Сьвременни диагностични методи при дерматомикози



Дата09.01.2018
Размер89.89 Kb.
Сьвременни диагностични методи при дерматомикози

Кьм сьвременните диагностични методи днес се числят



  • Флуоресцентен препарат

  • Дерматоскопия

  • Хистологични

  • Инокулационни

  • Имунологични

  • Молекулярно - генетични методи PCR /Polymerase chain reaction/ и нейните модификации


Флуоресцентен препарат

Модификация на нативния микроскопски метод с калиева основа /КОН/.

Към калиевата основа се прибавя флуоресцентно вещество (Blankophor, Calcofluor или Acridinorange), което се свързва с хитиновата обвивка и маркира хифите и артроспорите, които започват да флуорсцират в синьо-зелен цвят.

Необходим е флуоресцентен микроскоп и приложение на ултравиолетова светлина (UVA 365 nm).

Методът е значително по чувствителен от микроскопския препарат с калиева основа.
Дерматоскопия

Дерматоскопиятае неинвазивен метод за визуализиране на кожата и нейните придатъци, посредством оптично увеличение на структурите, невидими за невъоръжено око .

Дерматоскопията намира приложение основно при тинеи на капилициума и онихомикоза и е помощно средство в диференциалната диагноза на тинеите на гладката кожа.

Онихомикоза

При онихомикози чрез дерматоскопия може да се разграничи дисталната субунгвална онихомикоза от травматична онихолиза .

При дистална субунгвална онихомикоза, проксималната границата е назъбена, с наличие на жълто-бели шипове т. нар. модел "Северно сияние".

Tinea capitis

Дерматоскопското изследване на скалпа позволява бързо и неинвазивно диагностициране на Tinea capitis в детската възраст и извън нея, както и отдиференцирането на ранна ангрогенна алопеция от телогенен ефлувиум.

Дерматоскопската картина на Tinea capitis, причинена от M. canis се представя от черни точки на фона на плътно прикрепени бели сквами, с наличие на единични начупени косми, което я отличава от алопециите.

Установява няколко различни модела на дерматоскопски изглед на инфекцията , които до голяма степен позволяват разграничаването и от alopecia areata.




Дерматоскопска картина на Tinea capitis

- Къси начупени косми - находка, която се установява при над 80% от случаите . Тя обаче е неспецифична и не патогномонична за Tinea capitis , като често се наблюдава и при други заболявания на космите .

- „Черни точки“ и косми във формата на „запетая“ могат да бъдат дерматоскопска находка на Tinea capitis при 55-60% от случаите.

Kосми тип „запетая“ не се наблюдават при alopecia areata.

- Косми във вид на тирбушон, или зигзаг-образни косми се установяват в по-малък процент-около 20%

Дерматоскопска картина на Alopecia areata

- По дерматоскопски характеристики, включва установяването на „черни точки“ в над 90% от случаите, „жълти точки“ в 50%.



- Косми във вид на удивителен знак се наблюдават в около 50% от случаите и се смятат за най-специфичният маркер за алопеция.

- Обезцветени велус косми, къси начупени косми, или къси наболи косми, се срещат респективно при 45%, 40% и 15% от случаите .



Хистопатологично изследване

Хистологичното изследване е по- рядко практикуван, но доста информативен метод. Оцветяването на материала се извършва по Gomori , PAS, или Groccot.

Хистологично изследване е основателно при атипичните случаи, с неспецифична клинична картина, особено при възрастни пациенти . То намира приложение повече при дьлбоките микози.

Оцветяването трябва да се извърши с периодична киселина - Shiff (PAS) или метенамин сребърно оцветяване, за да се визуализират гъбичните елементи.



Нокти

Хистологично изследване на ноктите е много полезна алтернатива на микроскопското и културелното изследване. Изрезки от нокти могат да бъдат изпратени до лабораторията за диагностика във формалин. В краен случай може да се извьрши инцизионна нокьтна биопсия (пьнч или скалпел).


Скалп и гладка кожа

Хистологичната картина при дерматофитните инфекции може да бъде доста разнообразна в зависимост от вида на гъбата.

Хроничните инфекции с Trichophyton rubrum протичат с картината на един хроничен дерматит . Понякога може да се наблюдава и по-изразена възпалителна реакция с обрзуване на крусти и везикулация.

При инфекция със зоофилни видове дерматофити възпалителната реакция е много по-силна, с образуване на дифузен грануломатозен възпалителен инфилтрат, с наличие на гигантски клетки тип "чуждо тяло".



