Специализиран научен съвет по ветеринарна медицина при вак
Изтегляне 483.93 Kb.
|
- Навигация на страницата:
- II .2.1. 7.
- II .2.1. 8.
- Острата токсичност (LD 50 )
- Броя на еритроцитите
- WBC, Lym., Mon., Gra., Hb, RBC, Hct, MCV, MCH, MCHC, RDW, THR, MPV, Pct, PDW.
- L – аспартат 2-оксоглутарат-аминотрансфераза ( ASAT ) в кръвната плазма
- Кръвната захар в кръвната плазма
- Уреята в кръвната плазма
- Патологоморфологични изследвания
- III.1. Изследване за остра токсичност ( LD 50 ) на ЖКМ при бели мишки.
- III.2. Изследване върху субхроничната токсичност (30 дни) и поносимост на ЖКМ при анемизирани бели плъхове
- III.3. Изследване бионаличността на ЖКМ при 32-дневни прасета
- III.4. Изследване влиянието (тестване) на различни дози ЖКМ върху някои хематологични показатели в кръвта и депониране на желязото в черния дроб при анемизирани бели плъхове ;
- III.5. Депониране и антианемично действие на ЖКМ, сравнително с железен сулфат при анемизирани бели плъхове.
- III.6. Депониране и антианемично действие на ЖКМ, сравнително с референтен продукт при анемизирани бели плъхове.
II.2.1.6. За определяне депонирането и антианемичното действие на ЖКМ, сравнително с референтен продукт при анемизирани бели плъхове бяха използвани 17 животни ( Wistar ), с тегло от 100 до 150 g, разделени в 3 групи, които в продължение на 30 дни получаваха царевично брашно с добавка на ЖКМ и METH-IRON 65 съответно: I група – третирани с ЖКМ в дозировка 500 ppm ; II група – третирани с METH-IRON 65 в дозировка 500 ppm ; III група – контролна ( без добавка на ЖКМ ) ; II.2.1.7. При проучване на възможностите за профилактика на желязодефицитната анемия при новородените прасета с помощта на ЖКМ бяха използвани 32 прасета от 3 свине-майки, хибрид Кембъроу, с възраст до 72 часа, със средно тегло 1593 g, разделени в 3 групи и третирани както следва: I група ( 13 броя ) бяха третирани перорално ЖКМ в доза 1 g дневно ( = 140 mg Fe 2+ ) в продължение на 3 дни ( обща доза 420 mg Fe 2+ ) под формата на водна суспензия, дадена с мерителна лъжица ; II група ( 13 броя ) бяха инжектирани еднократно мускулно, в бедрената област, с Феродекстран – 100 ( Alvetra GmbH, Австрия ), в доза 1,5 ml ( = 150 mg Fe 3+ ) ;
I група – третирани с 500 ppm ; II група – третирани с 1000 ppm ; III група – контролна ( без добавка на ЖКМ ) ; II. 2. 2. ЛАБОРАТОРНИ МЕТОДИ НА РАБОТА
II.2.2.2. Хемоглобина определяхме с Реактив на Драбкин по цианметхемоглобиновия метод с тест на “Биомед” – София. II.2.2.3. Хематокрита бе определян чрез директен микрометод. Използваха се микрохематокритни хепаринизирани капилярки и специална микрохематокритна центрофуга ( центрофугиране 16 000 g/min в продължение на 5 min ) . II.2.2.4. Броя на еритроцитите в 1 mm 3 кръв определяхме в камерата на Тома, а броят на левкоцитите в камерата на Бюркер. II.2.2.5. Броя на ретикулоцитите определяхме по метода на Хайлмайер. II.2.2.6. Кръвните проби от опити IV.4.1. и IV.4.2. бяха изследвани чрез автоматични хематологични анализатори BC – 3000 plus Mindray ( Благоевград ) и MS 4 vet ( НДНИВМИ, София ) за следните показатели : WBC, Lym., Mon., Gra., Hb, RBC, Hct, MCV, MCH, MCHC, RDW, THR, MPV, Pct, PDW. II.2.2.7. L – аланин 2-оксоглутарат-аминотрансферазата ( ALAT ) в кръвната плазма определяхме с реактиви на фирма HǗMAN по UV тест, според IFCC, чрез полуавтоматичен биохимичен анализатор Clima plus – Spain ( RAL Tecnica para el Laboratorio SA ). II.2.2.8. L – аспартат 2-оксоглутарат-аминотрансфераза ( ASAT ) в кръвната плазма определяхме с реактиви на фирма HǗMAN по UV тест, според IFCC, чрез полуавтоматичен биохимичен анализатор Clima plus – Spain ( RAL Tecnica para el Laboratorio SA ). II.2.2.9. Кръвната захар в кръвната плазма определяхме с реактиви на фирма HǗMAN по ензимно-колориметричен метод ( GOD – PAP ), чрез полуавтоматичен биохимичен анализатор Clima plus – Spain ( RAL Tecnica para el Laboratorio SA ). II.2.2.10. Уреята в кръвната плазма определяхме с реактиви на фирма HǗMAN, по ензимен колориметричен тест, чрез полуавтоматичен биохимичен анализатор Clima plus – Spain ( RAL Tecnica para el Laboratorio SA ).
