Семинар по Патогенни микроорганизми и инфекциозна имунология към Института по микробиология "Стефан Ангелов", бан на 13. 06. 2011 и насочен за защита на същото заседание

Патогенният потенциал на клетките Y. enterocolitica 4/O:3, pYV+ се свързва с тяхната способност да перзистират в лимфната тъкан на далака, черния дроб, тимуса и МЛВ. Доказано е, че Y. enterocolitica е един от причинителите на реактивния артрит при хора, като най-често срещания артритогенен био/серотип е 4/О:3, който има слаба вирулентност за мишки и за който е доказано, че не предизвиква артрит при плъхове (Hill and Yu, 1987). Тези данни потвърждават нашето становище, че зайците са по-подходящ модел за изучаване на йерсиниозната инфекция в сравнение с мишките и плъховете, поради големия брой сходни признаци с йерсиниозата при хората.

Резултатите от клиничното наблюдение сочат увеличаване на телесната температура на опитните прасета до 40,8 и 40,5^оС на 4, респективно 8-я ден след инфекцията, при стойност на контролните (здрави) прасета 38,5±0,3. Хипертермията се съпровожда от левкоцитоза, статистически достоверно изразена от 4-я до 25-я ден.

В мозъка бе наблюдаван гноен менингоенцефалит с левкоцитна инфилтрация в бялата мозъчна субстанция и струпване на лимфолевкоцитни клетки около кръвоносните съдове (Фиг. 19). Около лимфоретикуларната тъкан на тонзилите се наблюдават милиарни некротични огнища от 8-я ден до края на изследването. В белите дробове се наблюдава катарална пневмония с перибронхиална локализация на левкоцитната клетъчна реакция. Левкоцитни инфилтрати се наблюдават и сред фибрилите на сърцето. Ретикулохистиоцитната система на черния дроб е силно активирана и множество сидероцити се наблюдават около v. centralis. Лимфоидноклетъчна инфилтрация се наблюдава в Пайеровите плаки на тънките черва, съпроводена с хиперплазия (Фиг. 20). В МЛВ се доказва катарален лимфаденит.

	Фигура 19 Мозък от прасе. Менингит и периваскуларна левкоцитна инфилтрация, 15-и ден след инфекция с Y. enterocolitica О:3. Оцветяване H & E, увеличение 125 x

Фигура 20 Тънко черво от прасе, заразено с Y. enterocolitica О:3, 15-и ден след инфекцията. Хиперплазия на Пайерова плака. Оцветяване H & E, увеличение 125 x

През първите дни от инфекцията, електронномикроскопски се установи увреждане на ентероцитите с вакуолизация на цитоплазмата им (Фиг. 21-1). Множество бактериални клетки се наблюдават във фагоцитни вакуоли. Значително са активирани и лимфоидните клетки на Пайеровите плаки. Кръвоносните съдове са хиперемични и показват увредени ендотелни клетки. Тези промени се засилват на 8-я ден след инфекцията, когато се наблюдават и активирани плазматични клетки и голямо количество колагенови нишки. На 15-я ден се установява увреждане на повърхностния епител с разрушени митохондрии и хипертрофия на ендоплазматичния ретикулум и апарата на Голджи. В лумена на тънките черва се наблюдават много еритроцити, моноцити, активирани макрофаги и десквамирани епителни клетки. В цитоплазмата на пМа се наблюдават бактерии, които са включени във вакуоли (Фиг. 21-2). Електронно микроскопското изследване на тонзилите показва наличие на множество бактерии във вакуолите на лимфоидните клетки. В белия дроб се доказва катарална пневмония. Наблюдават се и клъстери от сърфактант и тубуларен миелин. Голям брой бактерии се установяват и сред сърфактанта и в цитоплазмата на пневмоцитите (Фиг. 21-3). АМа са активирани и изпълнени с бактериални клетки, локализирани както в цитоплазмата, така и екстрацелуларно (Фиг. 21-4).

Щамовете изолирани от 104 броя проби от тонзили са представени на Табл. 10. Както се вижда, изолираните щамове Yersinia принадлежат към три вида, като 15 са от вида Y. еnterocolitica серотипове О:3 и О:5, 12 са от вида Y. рseudotuberculosis серотипове О:1, О:2, О:3 и О:5, и 9 Y. kristensenii. Седем щама (4 Y. рseudotuberculosis от серотиповете О:1 и О:3, и 3 щама Y. еnterocolitica от серотип О:3) бяха pYV+, показвайки асоциирани с този плазмид характеристики като морфология на колониите, свързване на кристал виолет и конгород, и автоаглутинация. Макроскопски изменения в контаминираните тонзили не са установени.

