След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели: А. Знания



Дата30.08.2016
Размер201.36 Kb.
#7891
Биосинтеза на РНК
Цели

Цели на преподавателя: Да се опише синтезата и следсинтетичната обработка (зреене) на различните видове РНК и да се дадат примери за приложението на тези познания в медицината.



След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели:

А. Знания

1. Да посочат принципите, на които се основава синтезата на РНК;

2. Да изброят ензимите, необходими за синтезата на РНК в прокариоти и еукариоти;

3. Да изброят етапите, през които минава синтезата на РНК;

4. Да дефинират какво представляват промоторите, цис-действащи последователности в ДНК и транс-действащи фактори, стартова точка;

5. Да опишат структурата и функциите на промоторите при прокариоти;

6. Да опишат структурата и функциите на промоторите при еукариоти;

7. Да дефинират какво представляват транскрипционните фактори, силансерите и енхансерите;



Б. Разбирания

1. Да обяснят разликите между РНК полимеразите в прокариоти и еукариоти;

2. Да обяснят разликите между РНК полимерази І, ІІ и ІІІ в еукариоти;

3. Да обяснят образуването на преинициационния и инициационния комплекс в еукариоти;

4. Да обяснят как протича елонгирането на РНК;

5. Да обяснят как протича терминирането на РНК синтезата;

6. Да опишат следсинтетичната обработка на РНК-транскриптите в прокариоти;

7. Да опишат следсинтетичната обработка на рРНК-транскриптите и тРНК-транскриптите в еукариоти;

8. Да опишат следсинтетичната обработка на иРНК-транскриптите в еукариоти;

9. Да обяснят посттранскрипционното редактиране на иРНК



В. Умения да приложат познанията си върху този раздел, за да:

      1. преценят кои инхибитори на синтезата на РНК могат да се използват като антибиотици;

      2. обяснят причините за смъртоносното действие на токсина -аманитин от отровната гъба червена мухоморка;

      3. обяснят механизма на някои заболявания като -таласемии, чуплива X-хромозома и др.


13.1 Резюме

 Транскрипцията протича в три етапа: иницииране, елонгиране и терминиране. Като матрица се използва едноверижен участък от ДНК. Синтезираната РНК е комплементарна на участък от матричната верига на ДНК. Синтезата на РНК върви в посока от 5' към 3'-края. Катализира се от ензими, наречени ДНК зависими РНК полимерази.
 РНК полимеразата в прокариоти за разпознаване на промотора се нуждае от специална субединица s, която не е необходима за елонгирането. В еукариоти има три типа РНК-полимерази I, II и III за синтеза на рРНК, иРНК и тРНК, съответно.
 В прокариотните промотори има два участъка, разположени най-често преди стартовото място, които определят верността на транскрипцията. Еукариотните промотори са по-сложни. Промоторите, разпознавани от РНК полимераза II съдържат два класа участъци, осигуряващи основната и регулираната експресия. В голям брой случаи основната експресия зависи от разпознаването и свързването на РНК полимераза към олигонуклеотидни блокове в промотора, означавани като ТАТА- и ЦААТ- блокове. Свързването към първия осигурява верността на транскрипцията, а към втория - нейната честота. Регулираната експресия зависи от втория клас регулаторни участъци, съдържащи други олигонуклеотидни блокове, с различна ориентация и различно отдалечени преди или след стартовата точка, наречени енхансери и силансери. Тe медиират ефекта на различни сигнали (хормони, топлинен шок, тежки метали  и др.).
 За всеки от етапите на транскрипцията освен РНК полимеразата са необходими и други ензими или белтъчни фактори.
 Следсинтетичната обработка (посттранскипционно зреене) на различните първични РНК-транскрипти е също сложен процес. В прокариоти и еукариоти различните рРНК се получават от общ по-голям транскрипт, а всеки тРНК-транскрипт съдържа от 2 до 5 различни тРНК. В прокариоти иРНК не се обработват, а направо се използват като матрици за белтъчна биосинтеза. В еукариоти към първоначалния иРНК-транскрипт се добавя т.н. "шапка" и "опашка", отделят се интроните и се съединяват екзоните. Този процес се означава като сплайсинг (снаждане). Чрез алтернативен сплайсинг могат да се получат различни иРНК. Възможно е и посттранскрипционно редактиране на иРНК. То е причина за различната експресия на гена за аполипопротеин В в черен дроб и в черва.
 Инхибиторите на РНК синтезата се свързват с ДНК или към РНК полимеразата. Тези, които инхибират бактериална РНК полимераза, но не засягат синтезата на РНК в еукариоти, се използват като антибиотици. Смъртоносният ефект на токсини от мухоморка се обяснява с инхибиране на еукариотната РНК полимераза II. С грешки в сплайсинга се обясняват таласемиите, при което не се образува нормална  или -верига в хемоглобин. Разгледано е и заболяването "Чуплива Х хромозома".

