране на дуплекса антисенс РНК-матрична РНК.

Изследва се също така до каква степен вторичната структура на матричната РНК оказва влияние върху функционирането на siRNAs. Изграден е алгоритъм, по които е възможно точно да се предскаже вторичнтата структура и доколко тя ще пречи да се осъществи комплементарното разпознаване между антисенс siRNA и таргетната РНК.

Ефикасното доставяне на siRNAs в клетките на бозайници е съществена стъпка при повечето технологии за генно заглушаване, базирани на РНК интерференцията. Синтетичните siRNAs могат да бъдат доставени в клетъчна култура чрез електропориране или чрез използването на хидрофобни агенти. Но тези подходи са ограничени от кратката природа на последвалия отговор или от токсичността на използвания липиден агент. Положени са не малко услилия да се модифицира захарофосфатния скелет на siRNA, така че да се минимизира техния заряд и да се улесни вкраването им в клетката. Използването на плазмиди, съдържащи експресионни касети със siRNAs преодолява повечето от тези ограничения: плазмидите са евтини и осигуряват продължителна експресия на shRNAs. Същствуват обаче клетъчни типове, които е трудно да се трансфектират стабилно по този начин. В този случай се предпочита употребата на lentivirus вектори. Този вирус може ефективно да се интегрира в генома на неделящи се клетки, като стволовите или терминално диференцираните, които са неподатливи на обикновенна ретровирусна инфекция.

РНК интерференцията безспорно е единствения метод, чрез които насочено може да се инхибира експресията на гените при бозайници. Другите подходи, влкючително традиционното изключване на гени чрез хомоложна рекомбинация¹, антисенс вектори² и рибозими, могат успешно да бъдат прилагани в някои случаи, но за разлика от РНК интерференцията тяхното приложение е ограничено. Друго предимство на РНК интерференцията е, че това е естествено съществуващ в клетката метаболитен път и неговата мощност като инструмент за избирателно заглушаване на гени е в пъти по-голяма от останалите подходи.

Неотдавна бе показано, че доставаката на siRNAs в клетки на бозайник може да отключи високоспецифичен РНК интерферентен отговор, изразяващ се в knockdown nа интересуващият ни ген. Това откритие направи възможно РНК интерференцията да бъде използвана като мощен антивируснен инструмент.

При проведени експерименти с временно трансфектирани клетки е установено, че siRNAs, целещи се в HIV-1 секвенции могат да инхибират вирусното възпроизводство и развитие. Но краткотрайното действие на тази методи ги прави неподходящи за терапия на пациенти. Рискът да се развият резистентни HIV-1 мутанти също е сравнително висок, тъй като концентрацията на siRNAs в различните части на тялото силно варира. Още повече доставката и токсичността остават важни за решеване въпроси, при третиране със синтетични siRNAs. Но ако на пациентите се приложи стабилно интегриращ се вирусен вектор (лентивирус), който да експресира постоянни нива от интерфериращи РНКи, HIV-1 репликацията бива константно подтисната. siRNAs могат да бъдат експресирани от транскрипционните еденици на полимераза-ІІІ . Сенс и антисенс веригите могат да бъдат експресирани под два различни промотора и РНК интерференцията да бъде отключена по протежение и на двете вериги. По-ефективно инхибиране е постигнато, когато сенс и антисенс веригите са експресирани като единствен транскрипт, с възможността да се формира дуплексна фуркетоподобна структура. HIV-1 репликацията може ефективно да бъде подтисната с употребата на подобни shRNAs при стабилно трансдуцирани клетъчни линии.

Тъй като РНК интерференцията е силно специфична спрямо секвенцията, единствена точкова мутация може да стане причина за възникване на резистентност към интерференция. Това става когато при терапията се използва един-единствен вид shRNA. В последните разработени методи се прилага употребата на множество високоефективни shRNAs, които се целят в консервативните райони на вирусния геном.

Фиг.4: Жизнен цикъл на HIV-1 и възможности за РНК интерферентна интервенция.

В един от проведените експерименти in vivo siRNAs са използвани за борба с остър хепатит, предизвикан от агностично Fas-специфично антитяло при мишка. Анти-Fas siRNAs са инжектирани хидродиманично в третирани с антитела мишки: 82% от мишките оцеляват след 10 дневно наблюдение, докато всички контролни мишки измират в рамките на 3 дни. Мишките, които вече страдали от авто-имунен хепатит също получили подобрение след прилагане на терапията с siRNAs. Така, че се оказва подходяща уптребата на siRNAs за облекчаване на някои определени заболявания, посредством прицелване в участниците във възпалителната реакция, вместо в инфекциозния агент.

Както и при терапията на HIV и тук доставката на siRNAs или на векторите с shRNAs е основното предизвикателство пред успешното лечение на HCV. Хидродиманичните интравенозни инжекции не са подходящ метод при третиране на хепатит при човека. При мишка генетичния материал може да бъде предстваен в хепатоцитите, посредсрвом катетри или дори локализирани хидродинамични процедури. При по-големи бозайници въпросът с доставката все още е отворен.

