Съвременни аспекти в диагностиката на cmv инфекция

Д. Велчева¹, А. Гоцева²

¹ МДЛ "Цибалаб" EOOД , ²Лаборатория Вирусология, ВМА - София
Клиничната и социална значимост на цитомегаловирусната (CMV) инфекция се определя от широкото й разпространение в световен мащаб, както и засягането на определени рискови групи - бременни жени, имуносупресирани и трансплантирани пациенти.

Целта на настоящата работа е да се представят получените данни за серопревалентността сред общата популация, при бременнните жени, както и диагностичните алгоритми при остра и реактивирана CMV инфекция. Разгледани са най-съвременните имунологични и молекулярно-биологични методи за диагностика на CMV и приложението им при различните таргетни групи. Оценена е тяхната диагностична и прогностична стойност, както и мястото им в комплексната диагностика на инфекцията.

CMV e ДНК- вирус,който инфектира само хората.Както и другите херпесни вируси след първично инфектиране причинява латентна инфекция.Трансмисията на вируса се осъществява хоризонтално- при органна трансплантация,кръвни трансфузии,сексуален контакт и чрез инфектирана слюнка и урина.Приблизително около 50% от жените в репродуктивна възраст имат данни за прекарана CMV инфекция. Придобиването на инфекцията в хода бременността става най-често при контакт на бременната с малки деца , посещаващи детски заведения.Новородените придобиват инфекцията чрез контакт с контаминирана кръв или генитални секрети в хода на раждането, или постнатално чрез майчиното мляко. При развитие на остра първична инфекция през първата половина на бременността , риска от интраутеринна трансмисия е 40%(2,8), като 5-15 % от новородените са с клинични изяви още при раждането. Най-честата изявява в тези случаи е с хепатоспленомегалия,тромбоцитопения с петехии, интракраниални калцификати , ниско тегло при раждане,микроцефалия , загуба на слуха и гърчова симптоматика. Приблизително 85-95% (8)от новородените са асимптомни при раждане, но на по-късен етап 10-15 % от тях развиват неврологича симптоматика или зрителни нарушения. Доказано е, че CMV е най-честата причина с вирусна генеза за ментална ретардация , и е водещата негенетична причина за невросензорна загуба на слуха. За разлика от първичната,рекурентната/реактивирана CMV инфекция не е с висок риск от интраутеринна трансмисия, като 10-15 % от новородените са инфектирани, които обикновено са асимптоматични. При тези деца се развива зрителен,слухов и неврологичен дефицит,обикновено проявяващ се в ранна училищна възраст.(8)

С цел определяне серопревалентността сред българската популация за периода от 01.20016 г. - 04.2017г., са обобщени данните от изследваните в лаборатория "Цибалаб" 1574 серумни проби (1250 за IgM и 1300 за специфични IgG антитела) с хемилуминисцентен имунен анализ (CLIA). От изследваните 1300 проби за anti CMV IgG антитела, 79.5% са от жени (n=1033, съответно позитивни n=635 и негативни n=398 ) и 20.5% от мъже (n=267, съответно- позитивни n=158 и негативни n=109). Данните, получени за серопревалентността сред общата популация са: позитивен резултат при 61% (n=793), и отрцателен при 39% (n=507). От изследваните 198 бременни жени при 56% (n=111) се доказаха anti CMV IgG, а при 44% (n=87) не се детектираха специфични антицитомегаловирусни антитела .

Диагностичен алгоритъм при остра първична CMV инфекция

Детекцията на специфични anti-CMV IgM антитела е чувствителен маркер за първична инфекция.Характеризират се със сравнително ниска специфичност, поради възможността от кръстосана реактивност(основно с антитела срещу други вируси от сем. Herpesviridae). Продуцират си и при вирусната реактивация, а също така могат да персистират продължително време при първична инфекция .Описани са два модела, по които може да протече синтеза на anti-CMV IgM. Първият се характеризира със силен антителен отговор, достигане на пик , и бърз спад в рамките на 1 до 3 месеца след първичното инфектиране.Вторият начин е с по-бавно достигане на максималната антитялова продукция, бавен спад и задържането им в детектируеми с лабораторните тестове стойности в рамките на 9-12 месеца.(фиг.1)

Данните, които са получени от изследването на 1250 серумни проби за anti-CMV IgM са 95% (n=1183) негативни, 1% (n=18) позитивни, а при 4% (n=49) резултатът беше в граничната зона по критериите на използвания метод.

фиг.1

Типичната лабораторна констелация за остра първична CMV инфекция е :позитивни anti CMVIgM; ani CMVIgG антитела- негативни/или слабо позитивни, които в хода на инфекцията се повишават; нисък авидитет на IgG антителата;детектира се CMV DNA , изолирана от кръв или урина. Риска от интраутеринна трансмисия на CMV по време на бременност е значително по-голям при жените, които развиват първична инфекция постконцепционно,в сравнение с жените,при които има данни за инфекция(циркулиращи CMV антитела ) преди забременяването.