Yersinia spp.	Серотип	Изолирани щамове
		брой	%
Yersinia enterocolitica	О:3	9	8,6
	О:5	6	5,8
Yersinia pseudotuberculosis	О:1	2	1,8
	О:2	1	0,9
	О:3	2	1,8
	О:5	7	6,7
Yersinia kristensenii	-	9	8,6

Наличието на антитела в кръвни серуми на свине от различни ферми в района на Шумен и Добрич бе определяно посредством класическия аглутинационен тест. Проведени са и опити за създаване на ELISA тест за доказване на IgG антитела в серуми на свине, който да бъде бърз и евтин с цел ускоряване на лабораторната диагностика на йерсиниозата. Резултатите получени от аглутинационния тест тип Видал и ELISA теста са представени на Табл. 11.

При малките прасенца, антитела специфични за Y. еnterocolitica О:3 се доказват в две от серумните проби (титър 1:80 и 1:160), за Y. еnterocolitica О:9 в една проба (титър 1:80) и за Y. еnterocolitica О:5 в 7 проби. Антитела, специфични за Y. рseudotuberculosis са открити в две проби – една за серотип О:1 (титър 1:160) и една за серотип О:3 (титър 1:80). В 210-те серумни проби от прасетата за угояване положителна аглутинация (титър 1:80 до 1:320) за Y. еnterocolitica О:3 бе наблюдавана при 4 проби, при 3 проби за Y. еnterocolitica О:9 (1:80 и 1:160), и в 8 проби за Y. еnterocolitica О:5 (1:40 до 1:160). Положителен бе тестът и спрямо антигените О:1 и О:3 на Y. рseudotuberculosis (при 3 проби с титър 1:80 до 1:160, респективно при 4 проби с титър 1:80 до 1:320). При 60 от пробите от свинете за разплод, антитела бяха доказани при 5 срещу Y. еnterocolitica О:3 (титър 1:80 до 1:160), в 2 срещу Y. еnterocolitica О:9, в 5 срещу Y. еnterocolitica О:5 и в 2 срещу Y. рseudotuberculosis О:3 в същите титри.

Всички 292 серума, които са отрицателни с аглутинационния тест, бяха отрицателни и при ELISA теста за наличие на антитела от клас IgG. 38 серума с аглутинационен титър ≥ 1:80 са изследвани с ELISA теста; от тях 23 (6,7% от общия брой серуми) са положителни за IgG антитела, а 19 от тях са отрицателни при ELISA теста за наличие на IgG антитела. По-голяма част от ELISA отрицателните серуми са с аглутинационен титър от 1:80 (12 на брой) или 1:160. При сравняване на резултатите от ELISA теста с аглутинационния тест бе установено съвпадение при 23 серума от 38. Несъотвествието при 15 от 38 серума се дължи на фалшиво положителни резултати при аглутинационния тест, където за антигени са използвани цели клетки. Този феномен може да се обясни с факта, че йерсиниите притежават общ О-антиген с клетки от други представители на семейство Enterobacteriaceae. Този чувствителен и специфичен метод е подходящ за анализ на голям брой проби за кратък период от време и предлага възможност за поставяне на диагноза при скоро придобита инфекция на базата на единична серумна проба.

8. 
   IgG антитялов отговор при пациенти с реактивен артрит
   

Известно е, че ентеропатогенните йерсинии синтезират високи количества плазмидно кодирани белтъци в експоненциалната фаза на растеж при 37^оС и в среда дефицитна на калций (Heesemann et al., 1984). На Фиг. 22 са показани SDS-PAGE профилите на изолирани белтъци от Y. enterocolitica О:8. Доказват се 7 белтъка, най-интензивни от които са тези с Мм 26 кDа, 36 кDа, 46 кDа и 51 кDа, както и 3 по-слаби, с Мм 33 кDа, 41 кDа, и 43 кDа. Посредством имуноблот теста е определен и IgG антитяловия отговор срещу Yops при пациенти с реактивен артрит. Оптималната концентрация на антигена бе определена предварително чрез аналитична електрофореза. Резултатите показват, че всичките 6 серума, които са отрицателни по ELISA теста, са отрицателни и при имуноблот теста (Табл. 12).