13.2 Обща характеристика

 Синтезата на РНК протича в два етапа - транскрипция (презаписване) на ДНК матрицата и следсинтетична обработка на първичните транскрипти (посттранскрипционно зреене). Транскрипцията протича в три етапа: иницииране (начален етап), елонгиране (удължаване на веригата), терминиране (завършване).
 Като матрица за синтеза на определена РНК се използва едноверижен участък от ДНК, много малък в сравнение с целия геном. Новосинтезираната РНК е комплементарна на матричната верига на ДНК и съвпада с кодиращата верига на ДНК (фиг. 13-1), т.е. Т, Г, Ц от ДНК определят включването на А, Ц, Г, съответно. А от ДНК определя включване на У в РНК. Дадена верига от ДНК може да бъде матрична за едни гени, а кодираща за други.


Фиг. 13-1. Комплементарност между матричната верига на ДНК и първичния иРНК транскрипт.

 Информацията в матричната верига на ДНК се чете в посока от 3' към 5'-края. Синтезата на РНК се извършва в посока от 5' към 3'-края.


 Субстрати за синтезата са рибонуклеозидтрифосфатите УТФ, ЦТФ, АТФ, ГТФ. Енергия за изграждане на фосфодиестерните връзки се осигурява при разграждане на макроергичната връзка между  и -фосфатните групи в субстратите.

13.3 Ензими

 Ензимите, които катализират синтезата на РНК върху ДНК матрица се наричат ДНК-зависими РНК полимерази. 3'-5'-фосфодиестерната връзка се образува като 3'-ОН група на последния нуклеотид във веригата атакува алфа-фосфатната група на следващия присъединяван нуклеозид трифосфат, съпроводено с отделяне на пирофосфат.

 Смяташе се, че за разлика от ДНК полимеразите, РНК полимеразите не притежават допълнителни ензимни активности. Но при някои РНК полимерази е установена 3'-5'-екзонуклеазна активност.


13.3.1 РНК полимераза в прокариоти

 Escherihia coli има една РНК полимераза с м.т. 350 000, сложно устроена. По време на елонгирането се състои от пет субединици: , , , ',  [1]. За разпознаване на промотора и за правилно иницииране ензимът се нуждае от допълнителна  (сигма) субединица или  фактор (м. т. 80 000). Когато тази субединица е свързана към ензима, той се означава като холоензим (фиг. 13-2). В бактериите има много  фактори. Всеки от тях променя способността на РНК полимеразата да разпознава различни гени.

 
 








Фиг. 13-2. Структура и действие на РНК полимераза в E. coli.

1 - Свързване на -фактор към РНК полимераза, за да се получи холоензим;


2 - чрез -фактора холоензимът разпознава определен промотор в ДНК;
3 - иницииране на РНК синтезата. РНК полимеразата катализира последователното свързване на около 10 нуклеотиди в посока от 5' към 3' края;
4- отделяне на - фактора и елонгиране на веригата;
5 - терминиране на биосинтезата на РНК и освобождаване на РНК-транскрипта от ензима, който може да свърже нов -фактор и да започне нов синтезен цикъл.

13.3.2 РНК полимерази в еукариоти

 В еукариоти има три ядрени РНК полимерази (РНКП) (500 - 600 kDa) (табл. 13-1) и една митохондриална. Ядрените ензими се означават с римски цифри I, II и III. Всички те имат общ механизъм на действие, но разпознават различни промотори и образуват различни РНК. Полимераза I синтезира повечето от рРНК, полимераза II - иРНК, а полимераза III образува малки РНК - тРНК и 5S рРНК, съответно. Различават се по чувствителността си към отровата на гъбата червена мухоморка.

 РНК полимераза II се състои от 14 субединици. Двете най-големи (около 200 kDa) съответстват на бактериалните '. В карбоксилния им край има участък с многократно повтарящ се пептид от 7 остатъка: Тир-Сер-Про-Тре-Сер-Про-Сер. Този участък е субстрат за няколко кинази. Ензимът се активира при фосфорилиране в Сер и Тре остатъци и се инактивира при дефосфорилиране. Този участък е и свързващо място за медиаторни (супресорни) белтъци (Srb). При свързването на тези Srb белтъци към РНК полимераза II, се оформя холоензимът.

 Табл. 13-1. Разлики между ядрени ДНК-зависими РНК полимерази в еукариоти.

