Семинар по Патогенни микроорганизми и инфекциозна имунология към Института по микробиология "Стефан Ангелов", бан на 13. 06. 2011 и насочен за защита на същото заседание


Характеристика на фагоцитозата при различни експериментални модели



страница4/9
Дата25.10.2018
Размер10.15 Mb.
#98482
ТипСеминар
1   2   3   4   5   6   7   8   9

4. Характеристика на фагоцитозата при различни експериментални модели

4.1. Брой макрофаги и ПМНЛ

Проучванията върху имунния статус на интраперитонеално заразени мишки с Y. enterocolitica 8081 О:8 pYV+ в доза 4,0 х 105 КОЕ, сочaт 2-4 кратно увеличаване броя на пМа до 14-я ден след инфекцията, в сравнение със стойностите при здрави мишки - 4,1±0,6 (х106). Броят на пМа при контролни (здрави) мишки от линията ICR варира от 4,1 до 6,2 (х106) в зависимост от възрастта и теглото на мишките. Броят на ПМНЛ е също повишен, достигайки максимални стойности на 3-и и 14-и ден след инфекцията, при стойности на контролните мишки 3,72±0,4 (х109/л). Промени се наблюдават и в броя на пМа и ПМНЛ при ICR мишки заразени интраперитонеално с Y. pseudotuberculosis IP32984 О:3/pYV+ в доза 2,0 х 103 КОЕ. Установено бе, че инфекцията предизвиква увеличаване броя на макрофагите, особено силно изразено в периода от 7-я до 17-я ден, както и на броя ПМНЛ през първите дни на инфекцията.

Резултатите от лабораторно определяните показатели брой аМа, пМа и ПМНЛ на зайци заразени с Y. enterocolitica O:3 показват, че броят на аМа нараства на 4, 8 и 15-и ден за разлика от пМа, които намаляват на 8, 15 и 28-и ден, след преходно увеличение на 4-я ден след инфекцията. Зайците показват и левкопения, достоверно изразена от 4-я до 28–я ден.

При прасета заразени per os с Y. enterocolitica О:3/pYV+, първоначално настъпва понижаване в броя на аМа и пМа, статистически достоверно изразено на 4-я ден след инфекцията. В по-късните интервали броят на аМа е увеличен до края на изследването, като максимални стойности се достигат на 8-я ден - 450±33 (х 106), респ. 118,2±11 (х 106) за пМа. Доказва се и левкоцитоза максимално изразена от 4-я ден след инфекцията - 14,6±2,1 (х109/л), запазваща се до края на изследването. Броят на пМа при здрави плъхове Wistar е 39,6±1,2 х 106.



4.2. Фагоцитна активност при мишки заразени с Y. enterocolitica

Индуцирана е сублетална инфекция на мишки чрез i.p. инжектиране на Y. enterocolitica О:8/pYV+ в доза 4.105 КОЕ. ПМа показват понижена фагоцитна активност, като ФИ намаляват с напредването на инфекциозния процес, достигайки минимални стойности на 7-и и 14-и ден след инфекцията - 16,9±3,7 и 12,2±2,6 при контролнa стойност 24,3±4,1 (Фиг. 10). ПМНЛ също показват понижена активност, като най-ниска стойност за ФИ се отбелязва на 14-я ден – 24,2±3,6 в сравнение с контролните ПМНЛ – 38,2±5,4 (Фиг. 11).