Пациент №	Имунологичен тест
	ELISA	Имуноблот
1.	1:400	YopD, V-ag, YopM, YopH
2, 4, 13	(-)	(-)
3.	1:100	YopM
5.	1:100	YopM, YopH
6.	1:200	YopD, YopH
7.	1:200	YopH
8.	1:100	YopH
9.	1:200	YopD, V-ag, YopB, YopH
10.	1:100	V-ag, YopH
11.	1:400	YopD, V-ag, YopB, YopH
12, 15.	1:100	YopH
14, 16, 17	(-)	(-)
18.	1:400	YopD, V-ag, YopB, YopM, YopH
19.	1:200	YopD, YopH
20.	1:400	YopD, V-ag, YopH

От всичките 14 IgG положителни серума, при 13 бе доказан YopH (51 кDа), при 7 YopD (36 кDа), при 6 V-антигена (43 кDа), при 4 YopM (46 кDа), и при 3 YopB (43 кDа). YopH, YopM и YopD бяха доказани и в контролния серум (Фиг. 23), получен от пациент с реактивен артрит и положителна бактериологична находка за Y. enterocolitica, О:3.

М

СБ

43 (YopB)

41 (Vag)

36 (YopD)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 K

Два дни след заразяване с див щам (WA314), зайците показват преходно намаляване на апетита без диария. Телесната температура е значително увеличена на 4, 7, и 14-и ден след инфекцията. Зайците заразени със sodA мутантния щам не показват видими клинични признаци на заболяване, както и увеличение на температурата през целия период на изследването.

Протичането на инфекциозния процес бе проследено и чрез отчитане броя на живите бактерии в мозъка и вътрешните органи, представен като КОЕ/гр. тъкан. Установено бе, че йерсиниите причиняват системна инфекция със значително обсеменяване и размножаване на бактериите във всички органи. Дивият щам (WA314) се проявява като по-вирулентен от мутантния щам WA314sodA по-отношение тъканната колонизация. Максимален брой бактерии (КОЕ) от дивия щам се доказват през първата седмица в тонзилите, белия дроб и МЛВ, докато броят им в далака и мозъка достига максимални стойности на 14-я ден и в черния дроб на 30-я ден. Значително намаляване в броя на бактериите във всички органи се наблюдава на 45-я ден. Бактериалното обсеменяване и размножаване на бактериите от мутантния щам следва същата динамика във времето като тази на дивия щам, но в значително по-ниски стойности. Бактериален клирънс при мутантния щам се отчита във всички органи, включително и в тънките черва. Обратно, дивият щам се изолира от черния дроб и мозъка дори и на 60-я ден след инфекцията. Тези резултати ясно показват, че WA314sodA мутантния щам е значително атенуиран.

Посредством автоматичен хематологичен анализатор са определени стойностите на общия брой левкоцити и еритроцити, процентът на лимфоцитите, моноцитите, гранулоцитите и концентрацията на хемоглобина. Тяхната динамика е представена на Фиг. 24. Левкоцитоза с приблизително двукратно увеличение се доказва при зайците заразени с дивия щам на 7-я ден след инфекцията. Умерена левкоцитоза бе установена и след инфекция с WA314sodA мутантния щам. Левкоцитозата бе съпроводена от лимфопения, моноцитоза и гранулоцитоза и при двете инфекции. На 14-я ден броят на левкоцитите е все още висок с тенденция за нормализиране броя на лимфоцитите и гранулоцитите. Левкоцитозата продължава до края на изследването (60-и ден) и при двете инфекции. Промени в броя на еритроцитите, както и в стойностите на хемоглобина не бяха наблюдавани. Инфекцията с дивия щам води до значително намаляване в броя на лимфоцитите и забележимо увеличаване броя на циркулиращите фагоцити (моноцити и гранулоцити), в сравнение с инфекцията, предизвикана от WA314sodA мутантния щам. След две седмици обаче, кръвните параметри се изравняват приблизително и при двете инфекции.

