В съвременната медицина при случаи на дефицит на антитела у пациента широко се прилагат имуноглобулинови препарати от различен тип

В съвременната медицина при случаи на дефицит на антитела у пациента широко се прилагат имуноглобулинови препарати от различен тип. Мускулните препарати се прилагат като профилактично средство, когато не е необходима голяма доза антитела. Венозните, имат по-универсално приложение-особено при необходимост от бърза и масивна корекция на имунното състояние на организма, като автоимунни заболявания.

У нас, в Научния институт по хематология и кръвопреливане се произвеждат специфични имуноглобулинови препарати като анти-D, антистафилококов, антихепатитен и анти-грамнегативен имуноглобулин, а в Института по заразни и паразитни болести се произвежда поливалентен (неспецифичен) инуноглобулин за мускулно и венозно приложение, а за специфичните антитетаничен и противобесен.

През шейсетте години за пръв път се появяват в литературата съобщения за настъпващи значителни промени в профилактичните и терапевтичните качества на имуноглобулиновите препарати. Наблюдава се появата на антикомплементарна активност, т.е след въвеждането на препарата в организма той бива възприет като антиген. Установено било също така, че антикомплементарната активност и свързаната с нея пирогенна реакция на организма се дължат на появата на агрегати от молекули на IgG. Оказало се също така, че дори след премахването на посочените агрегати от сместа се образуват нови количества агрегати, т.е става ясно, че е налице установено равновесие между молекулите на IgG и техните димери, тримери и агрегати.

Свеждането на процента на агрегатите под определените от СЗО 3% се оказва трудна задача, за която днес са намерени по-скоро частични решения.

Най-прилаганото днес решение е това на съобразяване на производството с консумацията на имуноглобулинови препарати с оглед на постигане на минимален престой на препаратите. Прогнозирането обаче, понякога се затруднява от наличие на силно променлива консумация, а освен това промени в препаратите настъпват преди изтичане на посочения от производителя краен срок. