Семинар по Патогенни микроорганизми и инфекциозна имунология към Института по микробиология "Стефан Ангелов", бан на 13. 06. 2011 и насочен за защита на същото заседание



страница1/9
Дата24.02.2017
Размер1.49 Mb.
  1   2   3   4   5   6   7   8   9





Българска академия на науките




Институт по микробиология

стефан ангелов”









ХРИСТО МИЛАДИНОВ НАЙДЕНСКИ


ПАТОГЕНОМНИ ПРОУЧВАНИЯ ВЪРХУ YERSINIA

И ИМУНЕН ОТГОВОР СЛЕД ИНФЕКЦИЯ С ДИВИ

И МУТАНТНИ ЩАМОВЕ
АВТОРЕФЕРАТ

на дисертационен труд за присъждане на научната степен

Доктор на ветеринарномедицинските науки”



(Научна специалност 01.06.12 – Микробиология)

Рецензенти: Проф. д-р Николай Масалски, двмн

Проф. д-р Тодор Кантарджиев, дмн

Проф. д-р Игнат Абрашев, дбн

СОФИЯ

2011

Дисертационният труд е представен на заседание на Националния семинар по Патогенни микроорганизми и инфекциозна имунология към Института по микробиология “Стефан Ангелов”, БАН на 13.06.2011 и насочен за защита на същото заседание.

Съдържа 306 страници, 23 таблици и 39 фигури. Библиографията включва 694 заглавия.

Защитата ще се състои на ................от.........часа в залата на Института по физиология на растенията и генетика – БАН, ул. „Акад. Георги Бончев” бл.21, 1113 София на открито заседание. Материалите по защитата са на разположение в кабинета на Научния секретар на Института по микробиология “Стефан Ангелов” - БАН ул. „Акад. Георги Бончев” бл.26, 1113 София

Списък на използваните съкращения

аМа – алвеоларни макрофаги

БФР – буфериран физиологичен разтвор

ГЕПП – гел-електрофореза в пулсово поле

ГКТС – главен комплекс на тъканната съвместимост

кб – килобази

КИ – килинг индекс

КОЕ – колонии образуващи единици

ЛПЗ - липополизахарид

МНЛ – мононуклеарни левкоцити

МЛВ – мезентериални лимфни възли

Мм – молекулна маса

мМ – моларен обем в милимол

МПА – месопептонен агар

ОВП – остров на високата патогенност

пМа – перитонеални макрофаги

ПМНЛ – полиморфонуклеарни левкоцити

РНХА – реакция непряка хемаглутинация

СМФ - система на мононуклеарните фагоцити

ФИ – фагоцитен индекс

ФЧ – фагоцитно число

BHI – сърдечно-мозъчна среда

BSA – говежди серумен албумин

CIN – cefsulodin irgasan novobiocin агар

CR-MOX – конго-род магнезиево оксалатна среда

EGTA – етиленгликол тетраоцетна киселина

ELISA – ензимно свързан имуносорбентен анализ

FCS – фетален телешки серум

HBSS - буфериран разтвор на Хенкс

IgA – имуноглобулин А,

IgG – имуноглобулин Г

IgM – имуноглобулин М

IFN - гама интерферон

IL-12 - интерлевкин-12

i.p. - интраперитонеално приложение

i.v. - интравенозно приложение

kDa - килодалтон

MgEGTA - ethylene-glycol-bis(-aminoethyl) tetraacetic acid

p.o. – орално приложение

pYV – плазмид на вирулентността при Yersinia

RES/РЕС – ретикуло-ендотелна система

SD – стандартно отклонение

SDS-PAGE – натриев додецилсулфат полиакриламидна гел електрофореза

SOD/СОД – супероксид дисмутаза

T3SS/Т3СС – тип 3 секреционна система

TNF- - тумор некротизиращ фактор алфа

TSA/TSB – триптично-казеинова агарова среда/бульонна среда

Yops – външно мембранни протеини при Yersinia



УВОД

Динамично променящите се условия на околната среда (екологични катастрофи, глобалното затопляне на климата, масовото използване на антибиотици и химиотерапевтици и др.), променят свойствата на патогенните микроорганизми и техните предпочитани ниши, определящи тяхното епидемиологично и епизоотологично значение и разпространение.