време (дни след инфекцията)

Способността на ПМНЛ, изолирани от кръвта на опитните зайци да убиват фагоцитираните йерсинии се изразява в т.н. килинг индекс. Индекси по-високи от 1,0 (КИ>1,0) показват ефективен килинг, докато индекси под 1,0 (КИ<1,0) са показател за бактериално вътреклетъчно размножаване (извънклетъчно разположените бактерии се елиминират чрез третиране с гентамицин). Ниска бактерицидна активност (КИ 2,14) се установи при ПМНЛ от контролните зайци по отношение на дивия щам. Подобни ниски стойности на КИ (1,74±0,3 до 2,09±0,36) са установени при левкоцити от зайци заразени с дивия щам Y. enterocolitica O:8 (WA314). Обратно, левкоцитите от здрави (контролни) зайци убиват по-ефективно WA314sodA мутантните бактерии (КИ 178,0±29,0). При групата животни заразени със WA314sodA мутантния щам, високи стойности на КИ бяха установени от 14-я до 60-я ден след инфекцията. За оценка на бактерицидния потенциал на левкоцитите от двете групи заразени животни, бяха проведени кръстосани експерименти срещу дивия тип и мутантните бактерии. Мутантния щам се оказа по-слабо чувствителен към бактерицидния ефект на ПМНЛ от животни заразени с дивия щам, през първите две седмици след инфекцията (КИ 14,0±2,3, респ. 29,0±3,1) в сравнение с ПМНЛ от контролни зайци (КИ 178,0±29,0). Изненадващо, дивият щам бе по-ефективно убиван от левкоцитите на животни, заразявани с мутантния WA314sodA щам, също на 7 и 14-я ден (КИ 4,54±0,76, респ. 3,6±0,8) в сравнение с контролните ПМНЛ – КИ 2,14±0,38. Тези резултати показват, че бактерицидната активност на левкоцитите от зайци, заразени с дивия тип йерсинии е значително супресирана, в сравнение с тази на левкоцитите от зайци, заразени с мутантния щам. Доказано бе, че WA314sodA мутантният щам е със значително намалена устойчивост към бактерицидното действие на левкоцитите.

Както се вижда от Таблица 13, серумите от контролни (здрави) зайци показват бектерицидни титри от 1:8 и срещу двата щама Yersinia. Нормалните кръвни серуми от зайци заразени с WA314 показват повишени титри – от 1:16 до 1:64 съответно на 7-я и 30-я ден след инфекцията. Инфекцията предизвикана от мутантния щам WA314sodA бе съпроводена от повишени бактерицидни титри – 1:32 на 7-я ден до 1:256 на 45-я ден след инфекцията. Проведено бе и кръстосано изследване на бактерицидната активност, чрез използване на серуми от заразени зайци срещу реципрочния инфекциозен агент.

С цел определяне включването на специфичния и придобит хуморален имунен отговор срещу оралната инфекция с дивия (WA314) и мутантен (WA314sodA) щам Y. enterocolitica, серуми от зайци бяха изследвани за наличие на анти Yersinia IgG антитела на 14, 30, 45 и 60-и ден след инфекцията. Външно мембранни протеини (Yops) изолирани от дивия щам бяха използвани като антигени в ELISA тестове. След инфекция на зайците с мутантния щам, високи нива на специфични за Yersinia антитела се доказват още на 14-я ден (титър 1:200). На 45 и 60-я ден титрите намаляват до 1:100. Серумен IgG отговор със същия титър бе установен след инфекция с дивия щам на 30 и 45-я ден. Резултатите сочат, че антитяловият отговор е по-силен след инфекция с мутантния щам, в сравнение с дивия щам.

В мозъка, около кръвоносните съдове, се установява периваскуларно струпване на лимфоцити, левкоцити и хистиоцити. Сред бялата мозъчна субстанция се доказват множество лимфолевкоцитни възелчета (Фиг. 25А). И двата вида патоморфологични изменения се откриват при зайци, заразени с дивия щам (WA314) на 14, 30 и 45-и ден след инфекцията. В белите дробове на зайците от същата опитна група се установява катарална пневмония и слаб до умерен катарален лиенит и лимфаденит също до 45-я ден. В чернодробния паренхим на зайците от същата група се наблюдават лимфохистиоцитни възелчета от 14-я до 60-я ден, както и катарален ентерит на 30-я ден след инфекцията. Изненадващо, не бяха открити патоморфологични изменения в тонзилите на опитните животни заразени с дивия щам.

Измененията при зайците, инфектирани с мутантния щам (WA314sodA) показват хиперплазия на лимфната тъкан в тонзилите, белите дробове, МЛВ, далака и пайеровите плаки на тънките черва. През целия период на изследване при тази група животни се наблюдава активиране на перибронхиалната лимфна тъкан. Активиране на лимфната тъкан около a. centralis на далака се установява на 30-я ден след инфекцията. Лимфоидно клетъчна пролиферация се наблюдава и в Пайеровите плаки на 30 и 45-и ден. В някои от пробите от МЛВ и далак се наблюдават плазматични клетки, еозинофили, и гигантски клетки. Патоморфологични промени не бяха установени при зайците, заразени с мутантния щам.