Фигура 10

Фагоцитна активност (ФЧ и ФИ) in vitro на ПМНЛ от мишки заразени с Y. enterocolitica 8081, О:8/pYV+



Легенда: * - Статистически достоверна разлика в сравнение с контролата (Р<0.05)



Фигура 11

Фагоцитна активност (ФЧ и ФИ) in vitro на пМа от плъхове срещу Y. enterocolitica 8081, серотип О:8






Легенда: * - Статистически достоверна разлика в сравнение с pYV+ щам (Р<0.05)



Същевременно, броят на фагоцитираните бактерии от фагоцитиралите пМа и ПМНЛ (ФЧ), е по-висок достигайки максимални стойности на 1-я ден (2,9±0,4) и на 3-я ден (3,6±0,5) при пМа, респективно ПМНЛ при стойности на контролите 1,3±0,2 и 1,6±0,12.
4.3. Фагоцитна активност на пМа от плъхове

Макрофагите от здрави плъхове фагоцитират в по-слаба степен плазмид-положителните (pYV+) йерсинии, в сравнение с безплазмидните (pYV-) клетки (Фиг. 12). Статистически достоверна разлика се наблюдава при ФИ, като по-високи стойности се наблюдават при pYV- бактерии (35,5±3,4), в сравнение с pYV+ (21,6±2,0).Стойностите за ФЧ не се различават значително при пМа от плъхове срещу Y. enterocolitica pYV+ и pYV-. След 24 часово взаимодействие се доказва по-добра преживяемост на pYV+ йерсинии, в сравнение с pYV-. Най-висока бактерицидна активност на пМа бе наблюдавана след култивиране 4 ч на макрофагите с бактериалните клетки, като не се установява значителна разлика между pYV+ и pYV- бактерии (1,28±0,15, респ. 1,46±0,21 (Фиг. 11).





Фигура 12

Килинг ефект (КИ) на пМа от плъхове срещу Y. enterocolitica,

8081, серотип О:8


Легенда: * - Статистически достоверна разлика в сравнение с pYV+ щам (Р<0.05)





4.4. Фагоцитна активност на аМа и ПМНЛ от лалугери заразени с Y. pseudotuberculosis

Фагоцитната активност на аМа и ПМНЛ от лалугери (Citellus citellus) заразени с Y. pseudotuberculosis серотип О:1 и О:3 бе изследвана in vitro срещу съответния бактериален причинител. АМа и ПМНЛ изолирани от лалугери на 1-я ден след инфекция със серотип О:3, не показват различия по отношение на фагоцитната им активност, в сравнение с аМа и ПМНЛ от контролните животни. На 3-я ден, фагоцитната активност се повишава значително: за аМа стойностите за ФЧ са 1,3±0,2, а за ФИ 2,3±0,1; за ПМНЛ ФЧ е 1,5±0,3, а ФИ - 2,5±0,2. В последващите дни, заразените животни умират, поради което фагоцитната активност не е изследвана.При инфекцията, предизвикана от серотип О:1 фагоцитната активност на аМа и ПМНЛ нараства постепенно, като показва максимални стойности на 15-я ден: за аМа се достигат ФЧ от 1,1±0,2 и ФИ - 2,1±0,1. За ПМНЛ стойностите на ФЧ са 1,1±0,2, а за ФИ - 1,9±0,1.



4.5. Фагоцитна активност на макрофаги от зайци заразени с Y. enterocolitica

Макрофаги от зайци заразени per os с Y. enterocolitica О:3/pYV+ в доза 2,6 x 109 KOE, са изолирани на 1, 4, 8, 15 и 28 ден след заразяването. Както се вижда от Фиг. 13, фагоцитната активност е понижена в началото на инфекцията (1-и и 4-и ден) достигайки 180±25, респективно 150±30 имп/мин, при стойности на контролата 380±45 имп/мин. След 14 дни, фагоцитната активност се повишава приблизително 3 пъти с максимална стойност на 28-я ден - 950±150 имп/мин. Подобна динамика на фагоцитния процес бе наблюдавана и при пМа. Резултатите от вътреклетъчната преживяемост на Y. enterocolitica О:3 pYV+ клетките в аМа и пМа са представени на Фиг. 14. Повишена вътреклетъчна преживяемост се наблюдава на 8-и и 15-и ден при 2 часов контакт на бактериите с аМа, изолирани от инфектирани зайци. Броят на вътреклетъчно разположените йерсинии в пМа е намален статистически достоверно единствено на 1-я ден след инфекцията (КИ 1,84±0,4). През последният интервал (28-и ден) не се наблюдава значителна разлика в КИ при сравнение с контролните аМа (1,24±0,32). Подобна динамика в преживяемостта на йерсиниите се наблюдава и при пМа (Фиг. 14).






Фигура 13

Фагоцитна активност in vitro на аМа и пМа от зайци, заразени per os с



Y. enterocolitica, О:3/pYV+

Легенда: * - статистически достоверна разлика в сравнение с контролата (Р<0,05)






4.6. Фагоцитна активност на макрофаги от прасета заразени с Y. enterocolitica

Резултатите от фагоцитната активност in vitro на аМа и пМа от прасета заразени с Y. enterocolitica О:3 са отразени на Фиг. 15. Бактериите се фагоцитират по-активно от аМа изолирани на 15 и 25-я ден от заразяването на прасетата в сравнение с аМа от контролните прасета, които показват стойности за ФЧ 0,6±0,15 и 1,3±0,09 за ФИ. Подобни промени са наблюдавани и при пМа като ФЧ достига максимална стойност 3,2±0,4 на 15- я ден, а ФИ 4,2±0,8, в сравнение с ФЧ и ФИ при контролните животни - 0,9±0,05, съответно 2,1±0,05.






Фигура 14

Килинг ефект (КИ) на аМа и пМа от заразени зайци срещу Y. enterocolitica,

О:8/pYV+


Легенда: *-статистически достоверна разлика в сравнение с контролата (Р<0,05)
Фигура 15. Фагоцитна активност на макрофаги от прасета заразени per os с Y. enterocolitica О:3



Легенда: * - статистически достоверна разлика в сравнение с контролата (Р<0,05)
5. Патогенеза на експериментални инфекции с Yersinia при различни гостоприемници

5.1. Интраперитонеална инфекция на лалугери с Y. pseudotuberculosis серотипове О:1 и О:3

5.1.1. Телесна температура

Опитните животни заразени със серотип О:3 показват повишена температура с 1оС на 3 и 7-и ден след инфекцията, в сравнение с контролните (здрави) лалугери (38,1±0,2). Температурата на лалугерите, заразени със серотип О:1 е от ремитиращ тип с максимални стойности на 3-и ден и 15 ден (38,8±0,3, респ. 38,7±0,2).


5.1.2. Бактериална обсемененост на вътрешните органи

При лалугерите заразени със серотип О:1, максимални стойности на бактериално обсеменяване се установяват на 7-я ден от началото на инфекцията, достигащи до 2,6±0,1 (x105) KOE/гр. тъкан в черен дроб, 9,3±2,3 (x105) в далака и 4,0±0,6 (x105) бактерии в бял дроб. Броят на бактериите в тези паренхимни органи рязко намалява в последващите интервали на инфекцията – 15 и 30-и ден, достигайки стойности 740±20, 250±30 и 150±40 в бял дроб, черен дроб и далак. През 1-я ден от началото на инфекцията с Y. pseudotuberculosis О:3, в белите дробове се установяват 1,4±0,2 (x104) KOE/гр. тъкан, като броят им нараства на 3-я ден до 1,7±0,4 (x105), а впоследствие се понижава до 2,0±0,5 (x102) през 7-я ден от заразяването. Подобна динамика на бактериалния клирънс се наблюдава и в черния дроб и далака. На 15 и 30-и ден този показател не е изследван поради настъпила смърт на животните.


5.1.3. Хистологични промени

в белите дробове се открива хиперплазия на перибронхиалната лимфна тъкан още на 1-я ден след инфекцията на лалугерите с двата серотипа. В далака, около a. centralis се намират милиарни ареактивни некротични огнища. На 3-я ден, в съседство с хиперплазията на лимфоидната тъкан в белите дробове се установява катарална пневмония, по-добре изразена при лалугерите заразени със серотип О:3 (Фиг. 16). Некробиотични огнища се установяват в черния дроб, далака и МЛВ. На 7-я ден след инфекцията със серотип О:3 бе останал жив само един лалугер. Освен описаните изменения, при него бяха наблюдавани още спленит и лимфаденит. Животните заразени със серотип О:1 показваха подобни промени в белия дроб, далака и МЛВ. На 15-я и 30-я ден съответно не бяха установени промени при животните заразени със серотип О:1. Тънките и дебелите черва на заразените и с двата серотипа животни не показват промени. При умрелите животни, хистологичните промени наподобяват по своята локализация и характеристика на тези при евтаназираните на съответния интервал от време лалугери, но бяха значително по-интензивни.







