Справка за научните и научно-приложни приноси в трудовете на доц д-р Мария Георгиева Иванова, дссн

Пълният списък на публикации включва общо 107 заглавия (виж приложение „Публикации общо”), от които:

• 
  16 статии в списания с импакт фактор – общ импакт фактор – 23.035
  
• 
  29 статии в международни издания;
  
• 
  57 в български периодични издания и сборници;
  
• 
  3 научно – популярни статии;
  
• 
  2 патента;
  
• 
  2 издадени книги, през 2010 г., 2011 г и 1 под печат - 2012 г.;
  
• 
  79 участия в 40 национални и 39 международни форуми с изнесени пленарни доклади, доклади и постери;.
  
• 
  Цитирания – 182 (виж приложение „Списък на цитиранията”)
  

• 
  13 статии в международни периодични списания и списания с импакт фактор;
  

• 
  19 в български периодични издания и сборници;
  
• 
  13 участия с пленарни доклади, доклади и постери на научни конференции;
  
• 
  книга „Размножаване на домашните животни”. Издава Академично издателство на Агранния университет, Пловдив, 2011 г. стр 213, Автори - Михо Семков, Мария Иванова- Кичева, Васко Герзилов. ISBN 978-954-517-113-0.
  
• 
  „Наръчник на ветеринарния лекар, стартиращ собствен бизнес„ - под печат. Издава Издателство: „Интел Ентранс”, Код на издателството 2910, София Лесотехнически университет, 2012, стр. 380, Автори колектив и Мария Иванова-Кичева, ISBN
  

Научната и изследователска дейност е фокусирана главно към разработването на три основни проблема, а именно:

1. 
   Анализ на спермалната плазмена мембрана във връзка с биологичните качества на сперматозоиди от животни при in vitro съхранение и прилагане на изкуствено осеменяване;
   
2. 
   Проучвания върху семинално плазмени протеини като протектори при ниско температурно съхранение на сперматозоиди от животни;
   
3. 
   Тютюнопушене, неспецифични възпалителни заболявания и репродукция при хора;
   

1. 
   Анализ на спермалната плазмена мембрана във връзка с биологичните качества на сперматозоиди от животни при in vitro съхранение и прилагане на изкуствено осеменяване
   

• 
  . Направен е обзорен анализ на спермалната плазмена мембрана и сигналните пътища, отговорни за процесите капацитация и апоптоза, както и на промените настъпващи в биомолекули и вътреклетъчни структури при сперматозоидите, съпровождащи тези процеси. Представена е информация за поведението на холестерола, албумина като акцептор на холестерола, ролята на калциевите и бикарбонатни йони, както и на основните биохимични процеси – протеинно фосфорилиране и киназна активност по време на капацитация и акрозомна реакция. Обърнато е внимание на промените в рН и на мембранния потенциал, отговорни за промени във виталитета на гаметите. Анализирани са сравнително сигналните пътища при апоптоза на соматични и клетки и е представена теоретична хипотеза за протичането на този процес при сперматозоиди (публикация 18).
  
• 
  Екстернализацията на фосфатидилсерин (ФС) на външната повърхност на плазмената мембрана е ранен белег за процеса апоптоза при соматични клетки. При сперматозоиди този фенотипен белег все още не е добре проучен, във връзка с in vitro съхранението. Поведението на фосфолипидите от спермалната лазмена мембрана е анализирано чрез моноклонално антитяло b₂GPI- Mab 3 A 11. Установени са най-ранни промени в молекулната цялост на плазмената мембрана, чрез установяване на интрацелуларни фосфолипиди на клетъчната повърхност. Доказва се висока степен на достоверност в екстернализацията на молекули фосфатидилсерин след криоконсервация в гранули, в сравнение със свежите сперматозоиди (р<0.05). При групата на сперматозоиди с понижена криотолерантност, различията в преразпределението на фосфолипидите са значими и с висока степен на достоверност (р<0.001). Нарушеният интегритет на плазмената мембрана води до адхезия на такива сперматозоиди по повърхността на половия тракт на женското животно. Установяването на екстернализиран фосфатидилсерин може да се приеме като фенотипен белег за нефункционалност на сперматозоидите – (публикация 14).
  
• 
  Установено е, че различните третирания на сперматозоидите след получаване на еякулатите, като криоконсервация, индуцирана апоптоза или капацитация, повлияват по строго специфичен начин върху биологичното и физико-химично поведение на фосфолипидите от плазмената мембрана. Молекулните промени в асиметрията на плазмената мембрана са първопричина за стартиране на специфични метаболитни процеси, отговорни за бъдещото поведение на сперматозоидите. Чрез анти-ФС антитяло 1Н6 е доказано, че при сперматозоиди с индуцирана апоптоза или при криоконсервация се наблюдават специфични струпвания на кластери от молекули на мембранни фосфолипиди в региона на mid-piece, докато при капацитирани сперматозоиди, такива фенотипни промени са предимно в апикалния регион на акрозомата – (публикация 19).
  
• 
  При сравнителен анализ с два метода на анализ – с анти-ФС антитяло 1Н6 и Анексин V е установено, че транслокацията на фосфатидилсерин в региона на акрозомата, не винаги означава че е стартиран процес на апоптоза. Когато тези изменения са съпроводени допълнително със специфични фенотипни белези, като промени във функцията на митохондриите или интегритета на ДНК, както и когато локализацията на мембранните промените е предимно в региона на mid-piece, може да се твърди, че такива сперматозоиди са нефункционални (от доклади - 7). Получените резултати имат оригинален характер и са от значение при определянето на специфични фенотипни белези, свързани с протичането различни сигнални пътища, отговорни за функционалността на гаметите - (публикация 29 и от доклади 12).
  

• 
  Анализирано е действието на антиоксиданти върху виталитета и апоптоза-свързани маркери при сперматозоиди, съхранени на ниски температури. Доказана е зависимост между транслокация на фосфатидилсерин, каспазната активност и промените в активността на митохондриалния цитохром Ц, във връзка с жизнеспособността на сперматозоидите. Присъствието на мелатонин и меркаптоетанол в ниски дози при коч - (5 от доклади) или суперксид дисмутаза и меркаптоетанол при нерез (публикация 23) инхибират оксидативното действие на свободните радикали, протектирайки гаметите чрез запазване на вътреклетъчния оксидант- антиоксидантен баланс.
  
• 
  Проучено е влиянието на ултравиолетовото облъчване върху проявата на апоптоза-свързани белези при сперматозоиди от коч. Установено е, че директно UV облъчване с дължина на вълната 289 nм води да нарушения в липидната асиметрия на спермалната плазмена мембрана и промени в митохондриален трансмембранен потенциал. Cоmet assay на ДНК не доказа статистически значимо нарастване на ДНК фрагменти. Сниженият мотилитет и преживяемост, съпроводен с проявата на апотоза – свързани белези са причина за понижена оплодителна способност на сперматозоидите (публикация 22).
  
• 
  Криоконсервацията на сперма от биволи е нерешен проблем. Изследвано е протективното действие на антиоксидантния ензим супероксид дисмутаза при криоконсервация на сперма от биволски бици. Експериментално е доказано, че деструктивните промени в цитоплазмените и мембранни протеини зависи от продължителността на инкубация. Нарастването на оксидацията на клетъчните протеини асоциира с понижения виталитет на гаметите. Присъствието на антиоскиданта – супероксид дисмутаза, протектира сперматозоидите, като запазва достоверно в по-висока степен техния мотилитет, морфология и виталитет, в сравнение с контролните проби (р<0.01) – (публикация 20).
  
• 
  Доказан е позитивен ефект на протекция на LDL фракция от яйчен жълтък, добавена в среда Триладил при криоконсервация на сперматозоиди от ovis areis в гранули и пайети – (публикация 21).
  