II.2.2.11. Патологоморфологични изследвания 3. На умрелите в резултат на острите опити бели мишки, както и на декапитираните след края на субхроничния опит животни бе направена пълна аутопсия. Органите, предназначени за патохистологични изследвания бяха фиксирани в 10 % буфериран формалин с рН 7, включени в парафин, нарязани на срези с дебелина 5 μm и оцветени с хематоксилин – еозин, с берлинско синьо по метода на Perls (модификация по Gomori), и реактива на Шиф (по Hotchiss, McManus, Lillie), съгласно рутинната хистологична техника. Хистологичните препарати бяха изследвани и при преминаваща светлина на NU – 2 микроскоп ________
Пробите от опити II.2.1.3., II.2.1.4., II.2.1.5 и II.2.1.8 за съдържание на желязото в черен дроб, слезка, коластра и кръвна плазма определяхме чрез пламъков вариант на атомно-абсорбционен спектрометър Karl Zeiss Jena ( AAS 30 ) при дължина на вълната – 248,3 nm ( с помощта на Г.Стоянова и Д.Данева – ЦНИЛ “Геохимия”, МГУ – София ). Пробите от опит II.2.1.2 за съдържание на желязото в черен дроб определяхме чрез Атомно-емисионен спектрофотометър ICP-AES ( Varian ) Vista MPX Simultaineous, с източник на възбуждане индуктивно свързана плазма при дължина на вълната 248,3 nm ( с помощта на Г.Стоянова и Д.Данева – ЦНИЛ “Геохимия”, МГУ-София ). Предварително всички проби минерализирахме мокро със смес от азотна и перхлорна киселина при специална температурна програма. Статистическа обработка на резултатите бе извършена с помощта на програма за статистическа обработка StatMost 2.5 ( 1995 )( Datamost Europe, AS ). Разликите бяха статистически оценени чрез анализ на вариациите ( ANOVA ). Разлики с р < 0,05 бяха приети за статистически достоверни. Данните за кинетиката на концентрациите на желязото в кръвната плазма бяха обработени вариационностатистически. Анализът бе извършен с помощта на компютърна програма (Statistica for Windows, StatSoft Inc., USA, 2002). Статистическата достоверност на разликите, в стойностите на желязото в кръвната плазма преди и след третирането на опитните групи, бе определена чрез непараметричния тест на Wilcoxon при ниво на значимост P<0,05. Резултатите са представени като средни стойности и техните стандартни отклонения (mean±SD).