Поради тази причина лабораторните тестове за идентификация на настояща първична CMV инфекция са изключително важни с цел менажиране на грижите при бременните жени,при които съществува риск от инфектиране с вируса.Детекцията на anti-CMVIgM антитела са чувствителен маркер за първична инфекция, но специфичността им е сравнително ниска. Множество проучвания през последните 20 години безспорно показват, че изследването на CMV IgG avidity е едновременно чувствителен и специфичен метод за идентифициране на бременни жени с настояща първична CMV инфекция,и съответно с повишен риск от вертикална CMV трансмисия. Авидността се определя като силата, с която IgG антителата се свързват с антигенните епитопи експресирани на съответния протеин,като тази здравина се усилва през шестте месеца, последващи първичната инфекция. Ниският CMV IgG авидитет се доказва през първите три до четири месеца след инфектирането, докато високият авидитет изключва първично инфектиране през последните 12-14 седмици. Определянетото на CMV IgG авидитет се извършва винаги успоредно с изследване на общите анти CMV IgG. Скрининг за anti-CMV IgG се препоръчва при всяка бременна жена. Ако същата отглежда дете под 3-годишна възраст, се скринира за anti- CMV IgG и IgM. Индикация за изследване на CMV IgG авидитет е позитивен резултат за anti-CMV IgM.

CMV IgG avidity:

• 
  ефективно разграничава първичната от прекарана/реактивирана CMV инфекция
  
• 
  Ефективен метод за оценка на риска от интраутеринна трансмисия
  
• 
  CMVIgG avidity е по-специфичен тест от CMV IgM за идентифициране на първична CMV инфекция
  
• 
  Проследяването им в динамика можеда определи времето от началото на инфекцията
  

За "златен стандарт" се счита детекцията на вируса в амниотична течност чрез култивиране или PCR анализ.Вирусната изолация на клетъчни култури се отличава със сравнително ниска чувствителност.Доказването на CMV DNA се извършва след 21 г.с., и най-малко 6 седмици след първия позитивен серологичен резултат на майката.Доказана е пряка корелация между вирусния товар и развитието на симптоматична инфекция, като прогностична стойност има определянето на генотипа CMV .

Кордоцентезата е метод изследване на фетална кръв за CMV- виремия,антигенемия, CMV ДНК-емия и anti-CMVIgM. Методът е с висока специфичност, но ниска чувствителност (40-84%).При прилагането му е необходимо да се оцени риска от вторична инфекция и загуба на плода.

Мониториране на CMV инфекцията при имуносупресирани пациенти

Цитомегаловирусната инфекция е едно от тежките усложнeния при имунокомпрометирани пациенти- реципиенти на солидни органи ,след костно-мозъчна трансплантация, лица на хемодиализа или с онкологични заболявания, както и  пациенти с HIV-инфекция. Основна част от  CMV заболяванията се дължат на реактивация на  латентна инфекция.тНад 40% от пациентите с HIV и над 30% от серонегативните реципиенти на органи от серопозитивни донори развиват CMV заболяване, като смъртността при тези групи достига 80-90%. (1,3) Клинично изявената реактивирана CMV инфекция протича най-често като ретинит, увеит,хепатит, холангит,енцефалит,пневмония или колит .Наблюдава се по-тежко протичане на други опортюнистични инфекции (Pneumocystis carini).

При имунокомпрометирани пациенти стратегията в диагностиката и мониторирането на CMV се основава на количествени методи, които определят вирусния товар.Традиционните методи, основаващи се на вирусна изолация и отчитане на цитопатичен ефект, са вреемки, с ниска възпроизводимост и невисока чувствителност.Тестовете за детекция на антигенемия,които детектират матриксния протеин рр65 в левкоцитни проби, са широко разпространени за мониториране на инфекцията.Количеството на рр-65 позитивните клетки, корелира с тежестта на СМV заболяванията. Съществен недостатък на теста е липсата на автоматизация и стандартизация, изискването за бързо изследване след пробовземането(до 8 часа),както и факта че се доказват вирусните частици, асоциирани с клетките, докато свободният вирус в биологичните течности не се детектират с този тест.Неприложим е и при пациенти с левкопения(5,6,8).Тестът е с ниска предиктивна стойност при доказване на CMV-асоциираните гастроенетрити.(6).

Молекулярно-биологичните тестове ,базирани на количествения PCR, се прилагат за мониториране на CMV при реципиентите на костен мозък.Препоръчителен изходен материал е плазма, в сравнение с цялостна кръв с антикоагулант,като и real-time PCR е с по-добра чувствителност в сравнение с тестирането за антигенемия.(3,4,6).