• 
  Проведени са опитити за стабилизиране на спермалната плазмена мембрана на сперматозоиди от коч - (публикация 27) и нерез (публикация 4) чрез сепарирани липопротеини (липовителини и ливетини) при съхранение на 4⁰С. Чрез подробен морфологичен анализ на акрозомата, едновременно с анализ върху мотилитета и преживяемостта на сперматозоидите, проследени до 72-я час е доказано, че присъствието на водоразтворими липопротеини в протективните среди, съхранява вътреклетъчния баланс на осмотично активните вещества, понижавайки обмена им с околната среда. По този начин се предпазва интактна акрозомата на сперматозоидите. В приложен аспект забавянето на основните метаболитни процеси на ниво нискотемпературна анабиоза, води до съхраняване на енергийния баланс в клетките, изразено в запазването на достоверно по-висок процент подвижни сперматозоиди след размразяване, имащи удължена преживяемост до 72-я час за коч (публикация 27) и до 48-я час за нерез (публикация 4).
  
• 
  Направено е проучване върху ролята на някои фактори от околната среда, като температура, влажност и продължителност на светлинния ден върху продуктивността (публикации 12) и криотолерантността (публикации 24) на сперматозоиди от коч. На базата на осморезитентостта, пенетрационната способност на сперматозоидите и резултатите от тестовете за виталност след размразяване се доказва, че е възможна успешна криоконсервация на сперма, получена през извън размножителен период. Опитите са проведени с оглед съхраняване на генетичен материал от ценни индивиди (публикации 12 и 24).
  

• 
  Проведена е експериментална криоконсервация на сперматозоиди от биволски бици в пайети по метода на Касу с три протективни среди – ТСА, TCG и TCZ. Резултатите показват достоверно по-добри данни на основните биологични показатели на сперматозоидите за среда ТСА, съдържаща трис-ацид-галактоза (р<0.05), в сравнение с останалите две среди. Проведеният биологичен опит с изкуствено осеменяване на 122 биволици показа 53.3% заплодяемост от първо осеменяване със среда ТСА. Получените резултати са база и метод за работа и успешно могат да се използват в животновъдната практиката (публикация 28).
  
• 
  Чрез комплексен морфофункционален и биохимичен анализ на ензимни системи, е обективизирана оценката за оплодителната способност на сперматозоиди от биволски бици (публикация 26, от доклади 2, 3, 4) и говежди бици (публикация 19). Установено е, че след криоконсервация се увеличава активността на алкалната и кисела фосфатаза, лактатдехидрогеназата и металпротеиназите, докато диафоразата и глюкозо-6- фосфат дехидрогеназата при говежди бици (публикация 17) и глюкозо-6- фосфат дехидрогеназата, акрозина при биволски бици (от доклади 2, 3, 4) намаляват своята активност. Ултраструктурно се доказа, че криоконсервацията на сперматозоиди води до морфологично промени най-вече в акрозомата (набъбване на акрозомалната мембрана и на плазмолемата, достигаща до силна ондулация и разкъсване) при говеждите бици (публикация 17). Тези изменения са по-силно отразени при биволски бици, където се среща нарушаване и на митохондриалните кристи (от доклади 2, 3, 4). Данните са с висока степен на достоверност и могат да се използват за експериментални цели или за целите на репродукцията при говеда (публикация 17 от доклади – 2, 3, 4).
  
• 
  Получени са еякулати от аборигенни породи овце в извънслучен сезон, отглеждани в България, с цел ефективно използване на кочовете като спермодарители, във връзка със селекционната дейност (публикация 9). Проведена е успешна криоконсервация в пайети на сперма, получена в извънслучен сезон от следните автохтонни породи овце – Каракачанска, Медночервена Шуменска и Местна Карнобатска (публикация 10).
  