Вид полимераза



І



ІІ



ІІІ

Чувствителност към


-аманитин



няма



много чувствителна към ниски концентрации



чувствителна към високи концентрации

Продукт




повечето рРНК



иРНК



тРНК и 5S рРНК


13.4 Иницииране на транскрипцията

13.4.1 Представа за промотори

 РНК полимеразата не изисква зародиш. Ензимът трябва да разпознае стартовата точка в матричната верига за определен ген. Сложността на задачата проличава от следния пример. В Е. coli има 2000 стартови точки от общо 4 млн bp (двойки бази). В човек има около 100 000 стартови точки, разпръснати сред общо 3 х 109 bp. Затова гените, освен кодиращи участъци имат и регулаторни участъци. Те служат като ориентири или сигнали, които ензимът разпознава в ДНК и които го ориентират откъде да започне. Тези специфични участъци върху матричната верига на ДНК се наричат промотори. В промотора има олигонуклеотидни последователности, означавани като блокове (или рамки), определящи стартовата точка и честотата на транскрипция за даден ген. Тъй като са разположени върху същата ДНК молекула и близо до гена, който те регулират, блоковете се означават като цис-действащи. Белтъци, които се свързват към тези блокове и улесняват или пречат на свързване на РНК полимеразата, се означават като транс-действащи, защото са кодирани от други гени, различни от тези, които те регулират.

 Общоприети са следните термини и означения. Регулаторните консенсусни (т.е. най-често срещани) олигонуклеотидни последователности в гена се описват в посока 5'->3' върху кодиращата верига, въпреки че функционират само в двойноверижна ДНК. Позиция 1 (стартова точка) на гена е базата, еквивалентна с първата база в 5'-края на първоначалния РНК-транскрипт. Нуклеотидите, предшестващи първата база, се номерират отрицателно. Нуклеотидите след първата база се номерират положително.

13.4.2 Структура и функция на промоторите в прокариоти

 Прокариотните промотори са сравнително къси участъци с около 40 bp, разстояние, съпоставимо с големината на РНК полимеразата. Холоензимът при свързването си покрива изцяло промотора. В промотора има два къси консервативни блока преди стартовата точка, разпознавани от -субединицата на РНК полимеразата, чрез което се осигурява верността на транскрипция (фиг. 13-3-1).

 1) ТТГАЦА-блок, наричан още блок на Yanofsky или -35 секвенция, тъй като отстои на около 35 бази преди стартовата точка.

 2) ТАТА-блок, наричан още блок на Pribnow или -10 секвенция, тъй като отстои на около 10 бази преди стартовата точка. Последователността в този участък е идентична или близка до следната: ТАТААТ.




Фиг. 13-3-1. Структура на промоторите в прокариотна ДНК.
Показани са консервативни участъци в промоторите, разпознавани от -субединицата на РНК полимеразата, за да се осигури вярност на транскрипцията..

 При свързване на холоензима към ТГТТГАЦА-блок се получава т.н. затворен комплекс (фиг. 13-3-2), тъй като все още няма разделяне на двете вериги в ДНК. Свързването на ензима и към ТАТА-блок улеснява разединяването на веригите и достъпа на ензима до матричната верига.





Фиг. 13-3-2. Затворен транскрипционен комплекс в прокариотни клетки.

Затвореният комплекс се превръща в отворен комплекс (фиг. 13-2-3). Разтварянето на веригите в ТАТА-блок е улеснено от липсата на Г и Ц в този участък, което определя по-ниска точка на топене на ДНК. След добавянето на около 10 нуклеотиди,  факторът обикновено (но не винаги) се отделя от РНК полимеразата и ензимът продължава елонгирането.





Фиг. 13-3-3. Отворен транскрипционен комплекс в прокариотни клетки.

13.4.3 Структура и функции на промоторите в еукариоти

 Еукариотните промотори са по-сложни. Промоторите за РНК полимераза I и II, също като промотора на прокариотната РНК полимераза, са разположени преди стартовата точка. Промоторите за РНК полимераза III са уникални с това, че обикновено са след стартовата точка, в рамките на кодиращия участък от гена. Известни са две строго консервативни секвенции А и В в интрагенния промотор, които кодират участъци в областта на D и ТЦ бримки.

 Промоторите, разпознавани от РНК полимераза II, съдържат два класа участъци (фиг. 13-4):

 1) Участъци, осигуряващи основната експресия.

 В голям брой случаи основната експресия зависи от разпознаването и свързването на РНК полимераза към следните олигонуклеотидни блокове в промотора:

  а) проксимален ТАТА-блок, чието разпознаване осигурява верността на транскрипцията. Винаги има ориентация 5'-3'. Обикновено отстои на 15-30 bp преди стартовата точка.

 В малък брой гени вместо ТАТА-блок има друг блок със същата роля, означаван като Inr (iniciator), който съдържа три нуклеотида преди и пет нуклеотида след стартовото място.

  б) ЦААТ-блок (или други подобни, означавани Sp1, NF1, Ap1 и др), по-отдалечен от старта в минусова посока и определящ честотата на транскрипция. Тези участъци работят най-добре, когато са ориентирани 5'-3', но могат да имат и обратна ориентация.

