Семинар по Патогенни микроорганизми и инфекциозна имунология към Института по микробиология "Стефан Ангелов", бан на 13. 06. 2011 и насочен за защита на същото заседание

	Българска академия на науките
	Институт по микробиология “стефан ангелов”

ХРИСТО МИЛАДИНОВ НАЙДЕНСКИ

“Доктор на ветеринарномедицинските науки”

аМа – алвеоларни макрофаги

БФР – буфериран физиологичен разтвор

ГЕПП – гел-електрофореза в пулсово поле

ГКТС – главен комплекс на тъканната съвместимост

кб – килобази

КИ – килинг индекс

КОЕ – колонии образуващи единици

ЛПЗ - липополизахарид

МНЛ – мононуклеарни левкоцити

МЛВ – мезентериални лимфни възли

Мм – молекулна маса

мМ – моларен обем в милимол

МПА – месопептонен агар

ОВП – остров на високата патогенност

пМа – перитонеални макрофаги

ПМНЛ – полиморфонуклеарни левкоцити

РНХА – реакция непряка хемаглутинация

СМФ - система на мононуклеарните фагоцити

ФИ – фагоцитен индекс

ФЧ – фагоцитно число

BHI – сърдечно-мозъчна среда

BSA – говежди серумен албумин

CIN – cefsulodin irgasan novobiocin агар

CR-MOX – конго-род магнезиево оксалатна среда

EGTA – етиленгликол тетраоцетна киселина

ELISA – ензимно свързан имуносорбентен анализ

FCS – фетален телешки серум

HBSS - буфериран разтвор на Хенкс

IgA – имуноглобулин А,

IgG – имуноглобулин Г

IgM – имуноглобулин М

IFN - гама интерферон

IL-12 - интерлевкин-12

i.p. - интраперитонеално приложение

i.v. - интравенозно приложение

kDa - килодалтон

MgEGTA - ethylene-glycol-bis(-aminoethyl) tetraacetic acid

p.o. – орално приложение

pYV – плазмид на вирулентността при Yersinia

RES/РЕС – ретикуло-ендотелна система

SD – стандартно отклонение

SDS-PAGE – натриев додецилсулфат полиакриламидна гел електрофореза

SOD/СОД – супероксид дисмутаза

T3SS/Т3СС – тип 3 секреционна система

TNF- - тумор некротизиращ фактор алфа

TSA/TSB – триптично-казеинова агарова среда/бульонна среда

Yops – външно мембранни протеини при Yersinia

Динамично променящите се условия на околната среда (екологични катастрофи, глобалното затопляне на климата, масовото използване на антибиотици и химиотерапевтици и др.), променят свойствата на патогенните микроорганизми и техните предпочитани ниши, определящи тяхното епидемиологично и епизоотологично значение и разпространение.

Потенциалната способност на някои бактерии да предизвикват инфекциозно заболяване е генетичен признак, характеризиращ микробния вид, възникнал в процеса на еволюцията на бактериално-гостоприемниковите взаимоотношения. Патогенните бактерии притежават гени на вирулентността, които кодират различни белтъци, чиито функции обуславят тяхната способност да предизвикват различни по тежест, форми и протичане инфекциозни заболявания в организма на гостоприемника. За разлика от тях, други гени асоциирани с вирулентността, допринасят за високата устойчивост на тези бактерии в околната среда и по такъв начин увеличават възможността за разпространение сред нови индивиди или обуславят преживяемостта им при преминаване от един гостоприемник към друг.

Анализът на генома при основните за човека и животните патогенни бактерии, разкрива не само еволюцията на тези патогени, но изяснява и неочаквани аспекти от тяхната биология, откриващи нови неограничени възможности за приложение. Създадена бе и молекулярна версия на постулатите на Кох, като опит да се дефинират понятия като “патоген” и “фактор на вирулентност”, а доказаната геномна нестабилност се оказаха изключително важен и ключов фактор за бактериално-гостоприемниковите взaимоотношения.

Освен известните зооантропонози (колибактериоза, салмонелоза, листериоза, бруцелоза и др.), заплашващи човешкото здраве, през последните години в света се установи широко разпространение на бактериите от род Yersinia, което обуславя увеличените случаи на спорадични и вариращи по своята тежест заболявания по хора и животни. Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis сa убиквитерно разпространени в околната среда и се изолират не само от болни, но и от здрави хора, животни, птици, както и от хранителни продукти, водоизточници, пасища и др.

