Семинар по Патогенни микроорганизми и инфекциозна имунология към Института по микробиология "Стефан Ангелов", бан на 13. 06. 2011 и насочен за защита на същото заседание

Животните заразени с дивия щам показват бактерицидна активност срещу същия щам с титър 1:32 до 1:64. По-висока бактерицидна активност (титър 1:128) се наблюдава при серумите получени от заразени с мутантния щам WA314sodA на 14-я ден след инфекция срещу дивия тип бактерии и бактерициден титър 1:256 на 14-и и 30-и ден срещу мутантния щам.

За изясняване ролята на специфичния хуморален имунен отговор срещу дивия и мутантен щам Y. enterocolitica след орална инфекция на прасета, са изследвани кръвни серуми за наличие на анти- Yersinia антитела от класовете IgA, IgG и IgM в дните 7, 14, 30, 45 и 60 след заразяване. Установено е, че след инфекция с дивия тип, титърът на антителата варира от 1:50 дo1:600 с максимална стойност за IgG на 14-я ден след инфекцията. Най-висока стойност за IgA (1:100) е измерена на 30-я ден. В сравнение с дивия тип, значителен антитялов отговор е индуциран и след инфекция на прасетата с мутантния щам WA314sodА. IgA антитела са доказани на 7-я ден след инфекцията, с максимален титър от 1:400 на 30-я и 45-я ден. Антитела от клас IgG са установени от 14-я ден, с максимална стойност на 45-я ден – 1:600, който постепенно намалява и достига 1:200 в края на изследването (60-и ден). Инфекцията с мутантния щам индуцира и силен IgM антитялов отговор, с максимален титър 1:300 на 30-я ден (Табл. 16).

Прасетата заразени с дивия щам показват гноен менингоенцефалит, катарална пневмония и катарален ентерит от 14-и до 45-я ден след инфекцията. Наблюдаваните патоморфологични промени (менингоенцефалит, катарална пневмония, катарален ентерит) не се наблюдават след инфекция със WA314sodA мутантния щам. Имуноморфологичните промени, като хиперплазия на лимфната тъкан в МЛВ, тонзилите и тънките черва се наблюдават след инфекция с двата изследвани щама. Тези промени се доказват при прасета, заразени с дивия щам WA314 на 30-и, 45-и и 60-я ден след инфекцията. В сравнение, същите находки са по-интензивни при животните заразени с мутантния щам WA314sodА. Хиперплазия на лимфната тъкан в МЛВ и тънките черва се наблюдава от 14-я до 60-я ден след инфекцията, както и в тонзилите след 30-я ден от инфекцията. В тонзилите и МЛВ, както и в тънките черва се установява силна еозинофилна инфилтрация от 14-я до 60-я ден след заразяването. В черния дроб на заразените прасета с WA314sodA мутанта се наблюдават лимфохистиоцитни възелчета през целия период на изследване – от 7-я до 60-я ден след инфекцията.

Специфичното активиране на лимфната тъкан води до значителна левкоцитоза, съпроводена с лимфоцитоза и моноцитоза през целия период на протичане на инфекцията с дивия или мутантния щам. След инфекция с дивия (WA314) и мутантния щам WA314sodA на зайци се установи достоверно увеличение на броя на левкоцитите, моноцитите и гранулоцитите. Основната разлика при двата експериментални модела е броят на лимфоцитите, който е значително по-висок при прасетата, за разлика от модела зайци, инфектирани с дивия и мутантен щам Yersinia. Разликата вероятно се дължи на активната миграция на Т-лимфоцитите в лимфните възли и активиране на чревния имунитет при свинете (Stokes et al., 2001). Понижената вирулентност на sodА мутанта при Yersinia се характеризира с понижена способност да обезврежда кислородни метаболити и екзогенни кислородни радикали произведени от фагоцитите (Di Genaro et al., 2003), както и с установената от нас повишена чувствителност на мутанта към бактерицидния ефект на неутрофилите. Наличието на антитялов отговор се установи чрез ELISA тест на втората седмица след инфекция с дивия и мутантен щам. Високите стойности на антителата се запазват и след последния интервал на изследването. Наблюдаваните високи титри след инфекция с мутантния щам се съпровождат и от удължена колонизация на тонзилите и тънките черва, както и с активиране на лимфоцитите и еозинофилна инфилтрация на тонзилите, МЛВ и тънките черва. Подобно активиране на антитяловия отговор се доказа и след орална инфекция на зайци с WA314sodА мутанта.

