Семинар по Патогенни микроорганизми и инфекциозна имунология към Института по микробиология "Стефан Ангелов", бан на 13. 06. 2011 и насочен за защита на същото заседание

Дивият тип Yersinia enterocolitica О:8 предизвиква възпалителни промени в прасетата, като гноен менингоенцефалит, катарална пневмония, спленит, умерен катарален ентерит, лимфаденит и лимфохистиоцитни възелчета в чернодробния паренхим. Имуноморфологичните промени обаче са явни при прасетата заразени с ЛПЗ мутантните щамове, особено с wzz (Фиг. 35) и wzy мутантите.

Фигура 35 Тънко черво от прасе заразено с Y.enterocolitica wzz, 14-и ден след инфекция. Лимфоцитна инфилтрация на Пайеровите плаки и еозинофилна инфилтрация в lamina propria. H&E, увеличение 80x

30-я ден след инфекцията. Активирането на лимфната тъкан и левкоцитопоезата води до значителна левкоцитоза, съпроводена с лимфоцитоза и моноцитоза, наблюдавани при животните заразени с дивия тип, wzz и wzy мутантните щамове. За разлика от изследваният модел зайци, при прасетата се наблюдават увеличен брой еритроцити и повишени стойности на хемоглобина. Вероятно този феномен се дължи на способността на вирулентните щамове Y. enterocolitica О:8 да натрупват желязo in vivo и да стимулират хематопоетичната система в резултат на което се преодолява съществуващата физиологична анемия при подрастващите прасета. Всички мутантни щамове проявяват чувствителност към бактерицидния ефект на левкоцитите по време на междинната фаза от развитието на инфекцията. Хуморалният имунен отговор на прасетата се съпровожда и от повишена бактерицидна активност на кръвния серум, която е по-висока при нормалните серуми в сравнение с обработените с MgEGTA. Този факт потвърждава участието на класическия път на активиране на комплемента при елиминиране на инфектиращите бактерии. Прасетата, заразени с дивия тип щам показват ясно изразени патохистологични промени в белия дроб, в черния дроб, далака, тънките черва и мозъка. При прасетата, заразени с мутантните щамове бяха наблюдавани различни хистологични промени като хиперплазия на лимфната тъкан в имунокомпетентните органи – тонзили, далак, МЛВ и Пайерови плаки.

В настоящето проучване се доказва, че мутантните щамове Yersinia колонизират безсимптомно лимфната тъкан на тонзилите и МЛВ. Независимо от това, прецизният анализ на патогенността и имуногенността чрез използване на различни in vitro тестове показва значително атенуиране на ЛПЗ мутантните щамове при запазен имуногенен потенциал. В сравнение с дивия тип и другите мутантни щамове, wzz мутанта показа по-продължителна левкоцитоза и моноцитоза, по-висок инвазивен потенциал, и ефективен имунен отговор, съпроводен с явно имуноморфологично преустройство на гостоприемника. Тези промени са от важно значение при цялостната оценка на всеки кандидат за жив ваксинален вектор с орално приложение.
9.6. Инфекция на прасета с див и мутантни щамове на Y. pseudotuberculosis

9.6.1. Клинични признаци

Проучен е патогенният потенциал на дивия и на мутантните щамове yopK и ypkA на Y. pseudotuberculosis серотип О:3 на модел per os инфекция при прасета. Прасетата заразени с всички изследвани щамове изглеждат здрави и не показват клинични признаци на инфекция като настръхване на четината, загуба на апетит или диария. Телесната температура на животните, заразени с дивия или yopK мутантния щам (38,4-38,9^оС) не се различава значително от тази на контролните (здрави) животни (39,0±0,4^оС). Статистически недостоверно повишаване на температурата се отбелязва само на 45-я ден след инфекцията с ypkA мутантния щам (39,6 ± 0,3^оС).

Протичането на инфекцията е проследено и чрез отчитане броя на бактериите, колонизиращи мозъка и вътрешните органи, използвайки директно култивиране на тъканни проби. Резултатите показват наличие на бактерии във фецеса до 14-я ден след заразяване с дивия и ypkA мутантния щам. Бактерии са установени в тонзилите след инфекция с дивия и двата мутантни щама на 14-я ден съответно 5,5 х 10⁴, 3,9 х 10⁴ и 2,8 х 10⁴ КОЕ/гр. тъкан. През първата седмица от инфекцията с дивия щам е доказано колонизиране на МЛВ –3,05 х 10² КОЕ/гр тъкан. Бактерии не се изолират от изследваните органи (мозък, тонзили, бял дроб, черен дроб, далак, МЛВ, тънко черво, жлъчка, фецес) в по-късните интервали – 30, 45 и 60-и ден.