Фигура 16

Катарална пневмония при лалугер с разрушаване на характерната белодробна структура.

Оцветяване H & E, увеличение 200 x



5.1.4. Смъртност

Висока смъртност бе наблюдавана през първата седмица от заразяването на животните с Y. pseudotuberculosis О:3 (Табл. 8). За разлика от тях, при животните заразени със серотип О:1 смъртността се увеличава постепенно и достига своя пик през третата седмица, когато умират общо 5 лалугера.



Таблица 8. Смъртност при лалугери заразени интраперитонеално с Y. pseudotuberculosis серотип О:1 и О:3

Инфекция

Дни след заразяване

Общ брой

1-7

8-15

16-23

24-30

Y. pseudotuberculosis О:1

3

4

5

0

12

Y. pseudotuberculosis О:3

18

0

0

0

18

Възпроизведената за първи път експериментална интраперитонеална инфекция на европейски лалугери (Citellus citellus) с Y. pseudotuberculosis показа ясно изразени клинични симптоми – влошено общо състояние и треска още на 1-я ден след инфекция със серотип О:3 и висока смъртност през първите 6 дни при серотип О:3 и след 5-я ден при серотип О:1. Наблюдаваните клинични прояви са в корелация с настъпилата септицемия и повишената фагоцитна активност на аМа и ПМНЛ, като фагоцитозата е от незавършен тип - по-слабо вирулентните бактерии се убиват вътреклетъчно, докато вирулентните разрушават фагоцитите и се разпространяват във вътрешните органи. Изследваните от нас паренхимни органи (бял дроб, черен дроб и далак) показват положителни бактериологични находки още на 1-я ден след инфекцията, съпроводени с хиперплазия на перибронхиалната лимфна тъкан и малки ареактивни некротични огнища около a. centralis на далака. Описаните максимални стойности на бактериално обсеменяване на белия дроб, черния дроб и далака при серотип О:3 е съпроводено с добре изразена катарална пневмония и микронекротични огнища в черния дроб, далака и МЛВ.


    1. Рer os инфекция на зайци с Y. enterocolitica 4/О:3, pYV+

5.2.1. Клинични показатели

Резултатите от някои клинични показатели на зайци заразени с Y. enterocolitica O:3 са представени на Табл. 9. Зайците показват хипертермия, като температурата им достига 39,7±0,2оС на 1-я ден. През следващите дни не се наблюдава повишение на температура, както и видими промени в общото им състояние. Достоверно изразена левкопения се установява от 4-я до 28–я ден след инфекцията. Ежедневното измерване на обиколките на глезенните стави показва статистически достоверно увеличение на 15-и и 28-я ден (85±9 и съответно 80±10 мм).


5.2.2. Бактериална обсемененост на вътрешните органи

Чрез изследване на бактериалната контаминация на вътрешните органи, йерсинии са изолирани от белодробната тъкан, тънкото черво



Таблица 9. Динамика на промените в клиничните и лабораторни показатели на зайци заразени с Yersinia enterocolitica O:3, pYV+


Изследвани

параметри

Дни след заразяване

Контро-ла

1

8

15

28

40

Температура (оС)

39,7±0,2*

38,2±0,3

38,6±0,2

39,0±0,2

38,8±0,2

38,6±0,3

Ставна обиколка

59±7

65±10

85±9*

80±10*

68±7

58±6

Титър на аглутинини

n.t.