Използвана бе специализираната компютърна програма WinNonlin Professional 4.0.1 ( Pharsight Corporation, 800 West El Camino Real, Mountain View, CA, USA) (Riviere, 1999), ( с помощта на проф.д-р Д.Пашов и гл.ас.д-р И.Канелов – Тракийски университет, Стара Загора ). III. РЕЗУЛТАТИ И ОБСЪЖДАНЕ III.1. Изследване за остра токсичност ( LD 50 ) на ЖКМ при бели мишки. Опитните мишки са третирани перорално, като са включени 7 дози – от 2000 mg/kg м. до 5000 mg/kg м., с интервали от 500 mg/kg м. (табл.1). При опитната група, третирана с доза 2000 mg/kg м. не бяха регистрирани съществени промени в общото състояние и поведението на мишките. Първите симптоми на интоксикация при мишките от II и III група се наблюдаваха след 2 часа от приложението на продукта и се изразяваха в умърлушеност, безпокойство и слаба възбуда; парализа на задните крайници бе наблюдавана при 2 мишки от III група ( доза 3000 mg/kg м.). Между 3-ия и 4-ия час от третирането, две мишки съответно от II и от III група завършиха летално, а при останалите след 1-ия час се наблюдаваше отслабване на клиничните признаци, които се наблюдаваха с намаляваща интензивност до 3-ия час от третирането. При групите с по-високи дози, на 1-ия час след третирането на животните бяха наблюдавани признаци на интоксикация. Клиничната картина се изразяваше в намалена двигателна активност, възбуда, продължаваща около 10 min, следвани от депресия и учестено дишане. Наблюдаваха се клонично-тонични конвулсии, по-добре изразени при мишките от VI и VII група ( 4500 и 5000 mg/kg м. ). Два часа след приложението на продукта бе наблюдавана смърт при всички животни от VII група. Преживелите от интоксикацията мишки се възстановяваха напълно до 5-ия – 7-ия ден от прилагането на ЖКМ. При нашите изследвания, с експерименталния железен комплекс на метионина ( ЖКМ ) бе установено, че относителните летални дози за бели женски мишки при перорално прилагане са : LD16 - 2700 mg /kg м. (= 378 mg Fe/kg м.), и LD84 - 4400 mg /kg м. ( 616 mg Fe/kg м.). Въз основа на проведените изследвания бе определена средната летална доза ( LD50 ) 3450 ( 2920÷4071 ) mg / kg м. (= 483 mg Fe/kg м. ) при р = 0,05, което определя продукта като ниско токсичен. Съгласно класификацията на Hodge-Sterner, както и по други класификации1 ЖКМ се отнася към групата на малко токсичните вещества. Според по-новата класификация за оралната токсичност на химикалите GHS ( Globally Harmonized Sistem ) изпитваният от нас продукт ЖКМ се отнася към групата на нетоксичните вещества - LD50 2000-5000 mg / kg м. ( Environmental Protection Agency, 2004 ). Таблица 1. Данни от изследванията за остра токсичност на ЖКМ при бели мишки
Патохистологични изследвания: При патохистологичните изследвания на черните дробове от опитните и контролни бели мишки, не се установиха видими изменения. При оцветяванията по Перлс се доказа, че желязото е дифузно разпределено из паренхима на вътрешните органи. В пробите от контролните животни не се откри реактивно желязо. III.2. Изследване върху субхроничната токсичност (30 дни) и поносимост на ЖКМ при анемизирани бели плъхове Данните от промените в теглото на опитните и контролни животни са представени на фиг. 2 ( стр.17 ). При всичките групи преди третирането плъховете бяха почти изравнени по телесно тегло – стойностите варираха между 124,1 и 125,8 g. От таблицата се вижда, че телесната маса се повлиява най-благоприятно при плъховете от втора група, получавали към храната ЖКМ в дозировка 500 ppm. Най-ясно това е установено на 30-ия ден след третирането – средната телесна маса достига до 235 g, докато при контролните плъхове същата е 166,6 g ( р < 0,05 ). Подобна тенденция се наблюдаваше и при резултатите от хематологичните изследвания, получени на 30-ия ден след третирането – най-високи стойности на хемоглобин 115,3 ± 4,83 g/l ( р < 0,001 ), хематокрит 42,6 ± 0,33 l/l ( р < 0,05 ) и брой на еритроцити 8,7 ± 0,04 T/l кръв ( р > 0,05 ) бяха установени при II група, получавала към дажбата ЖКМ в дозировка 500 ppm; при I, III и IV групи стойностите бяха по-ниски. При проучване на