Като ентеропатогени с различен патогенен потенциал, обуславящ се от наличието на хромозомни и плазмидно детерминирани гени на вирулентността, Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis са атрактивни кандидати за живи ваксинални вектори. Проведените интензивни и задълбочени проучвания върху факторите на вирулентност са важна предпоставка за генетичното конструиране на щамове с мутации в редица гени на вирулентността с цел тяхното атенуиране и същевременно запазване на техния инвазивен и имуногенен потенциал. Размножавайки се в гостоприемника, тези живи бактериални вектори произвеждат постоянно хетероложни антигени, създавайки по този начин “ваксинална фабрика”, която осигурява и представя непрекъснато антигени, стимулирайки мукозния, хуморалния и клетъчния имунитет. Освен това, живите ваксинални вектори притежават редица предимства като лесно приложение (орално), ниска цена и висока трайност без необходимост от лиофилизация, което допълнително повишава интереса към този тип ваксини.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Използвани са 83 щама Y. еnterocolitica от които 5 мутантни, 35 щама Y. pseudotuberculosis от които 2 мутантни, 6 щама Y. kristensenii, 2 щама Y. frederiksenii, 3 щама Y. intermedia, 2 щама Y. bercovieri и 1 щам Y. mollaretii. Щамовете са получени от Референтния център по Йерсиния към СЗО (Институт Пастъор, Париж), Университета на Турку (Финландия), Университета на Умеа (Швеция) и от Max von Pettenkoffer Institute (Мюнхен, Германия)

В експериментите са влючени 275 плъхa от линията Wistar, 410 бр. ICR мишки, 192 заека от породата “Чинчила” и 155 “Новозеландска”, 55 лалугери (Citellus citellus), 168 броя прасета от породата Ландрас. Изследвани са и 340 кръвни проби от свине и 20 серумни проби от хора с реактивен артрит. Всички експерименти са проведени с разрешение на Комисиите по етика при БАН и БAБХ.

Провежда се с периферна хепаринизирана кръв и се отчита с автоматичен анализатор MS4 Vet (Melet Schl. Lab., Osny, France).

АМа и пМа са получени чрез промиване на белия дроб и перитонеалната кухина със студен HBSS (pH 7,2), количеството на който варира в зависимост от вида на модела опитни животни.

Полиморфонуклеарните левкоцити (ПМНЛ) се изолират от цяла кръв с използването на “Полисеп” (Фармахим), като сепарационна среда. Броят на макрофагите и левкоцитите се определя с камерата на Bürker, а жизнеспособността им с теста за отхвърляне на трипаново синьо и бе  90%.

Фагоцитната активност (по Ossada et al., 1982) се изразява като фагоцитен индекс (ФИ) и фагоцитно число (ФЧ), по формулата:

ФИ(%)=броят на макрофагите, съдържащи бактерии от 200 макрофага х 100; ФЧ=броят на погълнатите бактерии от 100 фагоцитирали макрофаги. При ПМНЛ от мишки бе използван и метода на Sumnaliev и сътр. (1971), като ФИ се изчисляват като % от фагоцитиралите ПМНЛ за 100 левкоцита. Като алтернативен тест бе използван метода на Ivanovska and Philipov (1996) с радиоактивно белязане на бактериите с D-[U-¹⁴C]-глюкоза (1x9,25 MBq, Amersham Int.) и отчитане на радиоактивността след процеса на фагоцитоза.

Килинг ефект на макрофаги и левкоцити

Определя се по метода на Visser и сътр. (1995) и се изразява с показателя “килинг индекс” - съотношение на броя бактерии в суспензията съхранявана на 0^оС и броят им след инкубация на суспензията с левкоцити 2 часа на 37^oC.

Бактерицидната активност на кръвни серуми бе определяна по метода на Pai and De Stephano (1982). Серумното разреждане което предизвиква 50% намаляване на първоначално инокулирания брой бактерии по време на 2 ч инкубация на сместа бактерии-серум на37^oC се приема като бактерициден титър. Същата процедура се използва и при серумите, третирани с 10mМ MgEGTA за свързване на Са²⁺ йони и инхибиране на класическия път на комплемента.

Тъканни фрагменти от изследваните органи се отделят стерилно и хомогенизират в 5 мл стерилен БФР със Stomacher 80 Biomaster (Seward, UK). В опитите с мутантни щамове към БФР се прибавя 0,1 % Tergitol TMN 10 (Fluka, Switzerland) и 0,1 % BSA (Merck, Germany). 0,1 мл от всяко 10-кратно разреждане се посява върху CIN агар (Oxoid).

След смилане, 10 гр. от тонзилите се култивират в 50 мл TSB, съдържащ 0,2% жлъчни соли (Difco Laboratories, USA), при периодично разклащане. След това към пробите се добавя Irgasan (Ciba-Geigy, Switzerland) в концентрация 4 µg/ml и същите се инкубират още 24 ч на 18^оС. От така получените култури се правят 10-кратни разреждания, 100 µl от които се разсяват върху BHI агар (Oxoid, UK) с добавени MgCl₂ (0,025М), Na oxalate (0,025М) и Congo red 50 мг/л. Наподобяващите Yersinia колонии - червени (pYV+) и безцветни (pYV-) се идентифицират биохимично с кита АРI 20Е (BioMerieux, France) и серологично чрез аглутинация с използване на поликлонални О-специфични заешки антисеруми.

Кръвните серуми се разреждат двукратно с БФР, започвайки от 1:40. Епруветките съдържащи 0,5 мл разреден серум и 0,5 мл антигенна суспенсия (приготвена по метода на Winblat и сътр., 1966) се инкубират на 37^оС за 2 ч и на 12 ч на стайна температура. Аглутинацията се отчита с невъоръжено око и за титър се приема най-високото разреждане на серума.