Потенциалната способност на някои бактерии да предизвикват инфекциозно заболяване е генетичен признак, характеризиращ микробния вид, възникнал в процеса на еволюцията на бактериално-гостоприемниковите взаимоотношения. Патогенните бактерии притежават гени на вирулентността, които кодират различни белтъци, чиито функции обуславят тяхната способност да предизвикват различни по тежест, форми и протичане инфекциозни заболявания в организма на гостоприемника. За разлика от тях, други гени асоциирани с вирулентността, допринасят за високата устойчивост на тези бактерии в околната среда и по такъв начин увеличават възможността за разпространение сред нови индивиди или обуславят преживяемостта им при преминаване от един гостоприемник към друг.

Анализът на генома при основните за човека и животните патогенни бактерии, разкрива не само еволюцията на тези патогени, но изяснява и неочаквани аспекти от тяхната биология, откриващи нови неограничени възможности за приложение. Създадена бе и молекулярна версия на постулатите на Кох, като опит да се дефинират понятия като “патоген” и “фактор на вирулентност”, а доказаната геномна нестабилност се оказаха изключително важен и ключов фактор за бактериално-гостоприемниковите взaимоотношения.

Освен известните зооантропонози (колибактериоза, салмонелоза, листериоза, бруцелоза и др.), заплашващи човешкото здраве, през последните години в света се установи широко разпространение на бактериите от род Yersinia, което обуславя увеличените случаи на спорадични и вариращи по своята тежест заболявания по хора и животни. Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis сa убиквитерно разпространени в околната среда и се изолират не само от болни, но и от здрави хора, животни, птици, както и от хранителни продукти, водоизточници, пасища и др.

Като ентеропатогени с различен патогенен потенциал, обуславящ се от наличието на хромозомни и плазмидно детерминирани гени на вирулентността, Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis са атрактивни кандидати за живи ваксинални вектори. Проведените интензивни и задълбочени проучвания върху факторите на вирулентност са важна предпоставка за генетичното конструиране на щамове с мутации в редица гени на вирулентността с цел тяхното атенуиране и същевременно запазване на техния инвазивен и имуногенен потенциал. Размножавайки се в гостоприемника, тези живи бактериални вектори произвеждат постоянно хетероложни антигени, създавайки по този начин “ваксинална фабрика”, която осигурява и представя непрекъснато антигени, стимулирайки мукозния, хуморалния и клетъчния имунитет. Освен това, живите ваксинални вектори притежават редица предимства като лесно приложение (орално), ниска цена и висока трайност без необходимост от лиофилизация, което допълнително повишава интереса към този тип ваксини.



Редица генетично конструирани щамове от видовете Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis са изследвани интензивно през последното десетилетие с оглед способността им да предизвикват имунен отговор у мишки срещу експресирани чужди (хетероложни) антигени предимно с вирусен произход. Тези мутанти обаче следва да бъдат изследвани и върху допълнителни животински модели, съобразно конкретната разработвана ваксина. Ето защо търсенето, създаването и изпитването на живи ваксинални вектори е важна предпоставка за създаването на нова генерация ваксини, приложими срещу редица социално и икономически значими инфекции, като СПИН, грип, класическа чума по свинете и др.

ЦЕЛ И ЗАДАЧИ

ЦЕЛ на настоящият дисертационен труд е да се проучи генетичното разнообразие и стабилността на генома на патогенни серотипове Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis и да се определи ролята на отделни фактори на вирулентността за протичането на инфекциозния и имунизаторен процес при различни гостоприемници, с оглед приложението на съответните мутанти като жив ваксинален вектор.
За изпълнението на тази цел бяха поставени следните ЗАДАЧИ:

1. Сравнителен анализ на генома на патогенни био/серотипове Y. enterocolitica.

2. Сравнителен анализ на генома на патогенни серотипове Y. pseudotuberculosis.

3. Доказване наличието на хромозомни и плазмидно кодирани маркери на вирулентността в патогенни и непатогенни щамове Yersinia.

4. Характеристика на фагоцитозата при различни eкспериментални модели.

5. Проучване патогенезата на експериментални инфекции с Yersinia при различни гостоприемници.

5.1. Интраперитонеална инфекция на лалугери с Y. pseudotuberculosis серотипове О:1 и О:3.

5.2. Рer os инфекция на зайци с Y. enterocolitica серотип О:3, биотип 4.

5.3. Рer os инфекция на прасета с Y. enterocolitica серотип О:3, биотип 4.

6. Микробиологичен скрининг за наличието на Yersinia в тонзили от кланично обработени свине.

7. Серологичен скрининг за наличието на антитела срещу Yersinia при свине за угояване и разплод.

8. IgG антитялов отговор при пациенти с реактивен артрит.

9. Проучване на инфекциозния и имунизаторен процес при експериментални per os инфекции с Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis.

9.1. Инфекция на зайци с див и sodA мутантен щам на Y. enterocolitica.

9.2. Инфекция на зайци с див и ЛПЗ мутантни щамове на Y. enterocolitica.

9.3. Инфекция на зайци с див и мутантни щамове на Y. pseudotuberculosis.

9.4. Инфекция на прасета с див и sodA мутантен щам Y. enterocolitica.

9.5. Инфекция на прасета с див и ЛПЗ мутанти на Y. enterocolitica.

9.6. Инфекция на прасета с див и мутантни щамове на Y.pseudotuberculosis.


МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ




Бактериални щамове

Използвани са 83 щама Y. еnterocolitica от които 5 мутантни, 35 щама Y. pseudotuberculosis от които 2 мутантни, 6 щама Y. kristensenii, 2 щама Y. frederiksenii, 3 щама Y. intermedia, 2 щама Y. bercovieri и 1 щам Y. mollaretii. Щамовете са получени от Референтния център по Йерсиния към СЗО (Институт Пастъор, Париж), Университета на Турку (Финландия), Университета на Умеа (Швеция) и от Max von Pettenkoffer Institute (Мюнхен, Германия)


Опитни животни и кръвни серуми

В експериментите са влючени 275 плъхa от линията Wistar, 410 бр. ICR мишки, 192 заека от породата “Чинчила” и 155 “Новозеландска”, 55 лалугери (Citellus citellus), 168 броя прасета от породата Ландрас. Изследвани са и 340 кръвни проби от свине и 20 серумни проби от хора с реактивен артрит. Всички експерименти са проведени с разрешение на Комисиите по етика при БАН и БAБХ.


Експериментални инфекции

А. 60 мишки са заразявани интраперитонеално (i.p.) с Y. enterocolitica 8081 (O:8, pYV+), в доза 4,0 х 105 КОЕ/мишка (LD50).

Б. 40 ICR мишки са заразявани i.p. с Y. pseudotuberculosis IP32984, О:3 в доза 2,0 х 103 КОЕ/мишка (LD50). На всеки интервал (1, 3, 5, 7, 10, 17 и 30-и ден след заразяване) се евтаназират по 5 животни. Пет броя са незаразените (контролни) животни.

В. 22 заека се заразяват per os с Y. enterocolitica IP8944 O:3/4, pYV+, с 2,6 х 109 КОЕ. На 1, 4, 8, 15, 28, 40 ден се изследват по 3 животни, а 4 са контролни.

Г. 25 лалугера се заразяват i.p. с Y. pseudotuberculosis О:1 (IP32982) и 25 със серотип О:3 (IP32984) в доза 1,0 х 109 КОЕ. На всеки интервал (1, 3, 7, 15 и 30-и ден), се евтаназират по 3 животни. Пет броя са незаразените (контролни) животни.

Д. 35 заека от породата “Новозеландска” се заразяват per os с 5,0 х 109 КОЕ от всеки от щамовете - Y. enterocolitica WA314 и Y. enterocolitica WA314sodA. На всеки интервал (7, 14, 30, 45, и 60-и ден) се изследват по 3 броя заразени и 1 контролен (здрав) заек.

Е. 4 групи от по 15 заека (общо 80) от породата “Новозеландска” се заразяват per os с 5,0 х 109 КОЕ от всеки от щамовете - Y. enterocolitica 8081-L2 (див тип), 8081-R2, wzzGB и wzyEGB. На 7, 14, 30, 45, и 60 ден се изследват по 3 броя заразени и 1 контролен заек.