Преимущество

Хистопатологичното доказване на гъбични елементи в тъканта е доста по-чувствителен и надежден метод, в сравнение с микроскопски препарат с калиева основа и култура.



Недостатьци

* Провеждането на тази манипулация обаче не винаги е възможно, тя често бива отказвана от самите пациенти .

* Не винаги хистопатологичната находка е позитивна, въпреки че гъбичките са налице в тъканта .

* Както и при директна микроскопия, хистопатологична диагноза не идентифицира вида на причинителя патоген.




Имунологични

/тьрсене на антиген, или тьрсене на антитела/

Дерматофитите продуцират трудно хуморален имунен отговор.

Използват се предимно при системна кандидоза и системна аспергилоза.

Установено е, че най-важните дерматофитни антигени са полизахаридите на гъбната стена. Установени са над 22 фракции с имунологична активност.

Дерматофитите действат хемотаксично и могат да активират комплемента по алтернативния път. Това е демонстрирано и при антропофилни, и при зоофилните видове.

Независимо от многобройните проучвания няма доказателства за това, че серумните антитела имат съществена роля при защита от дерматофитите. Титрите на специфичните IgM и IgG в серума не корелират с тежестта и хронологията на дерматофитната инфекция. Ключова роля в имунологичната защита от тези гъбични причинители играят сенсибилизираните Т-лимфоцити.


Молекулярно биологични методи

Класическите методи - микроскопския препарат с калиева основа /КОН/ и посявката на Sabouraud аgar са с ниска специфичност и дълго времетраене - 4-6 седмици. Допълнително е необходим и добър специалист, който точно да интерпретира резултатите.

През последните няколко години, като важен диагностичен метод се посочва молекулярната идентификация на дерматофитите .

По-точно прецизиране на диагностиката и точно идентифициране на причинителите би могло да бъде постигнато чрез въвеждането на нови молекулярно биологични способи, oт които най- голямо значение за практиката имат PCR (Polymerase chain reaction) и MALDI-TOF-MS (Matrix- assited laser desorption ionisation mass spеctometry) .

Последният се използва за доказване на онихимикоза директно или за потвърждаването и в материал, изолиран от култура .

Някои дерматофити, като Arthroderma (A.) benhamiae напр.,принадлежащ към рода Трихофитон- зоофилен дерматофит, могат да бъде идентифицирани само посредством молекулярно биологични способи.


PCR (Polymerase chain reaction)

Съвременните молекулярно-генетични методи са на базата на PCR/Polymeraze Chain Reaction/ - полимеразна верижна реакция и нейните модификации.

През 1983г. Kary Mullis представя процес за амплификация на нуклеинови киселини in vitro ,който става известен като “полимераза верижна реакция” .

Полимераза верижната реакция /PCR / за пръв път намира приложение в молекулярната биология за анализ на ДНК . PCR установява чужда,несвойствена за хазаина ДНК в различни секрети,телесни течности,тъкани,косми,кожа и други материали на организма .

Полимеразна верижната реакция (PCR) е техника, която се използва за амплифициране на ДНК (и в някои случаи РНК).

PCR се основава на това, че всеки човек, животно, растение, паразит, бактерия или вирус съдържа генетичен материал - ДНК (или РНК) последователности (нуклеотидни последователности), които са уникални за сьответния вид.

Чрез този метод се амплифицира /”умножава”/ търсената специфична ДНК –секвенция на определен вид бактерии, с което се доказва наличието му в изследвания материал.

Работи се с т.нар. праймери /primer - първите 20-30 нуклеотида от таргетния ДНК –участък/. Не се извършва репликация на цялата ДНК верига а само на най–специфичната и част за търсения патогенен причинител, която определя неговата индивидуалност - вид,род,щам. Отличен метод за микробна таксономия .

Следователно, ако пробата съдържа сегменти от ДНК или РНК, PCR е метода, използван за усилване ( амплификация - сьздаване на много еднообразни екземпляра) от тези уникални последователности, така че те могат да бъдат използвани, за да се определи с много висока степен на вероятност самоличността на източника , да се осъществи директно откриване на инфекциозен агент.

Полимеразната верижна реакция е процес на амплификация ин витро на ДНК- молекулата, с чиято помощ в течение на няколко часа една молекула ДНК може да се размножи в количество, превишаващо изходното в милиони пъти .