субхроничната токсичност на ЖКМ, по време на 30-дневния период на изследване нито едно животно и от 5-те групи не прояви клинични признаци на интоксикация. Наблюдавано бе, че плъховете от четвърта група, във царевичното брашно на които бе добавяно ЖКМ в концентрация 2500 ppm, изяждаха по-бавно дневната си дажба, силно изразено през последните 10 дни на опита. При животните от останалите групи не бе наблюдавана разлика в апетита и поведението им. Изследванията при плъховете показаха още, че при перорално третиране ( посредством храната ) с ЖКМ в продължение на 30 дни, включително във високите дозировки ( 1500 ppm и 2500 ppm ), не се наблюдаваха прояви на обща непоносимост - намаляване на апетита, промени в реактивността и др. По време на експерименталния период плъховете приемаха с апетит храната, не бяха наблюдавани смущения в дишането, телесната температура и поведенческите реакции. Активността на двете аминотрансферази ( ASAT и ALAT ) в кръвната плазма при опитните и контролни плъхове по време на опита бе в норма и варираше за ASAT от 0,475 µkat/l до 0,658 µkat/l ( при норма 0,457 – 0,808 µkat/l ), а за ALAT от 0,241 µkat/l до 0,341 µkat/l ( при норма 0,200 – 0,400 µkat/l ). Резултатите показват, че ЖКМ в дозировка 500 ppm, благоприятства в по-висока степен депонирането на желязо в организма на плъховете, в сравнение с ЖКМ в дозировки 100 ppm, 1500 ppm и 2500 ppm. В литературта не намерихме данни относно субхроничната токсичност на железни хелати при животни, с изключение на продукта Ferrochel. При изследване на субхроничната му токсичност при бели плъхове, даван с дажбата в дозировки 100, 250 и 500 mg/ kg м. ( според изискванията на US-FDA ), в продължение на 90 дни, не е установена смъртност при нито една от групите ( Jeppsen, 2001 ). Авторът не е наблюдавал патологоанатомични и хистологични промени при опитните плъхове, и приема, че NOEL за женски и мъжки бели плъхове е 500 mg/ kg м. На фиг. 1 и 2 представяме графично някои от показателите при които са наблюдавани най-значими промени ( Hb и тегло ). 
Фиг. 1. Промени в стойностите на хемоглобина в кръвта на бели плъхове, третирани p.o. с ЖКМ в дозировки съответно 100 ppm ( I група ), 500 ppm ( II група ), 1500 ppm ( III група ), 2500 ppm ( IVгрупа ) и V група контролна ( нетретирана ). 
Фиг. 2. Промени в стойностите на телесната маса на плъхове третирани p.o. с ЖКМ в дозировки съответно 100 ppm ( I група ), 500 ppm ( IIгрупа ), 1500 ppm (III група), 2500 ppm (IV група ) и V група контролна ( нетретирана ). III.3. Изследване бионаличността на ЖКМ при 32-дневни прасета Посредством базиращия се на теорията за статистическите моменти некомпартиментен анализ ( Gibaldi, 1984; Martinez, 1998 ) на индивидуалните данни за кръвните концентрации, както при венозното, така и при вътрешното въвеждане, бяха изчислени фармакокинетични параметри, охарактеризиращи „съдбата“ на желязото в организма на опитните прасета. Фиг. 3. Графично представяне (в линейни кординати) кинетиката на концентрациите (μmol/l; mean±SD) на желязото в кръвната плазма при 32-дневни прасета след еднократно прилагане на ЖКМ, в доза 20 mg Fe/kg м. (венозно третиране; n=6) и в доза 50 mg Fe/kg м. (вътрешно въвеждане; n=6) 
Установено бе, че стойностите на желязото бяха над „фона“ при всички животни през 15-часовия период на проследяването им. При интервалите на изследването от 1-ия h до 7-ия h (включително) бяха налице статистически значими разлики (при P<0,05) между средните стойности на плазмените концентрации след вътрешното прилагане на ЖКМ и тези преди третирането. Фиг. 4. Графично представяне (в полулогаритмични кординати) кинетиката на концентрациите (μmol/l; mean±SD) на желязото в кръвната плазма при 32-дневни прасета след еднократно прилагане на ЖКМ, в доза 20 mg Fe/kg м. (венозно третиране; n=6) и в доза 50 mg Fe/kg (вътрешно въвеждане; n=6) 