Ж. Три групи от по 15 заека (общо 55) от породата “Новозеландска” се заразяват per os с 1,6 х 1010 КОЕ от дивия щам в Y. pseudotuberculosis, съответно 2,3 х 1010 и 2,0 х 1010 КОЕ от yopK и ypkA мутантните щамове. На 7, 14, 30, 45, и 60-и ден след инфекцията се изследват по 3 броя заразени и 2 броя контролни зайци.

З. 15 прасета се заразяват per os с 5,0 х 1010 КОЕ от Y. enterocolitica IP8944 (O:3/4, pYV+). На 1, 4, 8, 15 и 25-и ден се изследват по 3 животни. Контролната група включва също 3 животни.

И. 60 прасета се заразяват per os с диви и мутантни щамове Y. enterocolitica О:8 (pYV+), както следва: 15 с див тип 8081-L2 в доза 5,7 х 1011 КОЕ, 15 с 8081-R2 (7,4 х 1011 КОЕ), 15 с wzzGB (2,9 х 1011 КОЕ) и 15 с wzyEGB (4,2 х 1011 КОЕ). На 7, 14, 30, 45 и 60-и ден се изследват по 3 животни от опитната група и по 1 от контролната.

Й. 30 прасета се заразяват per os с див и мутантен щам Y. enterocolitica WA314 О:8 (pYV+), както следва: 15 се заразяват с дивия тип щам в доза 1,4 х 1011 КОЕ, а друга група от 15 животни се заразяват с мутантния щам WA314sodA в доза 3,5 х 1011 КОЕ. На 7, 14, 30, 45 и 60-и ден се изследват по 3 опитни и по 1 контролно животно.

К. Три групи от по 15 прасета (общо 50) се заразяват per os с 2,2 х 1011 КОЕ от дивия щам Y. pseudotuberculosis, съответно 5,1 х 1011 и 4,3 х 1011 КОЕ от yopK и ypkA мутантните щамове. На 7, 14, 30, 45, и 60-и ден след инфекцията се изследват по 3 броя заразени животни от всяка група и 1 брой от контролните (здрави) прасета.
Хематологичен анализ

Провежда се с периферна хепаринизирана кръв и се отчита с автоматичен анализатор MS4 Vet (Melet Schl. Lab., Osny, France).


Получаване на макрофаги

АМа и пМа са получени чрез промиване на белия дроб и перитонеалната кухина със студен HBSS (pH 7,2), количеството на който варира в зависимост от вида на модела опитни животни.


Получаване на полиморфонуклеарни левкоцити

Полиморфонуклеарните левкоцити (ПМНЛ) се изолират от цяла кръв с използването на “Полисеп” (Фармахим), като сепарационна среда. Броят на макрофагите и левкоцитите се определя с камерата на Bürker, а жизнеспособността им с теста за отхвърляне на трипаново синьо и бе  90%.



Фагоцитоза in vitro

Фагоцитната активност (по Ossada et al., 1982) се изразява като фагоцитен индекс (ФИ) и фагоцитно число (ФЧ), по формулата:

ФИ(%)=броят на макрофагите, съдържащи бактерии от 200 макрофага х 100; ФЧ=броят на погълнатите бактерии от 100 фагоцитирали макрофаги. При ПМНЛ от мишки бе използван и метода на Sumnaliev и сътр. (1971), като ФИ се изчисляват като % от фагоцитиралите ПМНЛ за 100 левкоцита. Като алтернативен тест бе използван метода на Ivanovska and Philipov (1996) с радиоактивно белязане на бактериите с D-[U-14C]-глюкоза (1x9,25 MBq, Amersham Int.) и отчитане на радиоактивността след процеса на фагоцитоза.

Килинг ефект на макрофаги и левкоцити

Определя се по метода на Visser и сътр. (1995) и се изразява с показателя “килинг индекс” - съотношение на броя бактерии в суспензията съхранявана на 0оС и броят им след инкубация на суспензията с левкоцити 2 часа на 37oC.



Серумна бактерицидна активност

Бактерицидната активност на кръвни серуми бе определяна по метода на Pai and De Stephano (1982). Серумното разреждане което предизвиква 50% намаляване на първоначално инокулирания брой бактерии по време на 2 ч инкубация на сместа бактерии-серум на37oC се приема като бактерициден титър. Същата процедура се използва и при серумите, третирани с 10mМ MgEGTA за свързване на Са2+ йони и инхибиране на класическия път на комплемента.