Фигура 25 A. Мозък от заек заразен с див (WA314) щам Y. enterocolitica, O:8. Лимфолевкоцитна инфилтрация сред бялата мозъчна субстанция, 30-и ден след инфекция. B. Мозък от контролен заек. Оцв. H & E, увеличение 200 x

В сравнително проучване върху протичането на перорална инфекция при зайци с патогенния (див) щам WA314 на Y. enterocolitica серотип O:8 и неговия изогенен мутант WA314sodA се установи, че инфекцията с дивия щам е прогресивно развиваща се, с преходна хипертермия и дисеминиране на бактериите във вътрешните органи до 45-я ден и в мозъка до 60-я ден след инфекцията. Обратно, мутантният щам колонизира вътрешните органи в по-слаба степен, показвайки забележимо по-слаба способност да се разпространява в мозъка и вътрешните органи. Получените резултати несъмнено показват, че двата проучвани щама са способни да преминават през чревния лумен до бялата мозъчна субстанция, където се получават възпалителни лимфолевкоцитни инфилтрати. Вероятно бактериите се разпространяват в мозъка достигайки до латералните вентрикули и бялата мозъчна субстанция на хемисферите чрез кръвния поток (бактериемия). В паралелно изследване върху значението на контролираната биосинтеза на О-антигена, използавайки също per os модел на инфекция на зайци, ние установихме по-слаба контаминираност на мозъка със sodA и wzz мутантните щамове на Y. enterocolitica O:8, в сравнение с други ЛПЗ мутантни щамове R2 и wzy.

Наблюдаваната от нас значителна левкоцитоза с моноцитоза, гранулоцитоза и преходна лимфопения след инфекция с WA314sodA мутанта е в корелация с активирания хуморален имунен отговор и допринася за отслабване и ограничаване развитието на инфекциозния процес. Тези процеси обаче не намаляват имуногенните свойства на този мутант, а обратно, наблюдава се значително антигенно стимулиране, съпроводено с увеличен IgG антитялов отговор. Освен това се доказа, че WA314sodA мутанта е забележимо по-чувствителен към бактерицидното действие на левкоцитите, вероятно поради мутацията в sodA гена, за разлика от щамовете с мутации в ЛПЗ. Инфекцията със WA314sodA мутанта води до повишена серумна бактерицидна активност, в сравнение с инфекцията с дивия щам WA314. Този ефект може да се отдаде на специфичните антитела в кръвния серум, тъй като инхибирането на класическия път на комплемента с MgEGTA води до намаляване на бактерицидния титър на серума. Различията, които наблюдавахме в бактерицидните свойства на кръвта, корелират с настъпилите имуноморфологични промени. Наличието на голям брой еозинофилни левкоцити и плазматични клетки сред лимфоретикуларната тъкан на лимфните възли, далака и Пайеровите плаки от зайци заразени с мутантния щам, може да се разглежда като имуноморфологична проява на настъпваща имуногенеза. Тези находки кореспондират добре с нивата на IgG в отговор на експерименталните инфекции с двата причинителя. Подобни имуноморфологични находки са установени след инфекция на зайци с мутанти в ЛПЗ – wzz и wzy на Y. enterocolitica O:8.
9.2. Инфекция на зайци с див и ЛПЗ мутантни щамове на Yersinia enterocolitica

Биосинтезата на О-антигена при Y. enterocolitica серотип О:8 се контролира от гени, разположени в wb-генния клъстер. Изследваните естествен (8081-R2), и генетично конструирани два мутантни щама имат нарушена способност за синтеза на О-антигена в различни етапи от неговия биосинтетичен път, т.е. в биосинтезата на О-антигена (8081-R2), в полимеризацията на О-антигена(wzy) и регулиране дължината на О-антигенната верига (wzz).

Два дни след инфекцията, животните заразени с дивия щам Y. enterocolitica 8081 показваха понижен апетит и отпадналост. Телесната им температура е значително повишена на 1-и и 4-и ден след заразяването per os, в сравнение с контролните, здрави животни. Подобно увеличение на температурата, се наблюдава при групата животни заразени с wzz мутанта (ден 4 и 7-и) и wzy мутанта през 1, 4, 7, и 45-и ден. Зайците заразени с грапавия мутант (R2) не показват клинични признаци на инфекция през целия период на изследване.