Праймерът може да продуцира видово - специфични профили за дерматофити - Microsporum canis, Microsporum gypseum, Trichophyton rubrum, Trichophyton ajelloi, Epidermophyton floccosum и др. ; дрожди - Candida spp, Malassezia spp и плесени - Scopulariopsis br, Fuzarium, Aspergillus, Peniciliium и др.

С PCR могат да бъдат разграничени три различни профила за Trichophyton mentagrophytes - нещо трудно постижимо с класическите методи на диагностика. Веригите на T.interdigitale принадлежат именно към един от тези три профила, с което методът доказва, че T.interdigitale е разновидност на Trichophyton mentagrophytes. Подобни разновидности са открити и при T. rubrum .

Още през 1999 година е описана и разработена специална генна сонда, която намира приложение за специфично доказване на T. rubrum от нокътен материал .

В България PCR метода при онихомикози за Trichophyton rubrum е въведен през 2005г от В.Кьрджева и Т.Кантарджиев .



Преимущество

PCR методиката има висока диагностична чувствителност.

Полимеразна верижна реакция (PCR) e ефективен,специфичен и бърз метод за лабораторна диагностика.

Бърза идентификация на съответния щам директно от материала.

Проблематични се оказват случаите, при които микроскопският препарат е положителен, а при провеждането на микробиологична култура не се наблюдава растеж при 30 до 50 % от случаите. Тази проблематика може да бъде преодоляна благодарение на PCR методиката.

Особено полезен е метода при смесени гьбични инфекции.



Недостатьк

Методът е скьп и с ограничена разпространеност.


PCR-Еlisa (polymerase chain reaction-enzyme linked immunosorbent assay)

Това е хибридна техника, която използва както PCR, така и ELISA за количественото определяне на определена ДНК секвенция. Първата стъпка на процеса се покрива от PCR етапите- денатурация, присъединяване на праймери и удължаване на веригата. Така получените копия ДНК -последователности са материал за втората стъпка - ELISA, в която се използват антитела срещу търсения причинител.

Така се определя наличието на дерматофити в материала и се диференцира техния вид.

Диагностичната стойност на PCR-Elisa-теста е 85,8% .

Този молекулярно биологичен способ директно от нокътен материал, позволява една сравнително бърза идентификация на съответния щам в рамките на 24 часа .
RFLP /Restriction fragment length polymorphism/

Плесенни гъбички като Fusarium, Acremonium, Aspergillus - тяхното най- точно отдиференциране е възможно в специализирани лаборатории, като първоначално се използва екстракция на рибозомна РНК чрез PCR, последвано от RFLP (Restriction fragment length polymorphism) .


MALDI-TOF-MS

/Matrix- assited laser desorption ionisation mass spеctometry- time of light/

MALDI-TOF-MS техологията се използва рутинно при идентификацията на определени бактерии и става все по-популярна в последните години . Актуалното приложение на методиката се ограничава за момента до идентификацията на съответния причинител, който расте в определена микробиологична култура .

MALDI-TOF-MS /Matrix- assited laser desorption ionisation mass spеctometry- time of light/ e мощен метод за идентифициране на причинители по молекулното тегло на специфични протеинови фрагметни.

Технологията се базира на съставянето на характерен спектрален отпечатък, базиран на дезорбцията на протеинни йони в клетките.

Спектърът при всеки микроорганизъм е строго индивидуален и може да бъде използван за диагностициране на гъбични видове. Mетодиката е приложима освен при диагностиката на онихомикозите, така също и при диагностиката на определени дерматомикози.

Протичането на анализа, както и подготовката на материалите е бърз и лесен процес /5-10 минути за проба/.

Методът е специфичен и чувствителен- получава се информация за точната характеристика на съответния причнител.

MALDI-TOF-MS може да се изполва като спомагателен тест за потвърждение на резултатите от гъбичната култура, особено когато има трудности културата да бъде точно идентифицирана.

Tехниката (MALDI-TOF MS) може да бъде прилаган директно за идентифициране на гъбичните щамове от нокътен материал.



С MALDI-TOF-MS се изолират и разграничават различните причинители от рода Candida (C.albicans, C. parapsilosis, C. magnoliae, C.dubliniensis, C. lusitaniae, C. krusei,C. glabrata, C. tropicalis and C. guilliermondii ). Методът успешно се прилага при диагностиката на онихомикози и кожни микози, причинени от дерматофити.


База данных защищена авторским правом ©obuch.info 2016
отнасят до администрацията

    Начална страница