При оценяване на риска от развитие на реактивация на латентна CMV инфекция при пациенти с HIV/СПИН се вземат предвид следните особености при тази група пациенти:

• 
  Развитието на CMV заболяване е в пряка зависимост от броя на CD4+(<250 кл./mm³) и HIV вирусен товар( >100 000 cop/ml)
  
• 
  Детекцията на CMV виремия има прогностична стойност
  
• 
  Високият CMV вирусен товар (IU/ml) пряко корелира с клиничната симптоматика
  
• 
  Определяне нивата на рр65 антигенемия-високите стойности са предиктор за развитие на CMV заболяване
  

IFN- γ е специфичен цитокинен маркер за клетъчно-медииран имунен  отговор. Секретира от CMV специфичните Т-клетки в отговор на антигенна стимулация.Продукцията на IFN-γ може да бъде функционален сурогатен маркер за идентификация на  CMV-специфичните CTL. Серийното мониториране на на нивата на  anti-CMV имунитета при лица с риск от развитие на  CMV  заболяване е важно ,с цел предсказване развититето на заболяване, като загубата на имунна функция може да се асоциира с развитие на  CMV  заболяване.

QuantiFERON®-CMV позволява оценяване на клетъчно-медиирания имунитет (КМИ) срещу CMV, като се определя отделянето на IFN-γ след ин витро стимулация със CMV антигени.Проучвания доказват корелацията между липсата на детектируем КМИ , измерен чрез  QuantiFERON-CMV и по-висока честота на CMV инфекцията  при имунокомпрометирани пациенти. Определянето на КМИ  срещу CMV е  метод на избор  за идентифициране на пациентите с висок риск от  развитие на CMV заболяване ииндивидуализиране на  превантивните  стратегии срещу CMV при имуносупресирани пациенти.

QuantiFERON технологията е единствената налична диагностична технология ин витро за детектиране на КМИ.Лицата след експозиция със CMV  образуват специфични Т-лимфоцити.Тези Т-клетки са банка памет на имунната система на индивида,  и разпознават антигени, с които са били в контакт.Когато специфичен CMV антиген  се  инкубира с кръвта на човек, който е бил изложен на CMV настъпва бързо повторно стимулиране на Т-клетките със специфична памет.Тези антиген-специфични Т-клетки отговарят чрез секретиране на IFN-γ , който може да бъде измерен  като специфичен маркер на имунния  отговор.

Резултатът се приема за реактивен за IFN-γ отговор , когато стойността е >0,2 IU/ml.Митоген-стимулираната плазмена проба служи като IFN-γ положителна контрола . Слабият отговор към митоген посочва неопределен  резултат, когато кръвната проба също е с нереактивен отговор към CMV антигена. Това може да се получи при недостатъчно лимфоцити, намалена лимфоцитна активност поради неправилно обработване на пробата, или невъзможност на лимфоцитите на пациента да произведат IFN-γ, например при пациента със скорошна трансплантация. Нулевата проба регулира фона или неспецифичнияIFN-γ в кръвните проби.

Резултатите, получени от Quantiferon-CMV теста

Пациент	CMV-Nil IU/ml	Mitogen-Nil IU/ml	Резултат
1	1.08	8.96	Реактивен
2	>10	>10	Реактивен
3	4,35	4,35	Реактивен
4	>10	>10	Реактивен
5	-002	3,58	Нереактивен
6	9,15	>10	Реактивен
7	8,64	6,63	Реактивен
8	3,57	0,57	Реактивен
9	0,47	0,13	Реактивен

Tаблица 1.

QuantiFERON®-CMV е:

• 
  чувствителен и специфичен тест за определяне на вирус-специфичен Т-клетъчен отговор
  
• 
  тест с доказани качества за мониториране на имунния отговор при имуносупресирани
  
• 
  може да предскаже риска от реактивиране на CMV инфекцията
  
• 
  служи за менажиране на терапевтичните решения, както и за определяне оптималната продължителност на антивирусната терапия
  

1.Abate D. et al. Comparison of Cytomegalovirus Enzyme-Linked Immunosorbent Spot and CMV Quantiferon Gamma Interferon Releasing Assays in Assessing Risk of CMV infection in Kidney Transplant Recipients ,Journal of Clinical Microbiology, 2013, p.2501-2507

2.Duff P. Diagnosis and management of CMV infection in Pregnancy,Perinatology,2010,1:1-6

3.Leruez-Ville M. et al. Monitoring Cytmegalovirus infection in Adult and Pediatric Bone Marrow Transplant Recipients by a Real-Time PCR Assay Performed with Blood Plasma,2003, Journal of Clinical Microbiology

4.Li H. et al. Measurement of Human Cytomegalovirus Loads by Quantitative Real-Time PCR for Monitoring Clinical Intervention in Transplant Recipients, 2003, Journal of Clinical Microbiology

5.Ljungman P. et al. Definitions of Cytomegalovirus Infection and Disease in Transplant Recipients,2002:34CID

7.Ross S.A. et al. Diagnosis of Cytomegalovirus Infections ,2011 ,Infect Disord Drug Targets