Протичането на инфекцията бе проследено и чрез отчитане на бактериалното обсеменяване на мозъка и вътрешните органи чрез директна култура от тъканни проби. Отбелязват се значителни различия в способността на бактериите да колонизират различни тъкани и продължителността на колонизиране на различните изследвани щамове в тях. Резултатите показват, че wzz мутантът е най-чувствително атенуиран. Той колонизира органите на зайците само в продължение на 14 дни, докато wzy и R2 мутантa се изолират в значителен брой и на 30-я ден, както и в някои органи 45 дни след инфекцията. Дивият тип бактерии се изолират от всички тъкани, като в най-висок брой се изолират на 7 и 14-я ден, след което броя на бактериите намалява, като на 60-я ден се откриват много малък брой бактерии. Във фецеса не се намират бактерии и от 4-те щама на 30, 45, и 60-я ден след инфекцията. Следва да се отбележи, че значителен брой бактерии от дивия щам и от мутанта wzy се изолират от мозъчната тъкан дори и в най-късните интервали на експеримента. За разлика от тях, wzz мутантът се доказва само на 7 и 14-и ден след инфекцията във всички органи с изключение на тънките черва.

Динамиката на общия брой левкоцити, и процентът на лимфоцитите, моноцитите и гранулоцитите са представени на Фиг. 26.

При животните, заразени с дивия тип, хистологични промени се наблюдават на 14-я ден, както и в по-късните интервали от инфекцията. Грапавият мутант и wzy мутанта, също предизвикват морфологични промени, но по-слабо изразени в сравнение с тези при дивия тип. Най-слаби патоморфологични изменения са предизвикани от wzz мутанта, засягайки само тънките черва и белия дроб. При инфекциите на зайци с всички изследвани щамове бе установена лимфоиднотъканна хиперплазия в тонзилите, белия дроб, МЛВ, далака и Пайеровите плаки. След инфекция с мутантните щамове, възпалителните промени са ограничени главно в лимфните възли. Инфекцията на зайци с дивия тип йерсинии се съпровожда със значителни системни възпалителни увреждания, включващи гноен менингоенцефалит, катарална пневмония, катарален лимфаденит, ентерит и лимфохистиоцитни възелчета в чернодробния паренхим. Мутантният щам wzy предизвиква лимфохистиоцитни възелчета в чернодробния паренхим, наблюдаван в тъканните проби на 7, 14, 30 и 45-и ден след инфекцията. Наблюдава се и слабо вътремозъчно възпаление, което включва периваскуларно струпване на лимфоцити, левкоцити и хистиоцити около кръвоносните съдове на мозъка. Сред бялата мозъчна субстанция се наблюдават множество лимфо-левкоцитни възелчета. Този мутант предизвиква и лимфоцитно активиране в перибронхиалната лимфна тъкан на 45 и 60-и ден. Известно разрастване на лимфната тъкан и струпване на плазматични клетки се наблюдава в тонзилите на 14 и 30-и ден. В пробите от далак се наблюдава хиперплазия на лимфната тъкан около a. centralis от 14 до 60-и ден след инфекцията. През този интервал се наблюдава и лимфоидноклетъчна пролиферация в Пайеровите плаки. В някои хистосрезове от МЛВ и далака се срещат плазматични клетки, еозинофили и единични гигантски клетки. Подобно на инфекцията с мутантния щам wzy, грапавият мутант предизвиква образуването на лимфохистиоцитни възелчета в чернодробния паренхим на 45-и и 60-я ден. Лимфоцитно активиране в перибронхиалната лимфна тъкан се установява на 7, 14, 30, и 45-и ден, а хиперплазия на лимфната тъкан около a. centralis на далака на 30-и и 45-я ден. Лимфоидноклетъчна инфилтрация се наблюдава в Пайеровите плаки на 30-и и 60-я ден. Wzz мутантът предизвиква лимфоцитно активиране в перибронхиалната лимфна тъкан от 14-и до 45-я ден след инфекцията (Фиг. 27). Освен това, лимфоидноклетъчна инфилтрация се наблюдава в Пайеровите плаки през всичките интервали от изследването.