 2) Участъци, осигуряващи регулираната експресия

 Регулираната експресия зависи от втори клас регулаторни участъци, съдържащи други олигонуклеотидни блокове, с различна ориентация и различно отдалечени преди или след стартовата точка, наречени енхансери и силансери. Тe медиират ефекта на различни сигнали (хормони, топлинен шок, тежки метали и др.).



Фиг. 13-4. Примерна структура на промотор за иРНК в еукариотни клетки.

 Промоторът се състои от два класа участъци:

 1) Участъци, отговорни за основната експресия, съдържащи ТАТА- и ЦААТ-блокове. Разпознаването на ТАТА-блока осигурява верността на транскрипцията. Разпознаването на ЦААТ-блока определя честотата на транскрипция.

 2) Участъци, осигуряващи регулираната експресия, съдържащи други олигонуклеотидни блокове (енхансери, силансери и др.) с различна ориентация и различно отдалечени преди или след стартовата точка, медииращи ефекта на хормони, топлинен шок, тежки метали и др. За тези многобройни и специфични блокове се използва и названието "респонсни елементи" (response element"), напр. СХ-РЕ - респонсен елемент за стероидни хормони, цАМФ-РЕ - респонсен елемент за цАМФ и пр.


13.4.4 Транскрипционен комплекс в еукариоти

 За осигуряване на безпогрешна и регулируема транскрипция в еукариоти РНК полимеразите се нуждаят от голям брой белтъци (около 50 на брой). Без тях РНК полимерази не разпознават промоторите. Едни от белтъците улесняват свързването към определен промотор, а други са необходими за регулиране скоростта на иницииране на транскрипцията.

  Основният комплекс (фиг. 13-5) се образува при свързване на РНК полимераза с промотора посредством белтъци, означавани като транскрипционни фактори ТF.







Фиг. 13-5. Структура на основния транскрипционен комплекс в еукариоти.

 Основният комплекс се образува при свързване на РНК полимераза с промотора посредством белтъци, означавани като транскрипционни фактори ТFII(D, B, A, F, H, E). Единствено ТFII D контактува директно с ДНК в ТАТА-участъка. TFII D се състои от ТАТА-свързващ белтък (ТВР) и 8-10 различни ТВР-асоциирани фактори (ТАFs, наричани още коактиватори, тъй като те подпомагат други белтъци активатори).

 Известни са следните ТF за РНК полимераза II (TFII):

1) TFII D - състои се от ТАТА-свързващ белтък (ТВР) и 8-10 различни ТВР-асоциирани фактори (ТАFs, наричани още коактиватори, тъй като те подпомагат други белтъци активатори). TFII D е единственият ТFII, контактуващ директно с ДНК в ТАТА-участъка.

2) други транскрипционни фактори по реда на тяхното добавяне:

 - TFII В (стабилизира комплекса, който се ориентира по-прецизно в иниициращото място)

 - TFII F (съответства структурно и функционално на  фактора в прокариоти).

 - TFII А (стабилизира комплекса и позволява взаимодействие с активатори).

 - TFII Е (усилва киназната активност на TFII Н.

 -  TFII Н (има киназна активност).

 С добавянето на тези TFII се оформя основният, наричан още преинициационен комплекс (PIC). Размерите му са такива, че той обхваща или покрива около 60 bp (от -30 до +30 спрямо стартовата точка. Този комплекс осъществява основна транскрипция.

13.4.5 Енхансери и силансери в еукариотна ДНК

 Тук спадат участъци, които медиират ефекта на различни сигнали (хормони, топлинен шок, тежки метали и други вещества). Всички тези участъци поради отдалечеността си не контактуват директно с основния комплекс. Те упражняват своя ефект чрез свързване на белтъци (транскрипционни трансактиватори), които пък се свързват с коактиваторите от основния комплекс и увеличават честотата на транскрипция. Сложните взаимодействия на отдалечените контролиращи елементи с основния комплекс, опосредени чрез транскрипционните трансактиватори и коактиватори са възможни поради възникване на огъвания в ДНК.

 Има два модела за образуване на активен инициационен комплекс (фиг. 13-6):

 Според единия модел предварително се образува основният комплекс върху ТАТА-участъка в промотора и след това към TAF коактиваторите се свързват транскрипционни трансактиватори, свързани от друга страна с отдалечени елементи в ДНК, напр. ЦААТ. Огъване в ДНК осигурява тези взаимодействия (фиг. 13-6-1).

 Според другия модел транскрипционните трансактиватори се свързват с отдалечени елементи в ДНК, напр. ЦААТ, и взаимодействат с кофактори от предварително оформен ТВР-основен комплекс, несвързан с ДНК. Новополученият комплекс се прикрепя към ДНК в ТАТА-участъка (фиг. 13-6-2).