• 
  Проучена е оплодителната способност след изкуствено осеменяване на овце със съхранена в условия на хипотермия сперма (публикация 2). Проведен е опит с ИО на 326 овце, разделени на две групи – едната, осеменени със съхранена след получаването за 90 минути сперма и останалите 184 овце, осемени със съхранена на 4⁰ за 24 ч. сперма. Резултатите от експеримента показват висок процент заплодяемост при двата метода на осеменяване и живородени агнета в рамките на 121.9% и 120.25%.
  
• 
  Проведено е изкуствено осеменяване при пекински патици, въз основа на оптимизирана биотехнология за съхранение на сперма при 4⁰С. Средите HIA -1 и IMV- buffer имат добър буферен капацитет и протектират сперматозоидите до 6 ч. на 4⁰С (публикация 15)
  

2. 
   Проучвания върху семинално плазмени протеини като протектори при ниско температурно съхранение на сперматозоиди от животни
   

• 
  Направен биологичен анализ върху негативното влиянието на ниските температури, с оглед създаване на нов подход за съхранение на сперматозоиди в охладено състояние. Проучена е ролята на селектирани чрез хроматографски методи семинално плазмени протеини върху биологичните качества на сперматозоиди от коч (публикации - 3, 5, 13, 30, 31, доклади -6, 7), нерез (публикация 7) и птици (публикация 8). При коч и нерез са изпитани на клетъчно ниво ефектите на сепарирани и селектирани семинално плазмени протеини чрез добавяне към протективни среди.
  
• 
  Проведен е цялостен анализ върху биологичните параметри – мотилитет, преживяемост, морфология и ДНК интегритет на сперматозоиди от коч при нискотемпературно съхранение на 4⁰С, в присъствие на селектирани семинално плазмени протеини – (публикация 11) и криоконсервация в пайети (публикация 29). Чрез изследване на поведението на повърхностно мембранни молекули с Анексин V се доказва, че плазмената мембрана на сперматозоидите от коч е слабо криоустойчива и процесът криоконсервация предизвиква в голям процент от сперматозоидите нарушения в региона на акрозомата (до 31.85±4.53 от акрозомите на сперматозоидите са с експресия на фосфатидисерин на повърхността на мембраната) - (публикация 29)
  
• 
  От направения анализ за ролята на криоконсервацията върху състоянието на трансмембранния митохондриален потенциал чрез R123 тест, наличието на активна форма на каспаза 3 и 9 и интегритета на ДНК на сперматозоидите чрез микрогел електрофореза на единични клетки (Сomet assay) и акридин оранж тест се установи, че промените във фосфолипидната организация на плазмената мембрана са предимно в региона на mid-piece, където е разположен митохондриалния апарат (от доклади 7). Криоконсервацията индуцира промени в структурата на митохондриите, като този процес е съпроводен с нарастване на процента клетки с нарушения в митохондриалния трансмембранен потенциал. Мотилитетът на сперматозоидите и процентът R123++ реагирали сперматозоиди (с добре съхранени митохондрии), намаляват значително след замразяване-размразяване. В същото време е установено, че криоконсервацията не индуцира активация на каспаза 3 и 9 (апоптоза свързани белези) в клетъчни лизати на сперматозоиди от коч. Ядрото на сперматозоидите е устойчива структура и криоконсервацията не води до статистически значими промени в интегритета на ДНК. - (доклади 7, 12)
  

• 
  Направено е хроматографско сепариране на протеини от семинална плазма на коч чрез Sephacryl S 200 (публикация 11) и Sephacryl S 100 (публикация 6, 13), от нерез (публикация 7) и от птици чрез HPLC – течна хроматография (публикация 8). Чрез SDS-PAGE електрофореза са характеризирани всички белтъци, съдържащите в отделните фракции. Молекулната маса на белтъците варира от 10 до 200 кДа. Също така, на получените семинално плазмени фракции, спектрофотометрично е определено количественото съдържание на протеините, което варира от 0.642 g/ml за фракция 2 до 2.903 g/ml за фракция 5 (публикация 11) .
  