РНК интерференция и рак
Много изследвания използват siRNAs като експериментален инструмент за рагадаване на клетъчните метаболитни пътища, водещи до неконтролируемо клетъчно делене и рак. Още повече, предполага се, че РНК интерференцията може да бъде впрегната и за лечение на онкоболни. Първата siRNA, създадена с такава цел, е Genasense, чиято мишена е анти-апоптозния ген BCL2. Резултатите за лечение на метастазна меланома са обещаващи, при комбиниране с трдиционна химиотерапия. До колко ефикасно е използването на РНК интерференцията за борба с метастазните тумори, зависи най-вече от да се открият подходящи клетъчни мишени.

Ефективността на методите, по които се доставят siRNAs до съответните клетки, също е от изключителна важност за успешното лечение на метастазите. Няколко научни групи са разработили модфикации в основния скелет на синтетичните siRNAs, които им осигуряват резистентност към серумните нуклеази и по този начин увеличават полу-живота на циркулиращите в организма siRNAs. Увеличаването на стабилността на siRNAs не е достатъчно, ако те не нававлязат в клетките и тъканите с терапевтично функционална концентрация. Тъй като siRNAs са двойноверижни молекули, за тях е по трудно да бъдат поети от клетките, отколкото за едноверижните антисенс агенти, които се свързват към серумни белтъци и лесно се усвояват от клетките in vivo. От части този проблем може да бъде избегнат чрез окомплектоването на siRNAs в липозомни капсули.

Обещаващо начало за използването на РНК интерференция за лечение на генетични заболявания дават изследвания, показващи как SNPs¹ в мутантни транскрипти могат да послужат като мишени за РНК интерференция. Откриването на siRNA, кoято да е високоспецифична спрямо точно определен SNP е предизвикателство, което е преодоляно чрез системни анализи на siRNAs, в които вариращия нуклеотид е комплементарен на междинната област от siRNA. siRNAs започват да направляват разграждането единствено на мутантните транскрипти, оставяйки транскриптите от див тип интактни, въпреки че те се различават от мутантните само по една база.

Полиглутаминови белтъци, кодирани от транскрипти, съдържащи повтора CAG, са били открити при няколко неврологични заболявания, като синдрома на Huntington. Тези белтъци са особено предизвикателна мишена за РНК интерферентната машина, защото CAG повторите са характерни и за нормалните транскрипти. Установено е, че доставката на siRNAs и на вирусни вектори, експресиращи siRNAs в района на увредената мозъчна тъкан има ефект, когато е комбинирана с прицелване в определен SNP в мутантния транскрипт. Това отваря нови преспективи за клиничната употреба на РНК интерференция и лечението на дегенеративни неврологични заболявания.
Откриване на гени и идентификация на функцията им
Наскоро РНК интерференцията е била приложена като експериментална техника за блокиране на гени в моделни организми, с цел установяване функцията на гените. Подтискането на генната експресия позволява тестване на функцията на белтъка, продукт на този ген, и ролята му в живота на клетката и организма. Докато РНК интерференцията може не напълно да подтисне експресията на гена, тя е наричана още knockdown, за да се различи от knockout, при които процедури кодиращата ДНК секвенция се премахва.
Перспективи
Откриването на РНК интерференцията се оказва едно от превратните събития, случили се в областта на биологията през последното десетилетие. Посредством нея може да се стигне до генно заглушване или дори до отстраняване на секвенции от генома. Използвайки я като инструмент за експериментален анализ се постигат огромни успехи при декодиране функцията на гените. Тя също носи потенциала да се използва при терапията на различни заболявания. В изключително кратъкия период след откиването му при моделни организми, метаболитния път на РНК интерференцията се превръща в мощен инструмент за изследване функцията на гените, чрез създаването на knockdown-фенотипове. Въпреки множеството трудности, които трябва да се преодолеят изглежда, че РНК интерференцията ще открие своето място сред традиционните подходи при лечението на заболявания. Основният въпрос, който стои днес е дали тя ще революционизира терапиите на човешките заболявания, така както направи с основните познания за функционирането на гените.


Използвана литература:
1) Gregory J. Hannon and John J. Rossi: Unlocking the potential of the human genome with RNA interference, 2005

2) Scott M. Hammond: Dicing and slicing. The core machinery of the RNA interference pathway. 2005

3) Allison C Mallory & Hervé Vaucheret. Functions of microRNAs and related small RNAs in plants, 2006

4) Marjori A.Matzke and James A. Birchler. RNAi-mediated pathways in the nucleus, 2006

5) Maen Abdelrahim, Stephen Safe, Cheryl Baker and Ala Abudayyeh. RNAi and cancer: Implications and applications,2006

6) Torgeir Holen. Mechanisms of RNAi: mRNA cleavage fragments may indicate stalled RISC

7) Sumedha D Jayasena. Designer siRNAs to overcome the challenges from the RNAi pathway, 2006

8) Peter I Joyce, Joseph M Gallagher and Patricia E Kuwabara. Manipulating and enhancing the RNAi response, 2005

9) Vivek Mittal. Improving the efficiency of RNA interference in mammals, 2006

10) Hideo Akashi, Sahohime Matsumoto and Kazunari Taira GENE DISCOVERY BY RIBOZYME AND siRNA LIBRARIES, 2004