Тестът се провежда в 96-ямкови плаки (Microlon, High Аffinity), които се натоварват с 100 µl антиген, изолиран от щам Y. enterocolitica (IP8944), О:3, pYV+ по метода на Michiels et al. (1990). Използва се конюгиран с пероксидаза и разреден 1:1000 заешки анти-свински IgG (Sigma), а оптичната плътност се измерва на Organon Teknika Reader 530, v. 1.23 при дължина на вълната 492 nm със субстрат ортофенилендиамин (Sigma). Реакцията се стопира с 1N NaOH.

За разделяне на Yops се използват 5% концентриращ и 12% разделящ гел (170V за 1 час). След разделяне, белтъците се пренасят електрофоретично (300 mA за 45 мин) върху нитроцелулозна мембрана. Мембраните се инкубират с изследвания заешки серум разреден 1:100 в блокиращ буфер, а след това и с второто антитяло - антизаешки пероксидазно маркирани IgG и IgМ (Sigma). Реакцията се визуализира с буфер, съдържащ диаминобензидин и Н₂О_2.

Фрагментите от органи се фиксират в 10% буфериран неутрален формалдехид и обработват по метода на Vesselinova (1984). Парафинните срезове се оцветяват с хематоксилин-еозин и по метода на Garvey et al. (1986) за доказване на бактерии.

Фрагментите от органи се фиксират в 3% глутаралдехид в 0,1 М какодилатен буфер (рН 7,4) и в 1% OsO₄ в 0,2 М какодилатен буфер (рН 7,4). Пробите се дехидратират във възходяща редица етанол и се включват в Epon812 (Serva, Germany). Ултратънки срезове (50 nm) се оцветяват с уранил ацетат и оловен цитрат. Наблюденията са проведени на електронен микроскоп Opton 10C (Zeiss, Germany).

Геномна ДНК се включва в агарозни блокчета по метода на Iteman и сътр. (1991) и обработва с рестрикционните ензими SpeI, XbaI, NotI. Електрофоретичното разделяне в пулсово поле бе проведено със системата AutoBase System (Q-Life Systems Inc., Kingston, Ontario, Canada) и 0,8 % агарозни гелове в 1 Х ТБЕ буфер за 50 или 65 ч, на стайна температура. Всички параметри на електрофорезата са програмирани на магнитни карти в зависимост от избраните стойности на фрагментите (100 до 150 кб, 150 до 200 кб, и др.) Фрагментите са оцветявани с етидиев бромид.

Резултатите са представени като средна стойност на проучваните параметри ± стандартно отклонение (SD). За оценка достоверността на получените разлики е използван t-теста на Student или компютърния вариант One-Way ANOVA Test (Microcal^TM Origin^TM, version 4110). Статистическата достоверност се определя при Р < 0,05.

. Гел-електрофереза в пулсово поле (ГЕПП) на Y. enterocolitica

От изследваните 20 щама Y. enterocolitica от биосеротип 4/О:3 се наблюдават 11 пулсотипа (Фиг. 1, Табл. 1). Пулсотип 4^А доминира и се установява при 50% от изследваните щамове, въпреки че те са изолирани от различни страни на Европа. Останалите 10 щама, изолирани от 5-те континента, показват различен пулсотип, означен като 4^B, 4^C, 4^D, 4^E, 4^F, 4^G, 4^H, 4^I, 4^J, 4^K (Табл. 1). Не се установява корелация между фаготипа и пулсотипа на изследваните щамове.

Фигура 1 NotI рестрикционни профили на 20 щама Y. enterocolitica 4/О:3 след ГЕПП (номерата на щамовете съответстват на тези от Таблица 1); А-К – пулсотипове на съответните щамове; 200-50 – размер на ДНК фрагментите (кб)

При изследваните 20 щама Y. enterocolitica биосеротип 2/О:9 се наблюдават общо 12 пулсотипа (Фиг. 2, Табл. 2). За разлика от щамовете 4/О:3, тук няма доминиращ пулсотип. Сравняването на генетичните профили показва наличието на 2 големи подгрупи (I и II, Фиг. 2). Като цяло, хомогенността на профилите във всяка група е висока, но между двете групи се наблюдават и различия. Това означава, че щамовете от Y. enterocolitica 2/О:9 се разделят на две групи, а след това се разделят вътре във всяка група. Интересно е, че всички щамове от пулсотип А са изолирани от месни продукти в Аржентина (Табл. 2), което би могло да означава, че всички животни (или месото от тях) са заразени от един и същ източник. С изключение на щамовете от пулсотип 2А, друго географско разпределение не се забелязва. Този пулсотип се установява и при щамове, изолирани от други страни, докато различни пулсотипове се срещат и в една и съща страна (Табл. 2). Анализът на фигури 1 и 2 показва, че изолатите от Y. enterocolitica 2/О:9 се различават напълно от тези на 4/О:3 по своя пулсотип. Освен това се забелязва корелация между пулсотипа и другите фенотипни маркери – биотип, серотип и фаготип.