0

1:128

1:256

1:128

0

Легенда: n.t. – неизследвани; * - статистически достоверна разлика (Р<0,05)
и МЛВ на 1-я ден след директна култура и от мозъка след студено набогатяване. На 4-я ден бактерии колонизират и сърцето, черния дроб и пМа. Максимална дисеминация се наблюдава на 15-я ден, като бактерии бяха открити във всички изследвани органи, с изключение на мозъка. Y. enterocolitica O:3 се изолира и от хемокултурите от 8-я до 28-я ден. На 28 и 40-и ден, броят на бактериите перзистиращи в органите и в макрофагите намалява значително. От синовиалната течност на глезенните стави не бяха изолирани бактерии. В серума на заразените зайци се доказват аглутинини от 15-я до 40-я ден, с максимален титър 1:256 на 28-я ден.
5.2.3. Хистологични промени

В мозъка се установява гноен менингоенцефалит на 28-я ден, както и дифузна лимфолевкоцитна инфилтрация в бялата мозъчна субстанция и менингите от 15, до 40-и ден след инфекцията (Фиг. 17).

На 15-я ден се наблюдава катарална пневмония в белия дроб и лимфаденит в белодробните лимфни възли. Кръвоизливи се откриват в сърдечния мускул още от самото начало на инфекцията, както и в бъбреците на 15 и 28-и ден. Изненадваща находка бе индуцирания артрит, наблюдаван на 15, 28 и 40-и ден след инфекцията (Фиг. 18). Морфологични промени се доказват предимно в глезенните стави, които показват периартикуларен едем, изпълнени със серозен ексудат ставни кухини, уплътняване и помътняване на синовиалните капсули и подуване на околните тъкани. Хистологично се установява разрушаване на капилярите, артериолите и активиране на клетки на РЕС на малките кръвоносни съдове. Наблюдават се хиперемия и периваскуларни изливи, както и инфилтрация от лимфоцити, плазматични клетки и еозинофилни левкоцити в съседство с кръвоносните съдове. Всички тъкани около засегнатите стави са инфилтрирани със серозен ексудат, клетъчни елементи, предимно хистиоцити, лимфоцити, плазматични клетки, левкоцити и единични еозинофили. Сред ламеларната костна тъкан се наблюдава обилна лимфоидно-клетъчна инфилтрация. Срези от глезенните стави са оцветявани по Garvey и сътр. (1986) за наличие на бактерии, но такива не се установяват.




Фигура 17

Мозък от заек заразен с



Y. enterocolitica O:3/pYV+, 15-и ден

след инфекцията – менингит. Оцветяване Н & Е, увеличение х 200








Фигура 18

Хистологичен срез на периартикуларна тъкан - 28-и ден

след инфекцията. Инфилтрация на лимфоцити.

Оцветяване Н & Е, увеличение х 200



Каталог: IMB%20web%20page -> pzrasrb
pzrasrb -> Статии, публикувани в международни списания: Ivanov I., Georgiev V., Georgiev M., Ilieva M., Pavlov A. (2011)
pzrasrb -> Биосинтез на галантамин от растителни in vitro системи на Leucojum
pzrasrb -> Конкурс за доцент по профeсионално направление Биологически науки, специалност 01. 06. 12. Микробиология, обявен от Института по микробиология при бан в дв, бр. 21 от 01. 03. 2013 г
pzrasrb -> Лекция на shoot тип линии Leucojum aestivum
pzrasrb -> Асистент Иван Георгиев Иванов, докторант в Института по микробиология „Стефан Ангелов”
pzrasrb -> Председателя на Научното жури определено със заповед
pzrasrb -> На статиите на д-р Милка Милчева Милева, представени при кандидатстване за хабилитация I. Публикации, свързани с дисертационната
pzrasrb -> Чл кор проф д-р Мила Власковска, дф., дмн., Университетската


Сподели с приятели:
1   2   3   4   5   6   7   8   9




©obuch.info 2024
отнасят до администрацията

    Начална страница