След инфекция с дивия и мутантните щамове Y. рseudotuberculosis се установява значителна левкоцитоза (Фиг. 36). Най-висок е броят на левкоцитите на 45-я ден след инфекция с дивия щам (41,7 ± 6,3 х 10⁹/л и съответно на 30-я и 14-я ден след инфекция с yopK и ypkA (28,6 ± 1,9 х10⁹/л и 41,4 ± 5,6 х10⁹/л в сравнение с контролната стойност на здрави прасета – 17,2 ± 4,1 х10⁹/л. Левкоцитозата се съпътства от лимфоцитоза и моноцитоза на 7 и 14-я ден след инфекция с дивия и yopK мутантния щам. Статистически достоверно понижаване на броя на гранулоцитите (гранулоцитопения) е установено на 7 и 14-я ден след инфекция с дивия щам и на 14-я ден след инфекция с yopK и ypkA мутантите. Достоверно увеличаване на броя на еритроцитите е установено след инфекция с всички изследвани щамове. В сравнение със здравите контроли, концентрацията на хемоглобина е също увеличена след инфекция с трите щама Y. рseudotuberculosis, като най-висока стойност се отбелязва на 30-я ден след инфекция с дивия щам (22,8±4,1 гр/л) и на 45-я ден след инфекция с yopK и ypkA (16,2±2,5 гр./л, съответно 20,8±2,1 гр./л).

време (дни след инфекцията) Легенда: * - статистически достоверна разлика в сравнение с контролните животни (P0.05); к - контрола

Бактерицидната активност на кръвни серуми от експериментално заразени прасета е изследвана срещу съответните видове бактерии.

Титрите на анти-Yops антителата от класовете IgA, IgG и IgM в серуми от заразени прасета са определени чрез ELISA. Серумите от животни, заразени с дивия щам показват най-високи IgG титри - 1:200 до 45-я ден след инфекцията (Tабл. 20). Същата стойност на IgG антителата е измерена на 30-я ден след инфекция с yopK мутантния щам. Титри от 1:50 на IgA и IgM са доказани при всички опитни групи.

Имуноблот анализът е използван за изследване на специфичния IgG антитялов отговор при прасета, заразени с див и мутантни щамове Y. pseudotuberculosis (Фиг. 38).

Фигура 38 Имуноблот анализ на IgG антитяловия отговор при прасета, заразени с див и мутантни щамове Y. рseudotuberculosis серотип О:3

Дивият щам Y. pseudotuberculosis предизвиква редица

патоморфологични промени като гноен менингоенцефалит, катарална пневмония и възпалителни промени във вътрешните органи на животните на 14, 30 и 45-и ден след инфекцията. Некротични огнища са наблюдавани сред лимфната тъкан на тонзилите по време на целия период на изследването. Лимфохистиоцитарна инфилтрация в Глисоновия триъгълник на черния дроб е установена единствено при прасета, заразени с дивия щам. При инфекцията с мутантните щамове (yopK и ypkA) се откриват имуноморфологични промени, като хиперплазия на лимфната тъкан в тонзилите, в перибронхиалната лимфна тъкан на белия дроб, МЛВ и Пайеровите плаки на тънките черва. Струпвания на макрофаги и хистиоцити се доказват сред лимфната тъкан на тонзилите и МЛВ (Фиг. 39). Всички тези промени са по-добре изразени след инфекция с yopK мутантния щам.