 
 






Фиг. 13-6. Два модела за образуване на активен инициационен комплекс в еукариоти.

 1 - Предварително образуване на основен комплекс върху ТАТА-участък в промотора и последващо взаимодействие на трансактиватори, свързани с отдалечения ЦААТ елемент към TAF коактиватори от основния комплекс. Огъването на ДНК прави възможно взаимодействието на отдалечени елементи;

 2 - Транскрипционните трансактиватори се свързват с отдалечени елементи в ДНК, напр. ЦААТ, и взаимодействат с кофактори от предварително оформен ТВР-основен комплекс, несвързан с ДНК. Новополученият комплекс се прикрепя към ДНК в ТАТА-участъка.

13.5 Елонгиране

 Елонгирането се свежда до последователно присъединяване на рибонуклеотиди в посока от 5' към 3'-края, комплементарни на тези от ДНК матрицата (фиг. 13-7). Двойната спирала на ДНК веригата се развива и разтваря на около 20 bp непосредствено преди елонгационния комплекс. Това предполага, че полимеразата действа съвместно с разсукващ ензим. След отминаването на РНК полимеразата, ДНК се затваря. Топоизомераза, следваща полимеразата, предпазва от суперспирализиране. Една и съща матрична верига на даден ген едновременно в различни негови участъци може да се транскрибира от повече от една полимеразна молекула.

 Елонгирането продължава до достигане на сигнал за терминиране.





Фиг. 13-7. Елонгиране на веригата при транскрипция на РНК. Двете вериги на ДНК са разединени. Информацията се чете от матричната верига на ДНК в посока 3' към 5'-края. РНК веригата нараства в посока 5' към 3'-края. РНК е комплементарна и антипаралелна на матричната верига, но идентична с кодиращата верига на ДНК с тази разлика, че срещу А от матрицата в РНК се включва У. РНК полимеразата катализира образуването на 3', 5'-фосфодиестерна връзка чрез прикрепване на 5'-ОН група на идващия нуклеотид към 3'-ОН група на нарастващата верига с освобождаване на пирофосфат.

13.6 Терминиране

 В прокариоти има два начина за прекратяване на транскрипцията: зависимо от белтъчния -фактор терминиране и независимо от -фактор терминиране.

 1) Зависимо от белтъчния -фактор терминиране

 Сигналите за терминиране включват около 80 нуклеотиди преди мястото за спиране. Характерно е наличие на Ц през 12 нуклеотиди.-Факторът е АТФ-зависима ДНК-РНК хеликаза, която разделя ДНК-РНК комплекса. Новополучената РНК се отделя. РНК полимеразата се отделя от ДНК матрицата и може отново да присъедини  фактор за започване на нов транскрипционен цикъл.

 2) Независимо от белтъчния -фактор терминиране

 Сигналите за терминиране се разпознават от РНК полимеразата. Това са консервативни последователности (около 40 bp) в ДНК, съдържащи прекъснат обърнат повтор. Този повтор е богат на Г и Ц бази и предхожда участък, богат на АТ двойки. Първичният транскрипт има структура, позволяваща образуване на фуркетна бримка с по-здрави водородни връзки между Г и Ц. След тази бримка следва участък, богат на урацил. Водородните връзки между базите А в ДНК и У в РНК по-лесно се разкъсват и това води до отделяне на транскрипта от ДНК.

 В еукариоти РНК полимераза I прекратява транскрипцията с помощта на фактор, подобен на  фактора. Не се знае как полимераза III прекратява транскипцията. Известно е, че РНК полимераза II преминава 3'-края на транскрипта. Повечето гени се транскрибират няколко хиляди bp след точката на полиаденилиране. След това РНК ендонуклеаза разкъсва първичния транскрипт в позиция 15 бази преди консенсусна последователност ААУАААА, смятана като сигнал за разкъсване.


13.7 Зреене (следсинтетична обработка) на РНК транскриптите

 Зреенето на РНК предшествениците в еукариоти за всички видове РНК протича предимно в ядрото и е по-сложен процес отколкото при прокариоти.

13.7.1 Зреене на РНК транскрипти в прокариоти

 В прокариоти, където липсва ядро, получените иРНК не се обработват. Те се използват като матрици за белтъчна биосинтеза дори преди да е завършена транскрипцията. Транскрипцията и транслацията в прокариоти не са пространствено разделени.

 Транскриптите (предшествениците) на рРНК и тРНК се обработват до получаване на зрели РНК. Рибозомните РНК 16S рРНК, 23S рРНК, 5S рРНК и някои тРНК се получават от общ 30S предшественик, като ендонуклеази изрязват ненужните разделящи (спейсерни) последователности между тях. Останалите тРНК се получават от други тРНК транскрипти, съдържащи от 2 до 7 тРНК.