Във връзка с фармакокинетичната характеристика, основана на некомпартиментния анализ, бяха определени относително неголеми стойности на Vd(area) (обем на разпределение, изчислен въз основа на AUC0) (= 0,2145±0,0068 l/kg) и на Vss (обем на разпределение при стационарно състояние) (= 0,2143±0,0051 l/kg) на желязото след венозно въвеждане на ЖКМ при прасета, в доза 20 mg Fe/kg м. Процесите на елиминиране на желязото от кръвната плазма протичат със сравнително невисока скорост ( = 0,0739±0,004 h-1). Това обуслови 9,41±0,51 h продължителност на биологичния му полуживот (T½). Тази стойност е близка до намерената от Beshara et al. (1999) за времето на полуелиминиране (= 8,3 h) на 52Fe(III) при прасета, инжектирани венозно с Venofer®, смесен с 52Fe(III) hydroxide–sucrose. Нашите изследвания показаха, че бионаличността на ЖКМ при 32-дневни прасета е около 30 %, т.е с около 10 пъти по-голяма, в сравнение с железния сулфат, чиято бионаличност е около 3 % ( Graff, 1970 ). III. 4. Клинико – фармакологични изследвания при лабораторни животни III.4. Изследване влиянието (тестване) на различни дози ЖКМ върху някои хематологични показатели в кръвта и депониране на желязото в черния дроб при анемизирани бели плъхове ; От фигурата се вижда, че телесната маса се повлиява най-благоприятно при плъховете от II-ра и III-та група, получавали ЖКМ в дозировка съответно 500 ppm и 1500 ppm. Най-ясно това е установено на 30-ия ден след третирането – при плъховете от II-ра група средната телесна маса достига до 237 g, при плъховете от III-та група – 210,3 g, докато при контролните плъхове тя е 164,5 g, а при плъховете, третирани в дозировка 2500 ppm – 196,5 g. 
Фиг. 5. Промени в стойностите на телесната маса на плъхове третирани p.o. с ЖКМ в дозировки съответно 100 ppm ( I група ), 500 ppm ( II група ), 1500 ppm ( III група ), 2500 ppm ( IV група ) и V група контролна ( нетретирана ). Същата тенденция бе наблюдавана и по отношение стойностите на хемоглобина и броя на еритроцитите, които са най-високи при плъховете от II-ра и III-та група на 30-ия ден след третирането ( фиг. 6 и фиг. 7 ). 
Фиг. 6. Промени в стойностите на хемоглобина в кръвта на бели плъхове, третирани p.o. с ЖКМ в дозировки съответно 100 ppm (I група), 500 ppm (II група), 1500 ppm ( III група ), 2500 ppm ( IV група ) и V група контролна ( нетретирана ).
Фиг. 7. Промени в броя на еритроцитите в кръвта на бели плъхове, третирани p.o. с ЖКМ в дозировки съответно 100 ppm ( I група ), 500 ppm ( II група ), 1500 ppm ( III група ), 2500 ppm ( IV група ) и V група контролна ( нетретирана ).
опита ). Стойностите на желязото в черен дроб ( свежа тъкан ) на плъховете, третирани с ЖКМ в дозировка 100 ppm бяха 164,1 ppm, при плъховете третирани с 500 ppm – 255,1 ppm, при плъховете третирани с 1500 ppm – 244 ppm и при плъховете третирани с 2500 ppm – 218,1 ppm ( р < 0,05 ) ; при контролните плъхове количеството на желязото в черен дроб бе най-ниско - 141 ppm. Достоверни са разликите за количеството на желязото в черния дроб при плъховете от II, III и IV група (р < 0,05), спрямо плъховете от контролната група. 
Фиг. 8. Съдържание на желязо ( ppm ) в черен дроб на плъхове, третирани p.o. с ЖКМ в различни дозировки – I група-100 ppm, II група-500 ppm, III група-1500 ppm, IV група-2500 ppm и V група контролна ( нетретирана ). Данните от нашите проучвания показват, че добавянето на ЖКМ в дозировка 500 ppm към дажбата на анемизирани бели плъхове повлиява благоприятно хематологичните показатели. В научната литература съществуват данни, според които, количеството на хемоглобина в кръвта е указание за адекватността на снабдяването на организма с желязо ( NRC, 1998 ). Това съвпада и с нашите резултати относно количеството на хемоглобина, който при дозировка 500 ppm ЖКМ, се повишава в най-голяма степен ( в границите на физиологичните норми ) – 117,3 g/l, в сравнение с дозировките 100, 1500 и 2500 ppm ЖКМ, при които той съответно е : 96,2, 110 и 100,1 g/l. Това ни дава основание да приемем, че дозировката от 500 ppm ЖКМ, в дажбата на анемизирани бели плъхове, осигурява оптимално ниво на желязото за хемопоезата. В подкрепа на това становище са и получените от нас резултати относно телесната маса и депонирането на желязото в черния дроб на плъховете, третирани с ЖКМ ( фиг. 8 и фиг.5 ).