Фигура 39 Мезентериален лимфен възел от прасе заразено с мутантен щам yopK на Y.pseudotuberculosis, 14-и ден след инфекцията. Възел със струпване на макрофаги и хистиоцити. (←). Оцветяване H & E, увеличение 125 x

Клиничното протичане на инфекцията при орално заразени прасета с всеки един от трите щама Y. pseudotuberculosis протича безсимптомно, с екскреция на бактериите до 14-я ден след инфекцията с дивия щам и ypkA мутанта. И трите щама са способни да инвазират и колонизират тонзилите, но само дивия достига до МЛВ. Инфекциите с дивия и yopK мутантния щам се съпровождат със значителна левкоцитоза, съпроводена с лимфоцитоза и моноцитоза в началните етапи, което е показател за ефективно стимулиране на лимфната тъкан. Антитяловият IgG отговор бе установен на втората седмица (14-и ден след инфекцията), като антитела се експресират срещу 10 външномембранни белтъка - YopO, YscP, YopH, YopM, YopB, LcrV, YopD, YopN, YopP и YopE. Патоморфологични изменения се наблюдават само при прасета, заразени с дивия щам. Обратно, морфологични промени типични за имунологично преустройване на организма бяха наблюдавани след заразяване с двата мутантни щама, по-добре изразени при yopK мутантния щам. Важна имуноморфологична находка е хиперплазията на лимфната тъкан след заразяване на прасетата с yopK и ypkA мутантите на Y. pseudotuberculosis.

В настоящите проучвания, Y. pseudotuberculosis серотип О:3, див и мутантни щамове се доказват като перзистиращи агенти в тонзилите на прасетата, разглеждани като важен резервоар на тази инфекция. Анализът на техния патогенен и имуногенен потенциал чрез използване на in vitro тестове показва значително атенуиране на yopK и ypkA мутантните щамове при значително запазена имуногенност. В сравнение с дивия тип и ypkA, yopK мутантния щам показа ефективен имунен отговор и при двата изследвани модела, съпроводен от явни имуноморфологични промени. Ето защо този мутант е подходящ кандидат за жив ваксинален вектор, способен да представя хетероложни антигени посредством своята Т3СС.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

През последното десетилетие на миналия век, след въвеждане на гел-електрофорезата в пулсово поле (ГЕПП) и късо режещи ензими, стана възможно да се определят рестрикционните профили на цели бактериални геноми по сравнително бърз и лесен начин. Тези открития имат важно практическо приложение за бактериалната идентификация, епидемиологията на инфекциозните заболявания и създаването на нова генерация ваксини.

В настоящият дисертационен труд е охарактеризирана стабилността на генома на Yersinia enterocolitica и Y. pseudotuberculosis като важно условие за техния избор при генетичното конструиране на живи ваксинални вектори. Получените резултати от молекулярното типиране на Y. enterocolitica посредством ГЕПП сочат, че този метод е много чувствителен и може да бъде прилаган в епидемиологичната практика за диференциране на щамове от един и същи био/серотип. Освен това той може успешно да бъде адаптиран за проучвания на епидемични взривове или нозокомиални инфекции, с цел проследяване движението на бактериите или източника на инфекция. Ето защо, макар и относително скъп, ГЕПП се счита за най-чувствителния, дискриминативен и надежден метод за молекулярно типиране на цели бактериални геноми и като такъв се използва като златен стандарт и понастоящем.

Фенотипната експресия на вирулентните фактори от една страна и активността на фагоцитите от друга играят важна роля в патогенезата и изхода от йерсиниозата. В нашите изследвания бе доказана по-висока фагоцитна активност при левкоцити и пМа от мишки, плъхове и зайци срещу авирулентните (pYV-) в сравнение с вирулентните (pYV+) щамове Y. enterocolitica. Тези показатели се съпровождат от статистическо достоверно увеличаване броя на левкоцитите и пМа в началото на инфекцията. Способността на бактериите да преживяват и да се размножават вътреклетъчно в ПМНЛ и макрофаги се доказа и електронномикроскопски. Установената от нас способност на pYV+ и pYV- щамове Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis да преживяват и да се размножават в макрофаги има важно патогенетично значение, поради факта че тези макрофаги се явяват „толерантни” места за in vivo намножаване и дисеминиране на патогена.