Прасетата заразени с дивия тип щам Y. enterocolitica 8081, серотип О:8 и ЛПЗ-мутантни щамове изглеждат видимо здрави и не проявяват клинични признаци на заболяване, като настръхване, загуба на апетит или диария. Телесната температура на заразените животни не се различава достоверно от тази на здравите (контролни) животни, независимо от щама на заразяване.

Протичането на инфекцията бе проследявано и чрез отчитане на бактериалното обсеменяване на мозъка и вътрешните органи. Микробиологичните резултати от изследването на различни тъканни проби показват, че дивия тип бактерии се изолират от тонзилите и МЛВ само на 7-я ден. Подобни резултати са получени и с грапавия мутант (R2). Wzz мутантът също колонизира тонзилите и МЛВ, и се изолира от тонзилите на 30-я ден след инфекцията. Wzy мутантът се изолира само от тонзилите на 7-я ден. Само дивият тип бактерии се екскретират във фецеса до 7-я ден след инфекцията (5,2 ± 0,6) х 10² КОЕ/гр. фецес.

Динамиката в броя на левкоцитите показва значителна левкоцитоза след инфекцията с дивия тип в интервала от 7 до 45-я ден (Фиг. 33). Максималният брой клетки – 59,8 ± 8,9х10⁹/л е измерен на 30-я ден след инфекцията. Левкоцитоза е установена и след инфекции на прасетата с wzz и wzy мутантните щамове. След инфекция с мутанта wzz максимален брой левкоцити е установен в интервала от 30-я до 60 ден (33,6 ± 4,8 х 10⁹/л), а след инфекция с wzy – на 14-я ден (42,1 ± 6,3х10⁹/л). Левкоцитозата е съпроводена от моноцитоза и лимфоцитоза, която се нормализира на 60-я ден след инфекцията.

		време (дни след инфекцията)

В сравнение с контролните прасета, статистически достоверно повишаване на броя на лимфоцитите се установява на 14, 30 и 45-и ден след инфекция с дивия тип (55,6 ± 8,1%). Максимални стойности на лимфоцитите са доказани на 7-я ден след инфекция с wzz (46,1 ± 5,2%) и wzy (40,0 ± 3,3%). Моноцитоза е установена в началото на инфекцията с мутантния щам wzz (7,6 ± 1,8% на 7-я ден след инфекцията), която продължи до 30-я ден (9,0 ± 1,5%). Значително по-висок брой на моноцити е установен на 7 и 30-я ден след инфекцията на прасетата с wzy – 8,4 ± 0,8, респективно 9,4 ± 1,9%. При инфекция с грапавия мутант, не се установяват промени в броя на тези класове левкоцити. Всички изследвани щамове предизвикват увеличаване на броя на еритроцитите и на стойностите на хемоглобина.

Бактерицидната активност на ПМНЛ, изолирани от контролни и заразени прасета е проучена in vitro срещу съответния щам използван за възпроизвеждане на експерименталната инфекция. ПМНЛ получени от прасета, заразени с дивия щам на 7-я и 14-я ден след инфекцията убиват по-слабо съответните бактерии (1,4±0,2, респективно 1,2±0,3), в сравнение с левкоцитите от контролните животни (2,6±0,3) или ПМНЛ от същата група опитни животни, изолирани на 30-и, 45-и и 60-и ден (2,5±0,4, 2,9±0,3 и 3,3±0,4 респективно) (Фиг. 34). Левкоцитите, изолирани между 7 и 45-и ден след инфекция с грапавия мутант (R2) показват най-силен бактерициден ефект, последвани от левкоцитите изолирани от прасетата инфектирани с мутантите wzz и wzy. Грапавият мутант бе най-чувствителен към бактерицидната активност на ПМНЛ на 30-я ден с КИ от 19,6±3,7. Wzz мутантният щам е най-чувствителен на 7-я ден след инфекцията на опитните животни (КИ 12,8±2,4), а wzy мутанта е най-чувствителен на 14-я ден – 16,2±3,1.

Бактерицидната активност на нормални серуми от контролни прасета е ниска – титър е 1:8 срещу всички изследвани щамове (Табл. 17).

Серумите от прасета, заразени с дивия тип Y. enterocolitica О:8