Фигура 27 Хистологичен срез от бял дроб на заек, заразен с wzz, 30 дни след инфекцията. Перибронхиално струпване на лимфоцити и еозинофилни клетки. Оцветяване H&E, увеличение 320 x

За изясняване ефекта на различни структури на ЛПЗ върху вродените имунни механизми, особено на клетъчните защитни механизми, бе определен бактерицидния ефект на ПМНЛ, изолирани от контролни и заразени зайци през различни интервали от време след орална инфекция. Изненадващо, дивият щам бе високо устойчив на ПМНЛ от контролните животни с КИ от 0,96±0,14, докато мутантните щамове бяха ефективно убивани, с индекси между 15,0±0,12 и 52,0±9,0, като най-чувствителен бе мутанта wzz. Левкоцитите изолирани от заразените животни на 7-я ден след инфекцията показват значително понижена килинг ефективност, особено тези изолирани от зайците, заразени с мутантни щамове. Постепенно, тази активност се възстановява и достига стойностите на ПМНЛ от здравите зайци на 45 и 60-я ден, т.е. когато настъпва и намаляване на броя на бактериите в тъканите.

Бактерицидната активност на кръвни серуми от зайци е проследена в кръстосани изследвания срещу различните тествани щамове. Серумите от незаразени (контролни) зайци показват ниски бактерицидни титри срещу всички изследвани щамове – от 1:4 до 1:8. Нормалните серуми от зайци, заразени с дивия тип показват слабо повишени бактерицидни титри – 1:16 до 1:32 срещу дивия и мутантните щамове, през всички интервали на изследването. Инфекцията с wzz мутанта бе съпроводена с повишени бактерицидни титри – до 1:64 на 30 и 45-и ден. Кръстосаните експерименти с реципрочните инфекциозни агенти показват, че нормалните серуми от зайците заразени с дивия тип и грапавия мутант имат по-слаба бактерицидна активност срещу всички изследвани щамове с най-висок титър 1:32. Обратно, нормалният серум от инфектираните с wzz мутант зайци е по-активен, достигайки титър от 1:128 срещу дивия тип и грапавия мутант. Висок бактерициден титър показват и серумите от зайци заразени с wzy мутанта (до 1:64) срещу дивия тип и мутантните бактерии. Много слаб килинг ефект е отчетен след обработка на серумите с MgEGTA, което показва, че Y. enterocolitica е устойчива на антитяло независимия алтернативен път на комплемента.

В настоящето изследване са сравнени някои параметри на инфекциозния процес, предизвикан от вирулентен щам Y. pseudotuberculosis pIB102 серотип O:3 с този на изогенните мутанти yopK и ypkA. Проследени са клиничните признаци, бактериалната колонизация на мозъка и вътрешните органи, чувствителността към бактерицидното действие на ПМНЛ и кръвния серум, антитяловия отговор, патоморфологичните и имуноморфологични промени след орална инфекция с дивия щам Y. pseudotuberculosis и неговите изогенни мутанти.

Проучванията върху потенциалните патогенни свойства на дивия тип и yopK и ypkA мутантните щамове на Y. pseudotuberculosis са проведени на модел орална инфекция на зайци. Клиничните наблюдения по време на протичането на йерсиниозата показват наличие на хипертермия до 14-я ден след инфекция с дивия тип (39,5-39,7^оС) в сравнение с контролните (здрави) животни (38,6 ± 0,2^оС). Значително увеличена телесна температура бе установена до 7-я ден след инфекция с ypkA мутанта (39,2-39,7^оС) и до 4-я ден след инфекция с yopK мутанта (39,2-39,6^оС). През този период животните бяха депресирани и настръхнали, но със запазен апетит. Не бяха наблюдавани диария и загуба на тегло.

Наличието на инфекция бе проследено чрез отчитане на бактериалната дисеминация в култури от мозъка и вътрешните органи, приготвени асептично при аутопсията. Броят на бактериите, изолирани от описаните тъкани и фецес варира в зависимост от инфекциозния причинител и интервала от време след инфекцията. Културите от всички проби (с изключение на фецеса) са положителни до 14-я ден след инфекция с дивия тип. Интензивността на бактериалната колонизация се увеличава през този период, особено в тонзилите, мозъка, белия дроб, далака и тънките черва, като в последните бактериите перзистират до 30-я ден от изследването. Мозъкът, тонзилите, черният дроб, далака, МЛВ и тънките черва от зайците, заразени с yopK мутанта не бяха колонизирани след 14-я ден, за разлика от инфекцията с ypkA, която протича с бактериална колонизация до 30-я ден. През следващите два интервала (45 и 60-и ден), не се установяват бактерии в мозъка и вътрешните органи на зайци, заразени с двата мутантни щама. Всички опитни животни, заразени с дивия и мутантните щамове екскретират патогенните бактерии във фецеса през първите две седмици от началото на инфекцията.

