Инициацията на белтъчната синтеза не е функция на интактните рибозоми, а се извършва от свободни субединици, които реасоциират по време на инициацията. В една растяща бактериална клетка 80% от рибозомите синтезират белтък, а останалите 20% от рибозомите са свободни. Рибозомите от свободния пул могат да се разделят на отделни субединици, така че 70S рибозомите са в равновесие със 30S и 50S субединиците.
Инициацията на белтъчната синтеза не е просто начало на елонгацията. В повечето случаи началото на кодиращата последователност в иРНК не съвпада с началото на полинуклеотидната верига, което налага разпознаване на първия кодон вътре във веригата – иницииращ кодон. Точното разпознаване на първия кодон дава не само начало на полипептидната верига, но задава и рамката на четене на триплетите в иРНК, което е критичен момент за цялата АК последователност. Всяка иРНК притежава участък за свързване с рибозомата, към който се свързва малката субединица и се образува инициаторен комплекс.
30S субединицата не е способна сама да извърши инициация. Това е доказано чрез отмиване на субединицата със солеви разтвор NH4Cl. При тази реакция се отделят белттъци, които са слабо свързани с нея. Отмитата субединица не може да инициира транслацията. Откритите белтъчните молекули, които са необходими за инициацията, се наричат иницииращи фактори.
Инициаторните фактори се откриват само по свободни 30S субединици. Броят на копията на иницииращите фактори е много малък в сравнение с броя на свободните рибозоми, така че тяхното използване е много интензивно. Иницииращите фактори се отделят от 30S субединицата при свързването и с 50S субединицата. Така загубата на инициаторните фактори бележи границата между инициацията и елонгацията на белтъчната синтеза. Иницииращите фактори са свързани само с образуването на инициаторния комплекс, липсват в 70S рибозомите и не участват в елонгацията.
Образуване на свободни 30S субединици За инициацията е необходима свободна 30S субединица. Затова интактната рибозома трябва да се дисоциира Това става чрез свързването и с IF-3. Свързването на 30S с IF-3 измества равновесието, поради образуването на стабилен комплекс, който не може да се свърже с голямата субединица.