На фиг. 9 и фиг. 10 представяме графично някои от показателите при които са наблюдавани най-значими промени ( Hb и тегло ). 
Фиг. 9. Промени в стойностите на хемоглобина в кръвта на бели плъхове, третирани p.o. с ЖКМ в дозировка 500 ppm ( I група ), железен сулфат в дозировка 500 ppm ( II група ) и III група контролна ( нетретирана ). 
Фиг. 10. Промени в стойностите на телесната маса на плъхове третирани p.o. с ЖКМ в дозировка 500 ppm ( I група ), железен сулфат в дозировка 500 ppm ( II група ) и III група контролна ( нетретирана ). При сравнително изследване на три железни комплексни продукта ( Fe ортофосфат, Fe Na EDTA и Fe-глицин хелат ) при анемизирани бели плъхове, Dutra de Oliveira et al., ( 1995 ), установяват най-добър хематологичен статус ( Hb, Ht, трансферинова сатурация и тегло ) за железния-глицинов хелат, свързано и с по-голямата му бионаличност . Различните механизми на резорбция на желязото от хелатни продукти (железен хидроксид-полималтозен комплекс и др.), в сравнение с неорганичните му форми ( железен сулфат и др. ), е доказано и при фармакокинетични проучвания на анемични и неанемични бели плъхове ( Geisser and Muller, 1984 ; Geisser and Muller, 1987 ). III.6. Депониране и антианемично действие на ЖКМ, сравнително с референтен продукт при анемизирани бели плъхове. Сравнително бяха изследвани ЖКМ с METH-IRON 65 в дозировка 500 ppm. Безспорно най-значими бяха разликите в количеството на хемоглобина и броя на ретикулоцитите ( фиг. 11 и фиг. 12 ). Получените резултати относно хематологичните показатели при опитните и контролни плъхове на 30-ия ден след третирането наподобява на тези, установени от нас на 15-ия ден. Най-благоприятно те се повлияваха при групата третирана с ЖКМ, където стойностите са най-високи ( хемоглобин 151,3 ± 10,45 g/l, брой на еритроцитите 8,65 ± 0,36 T/l ), като стойностите на хемоглобина на I група са достоверно по-високи от тези на II група. При плъховете, третирани с METH-IRON 65 ( II група ), стойностите бяха по-ниски с около 15 %, съответно Hb - 127,1 ± 3,17 g/l, и Er – 7,95 T/l. На 30-ия ден от третирането с желязосъдържащите хелати се установи намаляване в броя на ретикулоцитите при плъховете и от двете опитни групи , съответно 16,67 ± 1,20 ‰ ( p>0,05 ) и 13,83 ± 1,23 ‰ ( p>0,05 ), спрямо контролната група плъхове, но разликите бяха недостоверни ( p>0,05 ).
Фиг. 11. Промени в стойностите на хемоглобина в кръвта на бели плъхове, третирани p.o. с ЖКМ, в дозировка 500 ppm ( I група ), с METH-IRON 65, в дозировка 500 ppm ( II група ) и III група контролна ( нетретирана ).
Фиг. 12. Промени в броя на ретикулоцитите в кръвта на бели плъхове, третирани p.o. с ЖКМ, в дозировка 500 ppm ( I група ), с METH-IRON 65, в дозировка 500 ppm ( II група ) и III група контролна ( нетретирана ).
Резултатите от атомно-абсорбционното изследване на първа и втора група бяха достоверни спрямо контролата ( виж фиг. 13 ). Фиг. 13.Съдържание на желязо ( ppm ) в черен дроб на плъхове, третирани p.o. със ЖКМ, в концентрация 500 ppm ( I гр. ), METH-IRON 65, в концентрация 500 ppm ( II гр. ) и III група контролна нетретирана. 
Изтегляне 483.93 Kb. Сподели с приятели:
|