Бактериален клирънс

Тъканни фрагменти от изследваните органи се отделят стерилно и хомогенизират в 5 мл стерилен БФР със Stomacher 80 Biomaster (Seward, UK). В опитите с мутантни щамове към БФР се прибавя 0,1 % Tergitol TMN 10 (Fluka, Switzerland) и 0,1 % BSA (Merck, Germany). 0,1 мл от всяко 10-кратно разреждане се посява върху CIN агар (Oxoid).



Микробиологично изследване на тонзили от свине

След смилане, 10 гр. от тонзилите се култивират в 50 мл TSB, съдържащ 0,2% жлъчни соли (Difco Laboratories, USA), при периодично разклащане. След това към пробите се добавя Irgasan (Ciba-Geigy, Switzerland) в концентрация 4 µg/ml и същите се инкубират още 24 ч на 18оС. От така получените култури се правят 10-кратни разреждания, 100 µl от които се разсяват върху BHI агар (Oxoid, UK) с добавени MgCl2 (0,025М), Na oxalate (0,025М) и Congo red 50 мг/л. Наподобяващите Yersinia колонии - червени (pYV+) и безцветни (pYV-) се идентифицират биохимично с кита АРI 20Е (BioMerieux, France) и серологично чрез аглутинация с използване на поликлонални О-специфични заешки антисеруми.



Степенна аглутинация със серийни разреждания тип Widal

Кръвните серуми се разреждат двукратно с БФР, започвайки от 1:40. Епруветките съдържащи 0,5 мл разреден серум и 0,5 мл антигенна суспенсия (приготвена по метода на Winblat и сътр., 1966) се инкубират на 37оС за 2 ч и на 12 ч на стайна температура. Аглутинацията се отчита с невъоръжено око и за титър се приема най-високото разреждане на серума.


ELISA тест

Тестът се провежда в 96-ямкови плаки (Microlon, High Аffinity), които се натоварват с 100 µl антиген, изолиран от щам Y. enterocolitica (IP8944), О:3, pYV+ по метода на Michiels et al. (1990). Използва се конюгиран с пероксидаза и разреден 1:1000 заешки анти-свински IgG (Sigma), а оптичната плътност се измерва на Organon Teknika Reader 530, v. 1.23 при дължина на вълната 492 nm със субстрат ортофенилендиамин (Sigma). Реакцията се стопира с 1N NaOH.


SDS-PAGE и имуноблот анализ

За разделяне на Yops се използват 5% концентриращ и 12% разделящ гел (170V за 1 час). След разделяне, белтъците се пренасят електрофоретично (300 mA за 45 мин) върху нитроцелулозна мембрана. Мембраните се инкубират с изследвания заешки серум разреден 1:100 в блокиращ буфер, а след това и с второто антитяло - антизаешки пероксидазно маркирани IgG и IgМ (Sigma). Реакцията се визуализира с буфер, съдържащ диаминобензидин и Н2О2.


Хистология

Фрагментите от органи се фиксират в 10% буфериран неутрален формалдехид и обработват по метода на Vesselinova (1984). Парафинните срезове се оцветяват с хематоксилин-еозин и по метода на Garvey et al. (1986) за доказване на бактерии.


Електронна микроскопия

Фрагментите от органи се фиксират в 3% глутаралдехид в 0,1 М какодилатен буфер (рН 7,4) и в 1% OsO4 в 0,2 М какодилатен буфер (рН 7,4). Пробите се дехидратират във възходяща редица етанол и се включват в Epon812 (Serva, Germany). Ултратънки срезове (50 nm) се оцветяват с уранил ацетат и оловен цитрат. Наблюденията са проведени на електронен микроскоп Opton 10C (Zeiss, Germany).