13.7.2 Зреене на рРНК транскрипти в еукариоти

 В еукариоти рРНК се обработват по подобен начин, както в прокариоти.

 Три от рРНК (18S рРНК, 28S рРНК и 5.8S рРНК) се получават от общ 45S предшественик (фиг. 13-8). Гените за рРНК са в ядърцето. Във всяка клетка има стотици техни копия. Този голям брой от еднакви гени е необходим, за да се синтезират достатъчно рРНК от всеки вид за образуване на 107 рибозоми във всяка новополучена клетка. Полученият 45S предшественик при отделянето си от ДНК се свързва с белтъци и образува рибонуклеопротеинова частица. Към нея се присъединява и 5S рРНК, получена извън ядърцето от друг ген. Последователностите в 45S предшественика, които ще се превърнат в зрели рРНК, се метилират преди изрязване на ненужните разделящи участъци със специфични ендонуклеази и екзонуклеази. Под тяхното действие се стига до 28S, 5.8S и 18S рРНК.

 5.8S РНК се свързва комплементарно и антипаралелно с участък от 28 S рРНК. Комплексът от 28S рРНК, 5,8S рРНК и 5S рРНК с около 50 рибозомни белтъци оформя голямата субединица на рибозомата (60S). Комплексът от 18S рРНК с около 40 рибозомни белтъци оформя малката субединица на рибозомата (40S).

 
 








Фиг. 13-8. Следсинтетична обработка на рРНК в ядърцето и изнасяне на рибонуклеопротеиновите комплекси, които в цитоплазмата образуват двете субединици (40S и 60S на рибозомата (80S).

13.7.3 Зреене на тРНК транскрипти в еукариоти

 Всеки тРНК предшественик съдържа от 2 до 7 тРНК. Специфични рибонуклеази изрязват отделни тРНК предшественици с дължина около 100 нуклеотиди от общия транскрипт, които оформят структура от типа "детелинов лист" (вж глава 3) и биват скъсявани в двата края от екзонуклеази. Някои предшественици съдържат един интрон (10-40 bp) близо до антикодонната бримка. Това налага изрязването му чрез ендонуклеази и правилното съединяване на веригата в областта на антикодонната бримка чрез РНК лигаза. Някои тРНК не съдържат ЦЦА-триплет в 3'-края и той се добавя от тРНК нуклеотидил трансфераза. Част от базите се модифицират, което е необходимо за придобиване на уникална конформация, необходима за тяхната функция. Модифицирането включва метилиране, редукция, дезаминиране и преместване на гликозидни връзки за превръщане на уридин в псевдоуридин.

13.7.4 Зреене на иРНК предшественици в еукариоти

Еукариотните иРНК предшественици са с много по-високо молекулно тегло от зрелите иРНК. Те претърпяват следните операции в процеса на зреене в ядрото:

13.7.4.1 Добавяне на т.н. шапка (вж глава 3)

Някои шапки се състоят само от от 7-метилгуанозин трифосфат, добавен към 5'-края на предшественика чрез 5'-5'-трифосфатна връзка, други имат и допълнителна 2'-метилова група в рибозата на първия нуклеотид в предшественика или още една такава група в рибозата на втория нуклеотид. Шапката е необходима за иницииране на белтъчната биосинтеза и защита на 5'-края на иРНК от 5'-->3'-екзонуклеази.

13.7.4.2 Добавяне на полиаденилова "опашка" в 3'-края (полиА)

Тези "опашки" съдържат 200-300 аденилови нуклеотиди, свързани чрез фосфодиестерни връзки. Предполага се, че "опашката" защитава 3'-края на иРНК от 3'-->5'-екзонуклеази и увеличава стабилността на иРНК. В цитоплазмата опашката бавно се скъсява. Към опашката е прикрепен 78 kDa белтък. Когато опашката намалее дотолкова, че този белтък не може да се задържа повече върху нея, той се отделя и тогава опашката и иРНК се разграждат бързо.

13.7.4.3 Отстраняване на междинни некодиращи последователности (интрони) в гените (сплайсинг)

 В иРНК-предшествениците има екзони (кодиращи последователности за белтъци), които са разпръснати и разделени от интрони (междинни некодиращи последователности). Думата екзон е съкращение от израза "expressed portion of the gene". Отстраняването на интроните и прецизното съединяване на екзоните се нарича сплайсинг (splicing = снаждане) (фиг. 13-9).




Фиг. 13-9. Принцип на механизма за следсинтетична обработка на предшествениците на иРНК чрез сплайсинг (отстраняване на интроните и снаждане на екзоните).

 Различните гени съдържат различен брой интрони - напр. само 2 в -глобиновия ген, но 50 и повече в други белтъци. Известни са консервативни последователности на границата между екзоните и интроните в иРНК предшествениците - обикновено AGGU. Почти всички известни интрони започват с 5'-ГУ и завършват с 3'-АГ (фиг. 13-10).