• 
  Получено и характеризирано е поликлонално антитяло срещу протеини от спермална плазма от коч. Установено е, че полученият имунен серум разпознава сепарирани след хроматография спермално плазмени протеини. (публикация 11).
  
• 
  Проведената полиакриламидна гел електрофореза доказа, че белтъците с молекулна маса над 30 кДа доминират във фракции 2, 3, 4, 5, 6, докато фракции от 7 до 15 съдържат повече и почти изцяло протеини с ниска ММ (под 30 кДа) – (публикация 31).
  
• 
  За допълнително идентифициране на белтъците е направена течна HPLC хроматография. Резултатите показват, че във фракция 15 преобладават два ниско молекулни белтъка с ММ под 30 кДа, отделени в два пика, докато във фракция 11 белтъците са четири (три са ниско молекулни с ММ под 30 кДа и един с ММ около 66 кДа.- (публикация 3).
  

• 
  Направен е анализ на ролята на селектираните протеини върху функционалността на сперматозоидите от коч, нерез и птици при условия на нискотемпературно съхранение (публикации 3, 6, 7, 8, 11). Изследвано е влиянието на селектираните протеини върху подвижността и преживяемостта на сперматозоидите преди температурен шок, след температурен шок и след инкубация на 5⁰С за 24 и 48 часа и при съхранение на 15⁰С (публикации 6, 30, 31). Установено е, че охлаждането и температурният шок водят до понижаване на подвижността и преживяемостта на сперматозоидите, особено силно изразено на 48-я час от съхранението.
  
• 
  Доказана е специфична абсорбция на семинално плазмени протеини с мол. маса над 80 кДа в региона на акрозомата и пост-акрозомата (публикация 11). Също така, протеините от фракции 2, 4 (протеини с големи молекулни тегла), се локализират в региона на шийката, тялото и опашката при сперматозоиди от коч. Установената локализация е в зависимост от селекцията на протеините (публикация13).
  
• 
  Протеините от фракции 1-3 показват по-добра протекция върху мотилитета на сперматозоидите при температура на съхранение 15⁰С, докато нискомолекулни протеини от фракции 5 и 6 протектират сперматозоидите по-добре при температурен режим на съхранение 4⁰С (публикация 30).
  
• 
  Проведеният спермокомпютърен анализ на влиянието на селектираните протеини върху промените в скоростните параметри на сперматозоиди от коч след индуциране на температурен шок и след инкубация на 5⁰С за 24, доказва, че в пробите инкубирани с ниско молекулни семинално плазмени протеини (СПП) се протектира достоверно по-добре мотилитета. Мотилитетът, изразен в прогресивно подвижни сперматозоиди е 24.91% за опитните проби, докато този процент е едва 4.66% - за контролните проби на (р<0.001). При тези сперматозоиди е добре съхранена скоростта на движение, отразена в опция – бързо подвижни сперматозоиди, която е в рамките на 33.23% срещу 1.9% при контролната проба (р<0.001) – (публикация 31).
  
• 
  Направен е подробен флоуцитометричен (FACSCalibur) и спермокомпютърен анализ (Sperm Class Analizer, Micropticum) върху протективната роля на селектирани семинално плазмени белтъци, при инкубация на сперматозоидите за 24 ч на 5⁰С (публикации 5, 6). За целта, чрез флоуцитометрия е изследван интегритета на спермалната плазмена мембрана с комбинирано оцветяване с флуорохром за жизнеспособност - 6-карбоксифлуоресцеин диацетат (6CFDA) и с Пропидиев йодид (PI) – интеркалиращ агент, който се свързва с ДНК и флуоресцира в червено само ако целостта на плазмената мембрана на клетките е нарушена. Получените резултати са съпоставени с данните от проведения спермокомпютърен анализ на скоростните параметри VCL (скоростта на сперматозоида от началната до крайната точка, цялата измината дистанция за секунда), VSL (средната скорост измерена по права линия от началото до края на пътя на сперматозоида), VAP (средната скорост на изминатия път в µm/sec). Установи се, че нискомолекулните протеини, съдържащи се във фракция 15 имат протективен ефект. Установява се, че продължителното съхраняване на сперматозоидите в охладено състояние води до нарушаване на целостта на плазмената мембрана, която става пропусклива за пропидивия йодид (публикации 5, 6). Данните показват съществуване на връзка между целостта на спермалната плазмена мембрана и съхранения мотилитет на сперматозоидите (публикация 5).
  