С цел проучване патогенетичните механизми на йерсиниозата за първи път е възпроизведена експериментална интраперитонеална инфекция на европейски лалугери (Citellus citellus) с Y. pseudotuberculosis серотипове О:1 и О:3. Резултатите показват, че инфекцията с Y. pseudotuberculosis при лалугерите протича като остра генерализирана инфекция с летален изход при серотип О:3 и като хронична и самоограничаваща се инфекция при серотип О:1. При орално предизвиканата инфекция на зайци с Y. enterocolitica 4/O:3 се установява развитие на генерализирана субакутна инфекция, с преходни левкопения и хипертермия. Доказаните от нас антитела потвърждават хипотезата, че Y. enterocolitica перзистира в организма и индуцира силен антитялов отговор. Патоморфологично се доказват гноен менингоенцефалит, катарална пневмония, лимфаденит и артрит. Анализът на резултатите от оралната инфекция на прасета налага извода, че тази експериментална инфекция протича хронично и протрахирано с разпространение и перзистиране на Y. enterocolitica О:3 в макроорганизма и с характер на генерализирана инфекция. Ето защо прасетата могат да бъдат важен фактор в епидемиологията и епизоотологията на йерсиниозата, а месото добито от тях и съответните продукти са непосредствен риск за здравето на консуматора. Нашите проучвания сочат, че тонзилите на клинично здрави свине са резервоар на патогенни и непатогенни йерсинии, което характеризира бактериите от този вид като фарингеален коменсал при тези животни. Обстоятелството, че йерсиниите са психрофилни бактерии способни да растат на ниски температури, е в основата на разработената от нас бърза техника за изолиране, която би могла да се използва с успех и при други хранителни продукти с наличие на богата странична микрофлора. С цел подобряване на серологичната диагноза на йерсиниозата при хора и животни разработихме ELISA тест който предимството, че е високо чувствителен и специфичен, и позволява едновременното изследване на голям брой серумни проби. Заедно с имуноблот теста, двата метода могат успешно да се използват за доказване на IgG, IgА и IgМ специфични антитела и тяхната динамика за диагностициране на чревни и извън чревни хронични инфекции, предизвикани от Yersinia

В поредица от изследвания, целящи определяне ролята на отделни фактори на вирулентността, проучихме патогенния и имуногенен потенциал на диви и мутантни щамове Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis на модели орална инфекция при зайци и прасета. Нашите изследвания върху протичането на експериментална per os инфекция при тези два вида животни доказват, че те са оригинални и репродуктивни модели за сравняване на патогенността и имуногенността на диви и мутантни щамове Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis.Проучени бяха бактериалната колонизация на различни органи, клиничните особености и патохистологичните промени, способността на бактериите да преодоляват бактерицидния ефект на ПМНЛ и кръвния серум, и способността им да индуцират хуморален имунен отговор.

Идеята за локален имунитет, която се заражда в началото на 20-ти век, се последва от интензивни проучвания върху мукозния имунитет фокусирани върху разработването на ваксини и ваксинотерапията. Мутации в свързани с вирулентността гени, целящи атенуиране на патогена без да се засяга чувствително бактериалната способност да преживяват и да се размножават екстрацелуларно в гостоприемниковите лимфни тъкани може да доведат до разработване на ваксинални щамове. В идеалния случай такива атенуирани щамове трябва да запазват тъканния си тропизъм и способността си да стимулират значителен клетъчен и антитялов отговор подобно на дивия тип организми.

Проведените от нас изследвания върху експериментални per os инфекции на зайци и прасета сочат, че мутацията в определени гени на вирулентността при Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis води до промяна както на патогенния потенциал на родителския щам, така и на специфични параметри от антиинфекциозната защита при взаимодействието микроб-гостоприемник, определяйки развитието и изхода от инфекциозния процес. Важна роля в тези процеси заема и видовата чувствителност на гостоприемника, която следва да се отчита при всеки вид инфекция. Обща характеристика на изследваните мутанти sodA, R2, wzz, wzy, yopK и ypkA е тяхното атенуиране, изразено в различна степен и проявяващо се в по-слаби (при зайците) до липсващи (при прасетата) патоморфологични промени, заменени с имуноморфологично преустройство и запазен хуморален имунен отговор и при двата вида гостоприемници. Определен интерес предизвикват мутантите sodA и wzz при Yersinia enterocolitica О:8 и yopK при Yersinia pseudotuberculosis О:3, които са значително отслабени по своята способност да колонизират различни органи, но със запазен имуногенен потенциал, индуцирайки висок антитялов отговор. Същевременно, тези мутантни щамове показват добра способност за дисеминация в лимфните органи, като тонзили и МЛВ, без да предизвикват симптоми на генерализирана системна инфекция. Всички тези характеристики на инфекциозния процес правят посочените мутанти надеждни кандидати за потенциални живи ваксинални вектори.