 Освен това в интрона има друг консервативен участък, наречен разклоняващо място. То е разположено 20-40 нуклеотида преди 3'-края на интрона. В дрожди този участък съдържа УАЦУААЦ, а в бозайници ПиНПиПиПуAПи, където Пи е пиримидинов, Пу - пуринов и Н - кой да е нуклеотид (фиг. 13-10).



Фиг. 13-10. Консервативни последователности на границите между екзони и интрон и в разклоняващото място в интрона ПиНПиПиПуAПи в бозайници, където Пи е пиримидинов, Пу - пуринов и Н - кой да е нуклеотид.

 Структурата, която осигурява снаждане на интроните с голяма точност, се нарича сплайсозома (50-60S). Тя съдържа предшественика на иРНК и 5 малки ядрени рибонуклеопротеини (snRNР, наричани още "snurps") U1, U2, U5, U4-U6. Тези "snurps" съдържат над 50 различни белтъци, а буквата U идва от това, че малките ядрени РНК в тях са богати на урацил. АТФ доставя енергия за точното снаждане.

 Тези малки ядрени рибонуклеопротеини действат като рибозими - разпознават консервативните последователности в интроните, срязват последователно 5'-края и 3'-края на интрона и сближават екзоните за безпогрешно снаждане (фиг. 13-11).

 В този сложен процес U6 действа като централен организатор и молекулярен посредник. Чрез комплементарни взаимодействия U1 се свързва към ГУ в 5'-края на интрона, а U2 в разклоняващото място. U5 благоприятства сближаването на 5'-края, разклоняващото място и 3'-края на интрона, което води до огъване на интрона. U4 се отделя. Предполага се, че двете скъсвания в 5'-края и 3'-края на интрона се катализират от комплекса U2-U6.

 Първо се срязва фосфодиестерната връзка между екзон 1 и интрона. Освобождават се 3'-OH група на екзон 1 и 5'-ОН на интрона. Последната образува необичайна 2'-5'-връзка с А в разклоняващото място, огъвайки интрона като ласо. 3'-ОН група на екзон 1 атакува и разкъсва връзката между интрона и екзон 2, след което екзон 1 и екзон 2 се съединяват. Отделеният интрон се разгражда.

 Ролята на U6 като централен организатор личи от факта, че дрожди с дефект във U6 са нежизнеспособни.








Фиг. 13-11. Следсинтетична обработка на предшественици на иРНК (сплайсинг).

13.7.5 Посттранскрипционно редактиране на иРНК

 Пример за промяна в секвенцията на иРНК след приключване на транскрицията дават аполипопротеини В100 (интегрален белтък в ЛПМНП) и В48 в хиломикроните. АпоВ100 (4536 аминокиселинни остатъка) се синтезира в черния дроб, като генът се експресира 100 %. Същата иРНК се използва в червата, но под действие на цитидин дезаминаза триплетът ЦАА (кодиращ Глн) се превръща в УАА (стоп сигнал) и се получава верига, дълга 48 % от тази в черния дроб.

13.8 Приложение на познанията върху синтеза на РНК в медицината

13.8.1 Инхибитори на РНК синтезата - антибиотици и токсини

 Значението на РНК полимераза за живота се демонстрира от последствията, които се проявяват при нейното инхибиране от антибиотици или токсини .

 Инхибиторите на РНК синтезата са вещества, които се свързват с ДНК или към РНК полимераза. Тези от тях, които инхибират бактериална РНК полимераза, но не засягат синтезата на РНК в еукариоти, се използват като антибиотици.

 Актиномицин D има феноксазинов пръстен, който се вмъква между базите в ДНК и пречи както на репликацията (фиг. 12-16), така и на транскрипцията. Твърде токсичен е за клинична употреба, но се използва експериментално за изучаване на РНК синтезата.

 Рифамицин В и рифампицин (фиг. 13-12) се свързват към бактериална РНК полимераза и пречат на иницииране на транскрипцията на РНК, но не спира елонгирането на вече започнати вериги. Особено важно, е че рифампицин, изолиран от Streptomyces, инхибира РНК полимераза от Mycobacterium tuberculosis, който не е чувствителен към голям брой други често използвани антибиотици [2]. Поради различията между бактериална и човешка РНК полимераза този антибиотик няма висока токсичност за човека. Наред с антиметаболита ниазид, рифампицинът допринася за снижаване на смъртността от туберкулоза в развитите страни. Все още обаче в много страни има ендемични огнища. Особено лесно податливи на тази инфекция са болни от СПИН.

 Стрептолидигин също се свързва към бактериална РНК полимераза, но инхибира елонгирането на РНК вериги.