• 
  Направен е опит за анализ на механизма на протекция на селекритани протеини от спермална плазма. За целта е проведено имуноцитохимично проучване на повърхностно-клетъчна локализация на семинално плазмени протеини, изолирани чрез Sephacryl S 200 (публикация 11) и Sephacryl S 100 (публикация 13). Данните показват, че протеини с молекулна маса от 14 до 20 кДа специфично се адсорбират по плазмената мембрана на сперматозоидите в апикалния регион и региона на mid piece. Достоверно по-добрите резултати от биологичните, морфологичните, имунохимичните и имунофлуоресцентни анализи доказват, че тези протеини са кандидати за протектори в средите с нискотемпературно съхранение на сперматозоиди от коч (публикации 11, 13).
  
• 
  Разработен е модифициран метод за изследване интегритета на ДНК на сперматозоиди, на базата на метода Comet assay. Новият метод е съобразен с плътно пакетираната структура ДНК при сперматозоидите и е приложен за първи път при нерез и коч (6, 30, 31).
  

• 
  Тютюнопушенето представлява сериозен здравословен проблем на човечеството, но най-вече се приема за основен рисков фактор, засягащ репродуктивното здраве. Проведени са анализи върху ефекта на тютюнопушенето върху интегритета на спермалната плазмена мембрана и настъпването на ДНК фрагментация при сперматозоиди от хора. Опитите са извършени върху 40 семенни проби, получени от мъже – донори, между 22-35 г, разделени на две групи. В едната група са включени мъже, които пушат по 25 цигари дневно, а другата група са непушачи. Анализът върху интегритета на спермалната плазмена мембрана, направен с Анексин V СУ 3.18/6CF (кит за апоптоза) показва, че AnV⁺/6-CF^- реагиралите сперматозоиди (с екстернализиран фосфатидилсерин), нарастват при групата на пушачите до 25.75±5.3 %, докато при групата на непушачите този процент е достоверно по-нисък – 10.26±1.4 % (р<0.01). От направения анализ върху ДНК фрагментация на сперматозоидите, се установи тенденция за нарастване на процента ДНК фрагментирали сперматозоида при пушачи (публикации – 1, 16 от доклади - 1).
  
• 
  Изследвани за 534 пациенти със неспецифични възпалителни заболявания на генито-уретралния тракт на средна възраст около 29 години. Чрез анализ на сперматологичните параметри, цитохимичен анализ за NADH-TR активност за състоянието на митохондриите и изследване интегритета на плазмената мембрана чрез Анексин V тест, е установено за първи път, че степента на инфертилитет зависи от локализацията на възпалителния процес (хроничен уретрит, епидидимит и простатит). Молекулните механизми на тези промени са отразени с умерена и слаба реакция за NADH-TR активност, съответстваща на понижен мотилитет и нарушения в молекулната организация на спермалната плазмена мембрана – (публикация 25).
  

4. 
   Други приноси
   

- Книгата „Размножаване на домашните животни” е съвместен труд, в който всеки автор има собствен принос в представянето на биологичните закономерности на репродуктивния процес, методите и средствата за ефективен контрол на възпроизводителния процес при различни видове животни и птици. Личното участие е в раздели – 1, 2 и 3 и в написването на над 100 страници от книгата, както и в подготовката и оформянето на всички таблици (27 на брой), графики и снимки (70 на брой).