Полимеразно верижна реакция (ПВР)

Геномна ДНК се изолира по метода на Flamm et al. (1984). Амлификацията на гените на вирулентността (irp и yst) бе проведена с кит, производство на Института по вирусология при РАМН (Москва), а за гените ail и virF с кита PuReTaqtmReady-To-Gotm (GE Healthcare, Austria). Амплификациите са провеждани с MasterCycler Personal (Eppendorf, Germany) и са визуализирани с 1,5% агарозен гел, оцветен с етидиев бромид и електрофореза (120 V за 30 мин).
Гел-електрофореза в пулсово поле (ГЕПП)

Геномна ДНК се включва в агарозни блокчета по метода на Iteman и сътр. (1991) и обработва с рестрикционните ензими SpeI, XbaI, NotI. Електрофоретичното разделяне в пулсово поле бе проведено със системата AutoBase System (Q-Life Systems Inc., Kingston, Ontario, Canada) и 0,8 % агарозни гелове в 1 Х ТБЕ буфер за 50 или 65 ч, на стайна температура. Всички параметри на електрофорезата са програмирани на магнитни карти в зависимост от избраните стойности на фрагментите (100 до 150 кб, 150 до 200 кб, и др.) Фрагментите са оцветявани с етидиев бромид.


Статистически анализ

Резултатите са представени като средна стойност на проучваните параметри ± стандартно отклонение (SD). За оценка достоверността на получените разлики е използван t-теста на Student или компютърния вариант One-Way ANOVA Test (MicrocalTM OriginTM, version 4110). Статистическата достоверност се определя при Р < 0,05.




1
РЕЗУЛТАТИ И ОБСЪЖДАНЕ

. Гел-електрофереза в пулсово поле (ГЕПП) на Y. enterocolitica



1.1. Анализ на пулсотипа на биосеротиповете 4/О:3, 2/О:9, 1А/О5 и 3/О:5

От изследваните 20 щама Y. enterocolitica от биосеротип 4/О:3 се наблюдават 11 пулсотипа (Фиг. 1, Табл. 1). Пулсотип 4А доминира и се установява при 50% от изследваните щамове, въпреки че те са изолирани от различни страни на Европа. Останалите 10 щама, изолирани от 5-те континента, показват различен пулсотип, означен като 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4J, 4K (Табл. 1). Не се установява корелация между фаготипа и пулсотипа на изследваните щамове.






Фигура 1

NotI рестрикционни профили на 20 щама Y. enterocolitica 4/О:3 след ГЕПП (номерата на щамовете съответстват на тези от Таблица 1); А-К – пулсотипове на съответните щамове; 200-50 – размер на ДНК фрагментите (кб)

При изследваните 20 щама Y. enterocolitica биосеротип 2/О:9 се наблюдават общо 12 пулсотипа (Фиг. 2, Табл. 2). За разлика от щамовете 4/О:3, тук няма доминиращ пулсотип. Сравняването на генетичните профили показва наличието на 2 големи подгрупи (I и II, Фиг. 2). Като цяло, хомогенността на профилите във всяка група е висока, но между двете групи се наблюдават и различия. Това означава, че щамовете от Y. enterocolitica 2/О:9 се разделят на две групи, а след това се разделят вътре във всяка група. Интересно е, че всички щамове от пулсотип А са изолирани от месни продукти в Аржентина (Табл. 2), което би могло да означава, че всички животни (или месото от тях) са заразени от един и същ източник. С изключение на щамовете от пулсотип 2А, друго географско разпределение не се забелязва. Този пулсотип се установява и при щамове, изолирани от други страни, докато различни пулсотипове се срещат и в една и съща страна (Табл. 2). Анализът на фигури 1 и 2 показва, че изолатите от Y. enterocolitica 2/О:9 се различават напълно от тези на 4/О:3 по своя пулсотип. Освен това се забелязва корелация между пулсотипа и другите фенотипни маркери – биотип, серотип и фаготип.



При Y. enterocolitica серотип О:5 се наблюдава още по-висока степен на хетерогенност, като са идентифицирани 18 пулсотипа (Фиг. 3 и Табл. 3). Три от щамовете са от пулсотип 1АА и са изолирани от Аржентина, а другите щамове от серотип О:5 или О:9 показват различни пулсотипове, което е доказателство за съществуването на хетерогенност сред изолатите от Аржентина.
  1   2   3   4   5   6   7   8   9


База данных защищена авторским правом ©obuch.info 2016
отнасят до администрацията

    Начална страница