 Токсинът -аманитин от смъртоносно отровната гъба червена мухоморка (Amanita phalloides) инхибира РНК полимерази II и III от бозайници (вж табл. 13-1) и причинява необратими увреждания на черния дроб и бъбреците [3]. Отравянето протича в два етапа: първоначално има само относително меки гастро-интестинални симптоми. След 48 часа се проявява пълна чернодробна недостатъчност, тъй като важни РНК и кодирани от тях белтъци, се разграждат, а нови не се синтезират.






Фиг. 13-12. Структура на рифамицин В и рифампин, инхибитори на синтезата на РНК.

13.8.2 Алтернативен сплайсинг на иРНК при -таласемии

 В различни тъкани или в различни периоди на развитието сплайсингът може да се извърши по различен начин (алтернативен сплайсинг) и да се получат различни иРНК. Това е един от начините за регулация на генната експресия в клетката. Участието на голям брой белтъци и мяРНК в този процес и неговата многостъпалност позволяват промяна в структурата на РНК. С грешки в сплайсинга се обяснява -таласемия, при която не се образуват нормални -вериги в хемоглобин [4]. Промяна в нуклеотида Г в А на границата между екзон и интрон не позволява отстраняването на интрона и обърква рамката на четене на иРНК при белтъчната синтеза.

13.8.3 Чуплива Х-хромозома

 Заболяването "чуплива Х-хромозома", с честота 1/1250 при мъже и 1/200 при жени, се характеризира с умствено изоставане [5, 6]. Неврологичните симптоми са следствие от инактивиране на гена FMR1, разположен в Х-хромозомата. В 5'-нетранскрибиращия се край на този ген нормално има от около 30 до 200 повтори ЦГГ. В пациенти с това заболяване повторите са много повече - 200 до хиляди, като броят се увеличава от поколение на поколение.

 Наличието на този висок брой повтори индуцира метилиране на ДНК в целия промотор на гена FMR1, а метилираната ДНК е транскрипционно неактивна. Не се синтезира иРНК за FMR1-белтъка. Отсъствието на този белтък е причина за патологичните прояви. FMR1-белтъкът се намира нормално в цитоплазмата на всички тъкани на плода и по-късно, в мозъка му. Смята се, че това е РНК-свързващ белтък, който помага в транслацията на специфични белтъци по време на развитието.


13.9 Материали за самостоятелна работа

 Запознайте се с дискусията върху клиничен случай с Lupus erythematosus в литературните източници [7-10].

13.10 Литература

 1. Murray, R., D. Granner, P. Mayes, V. Rodwell (2000) Harper's Biochemistry, Prentice-Hall International, Inc., Twenty-Fifth Edition, London, RNA synthesis, processing and modification, p. 435-451.

 2. A. G. Gilman, T. W. Rall, A. S. Nies and P. Taylor, eds. The pharmacological basis of Therapeutics, 8th edn, New York, Pergamon Press, 1990, 129-130.

 3. D. H. Mitchel. Ann. Rev. Med. 31, 1980, 51. Amanita mushroom poisoning.

 4. C. R. Scriver et al. The metabolic and molecular bases of inherited disease, vol. III, 1995, 3456-3457, New York, McGrow-Hill.

 5. S. L. Waren, D. L. Nelson. JAMA 271, 1994, 536. Advances in molecular analysis of Fragile X-syndrome.

 6. C. T. Caskey, Science 256, 1992, 784. Triple repeat mutations in human disease.

 7. R. Montgomery, T. W. Conway, A. A. Spector, D. Chappell. Biochemistry. A Case-Oriented Approach. St. Louis, 1996, p. 522-523. Case 2. Systemic lupus erythematosus.

 8. K. B. Elton et al. Antiribosomal antibodies in SLE, infection, and following deliberate immunization. In M. Z. Atassi, ed.: Immunobiology of proteins and peptides. VII. Unwanted immune responses, New York, 1994, Plenum Press.



 9. J. A. Mills. N. Engl. J. Med. 330, 1994, 1871. Systemic lupus erythematosus.

 10. J. A. Steitz. Sci. Am. 258 (6), 1988, 56. "Snurps".
Каталог: wp-content -> uploads -> 2016
2016 -> Цдг №3 „Пролет Списък на приетите деца
2016 -> Българска федерация по тенис на маса „В”-1” рг мъже – Югоизточна България мъже временно класиране
2016 -> Национален кръг на олимпиадата по физика 05. 04. 2016 г., гр. Ловеч Възрастова група клас
2016 -> Българска федерация по тенис на маса „А” рг мъже – Южна България мъже временно класиране
2016 -> Конкурс за изписване на великденски яйце по традиционната техника съвместно с одк велинград 27 април
2016 -> Министерство на образованието и науката регионален инспекторат по образованието – софия-град


Сподели с приятели:




©obuch.info 2024
отнасят до администрацията

    Начална страница