Резултатите от хепаринизираните кръвни проби взети от ушната вена са представени на Фиг. 28. След инфекция с мутантните щамове се наблюдава левкоцитоза през целия период на изследване. След инфекция с ypkA щама, максимално изразена левкоцитоза се наблюдава на 14-я ден (15,28 ± 2,4 х 10⁹/л) и през последните два интервала (45 и 60-и ден) след инфекция с yopK (15,13 ± 2,6 х 10⁹ и 26,02 ± 3,5 х 10⁹/л съответно), в сравнение с контролните животни – 5,73 ± 0,7 х 10⁹/л.

	време (дни след инфекцията)

Подобна динамика на увеличаване броя на левкоцитите, но в по-ниски стойности, бе наблюдавана при групата, заразена с дивия щам, започвайки от 14-я ден след инфекцията и достигайки до 17,36 ± 2,6 х 10⁹/л в края на изследването. Диференциалният брой на левкоцитите показва, че левкоцитозата се съпровожда със значително увеличаване на броя на гранулоцитите и моноцитите и преходно понижаване броя на лимфоцитите. Наблюдаваната лимфопения бе най-силно изразена на 14 и 30-я ден след инфекцията с ypkA мутанта и само на 14-я ден след инфекция с дивия щам и на 30-я ден с yopK мутантния щам.

Проучено бе in vitro и взаимодействието на ПМНЛ с дивия и мутантните щамове Y. pseudotuberculosis (Фиг. 29). Бактерицидната активност (килинг ефект) на ПМНЛ е определена чрез изброяване на живите бактерии след 2 часово взаимодействие “левкоцити - бактерии” и чрез изчисляване на т.н. килинг индекс (КИ). Очевидно, бактериите от дивия щам са резистентни на бактерицидното действие на ПМНЛ, изолирани от зайци заразени със същия патоген (КИ < 1,0) през първия месец от инфекцията, подобно на ефекта на ПМНЛ от здрави зайци (КИ 0,82 ± 0,16). Тази устойчивост е значително краткотрайна след инфекция с мутантните щамове – до 7-я ден след инфекция с yopK и до 14-я ден след инфекция с ypkA. Най-висока килингова активност (КИ 2,25 ± 0,42), е установена след инфекция с yopK на 45-я ден.

В опити, целящи да се сравни бактерицидната активност на кръвни серуми от заразени зайци срещу съответния бактериален агент, е установена резистентност на бактериите на 7-я ден след инфекция с всички изследвани щамове и на 14-я ден след инфекция с yopK. Йерсиниите се убиват ефективно в по-високи серумни разреждания – 1:16 и 1:32 от 14-я ден след инфекция с дивия щам и ypkA мутанта, респективно на 30-я ден след инфекция с yopK мутанта. Най-висока стойност на бактерицидна активност (разреждане 1:128) се наблюдава след инфекция с дивия щам на 45-я и 60-я ден.

Серумни проби от зайци, заразени с див тип и мутантни щамове Y. pseudotuberculosis са изследвани за титър на антитела от класовете IgG и IgM чрез ELISA тест (Табл. 14). Серумите, получени от животни

При животните заразени с дивия тип и мутанта ypkA се наблюдават възпалителни огнища в мозъка. Установява се и менингоенцефалит с лимфолевкоцитна инфилтрация около малките кръвоносни съдове, както и в бялата мозъчна субстанция на хемисферите. При зайците, заразени с дивия тип се доказват катарална пневмония и катарален ентерит, а след инфекция с ypkA се доказва само възпаление на далака. Интересна находка е настъпилата хиперплазия на лимфната тъкан в белите дробове на животните, заразени и с трите патогена, но най-добре изразена при зайците инфектирани с yopK мутанта. Клетъчната реакция в белите дробове се локализира около бронхиолите и малките бронхи. Лимфоцитни инфилтрати се наблюдават в МЛВ и тънките черва. Лезиите в тях са предимно в Пайеровите плаки (Фиг. 31), а в МЛВ – в лимфните фоликули, инфилтрирани с лимфоцити и хистиоцити.

yopK

7

YopH

YopM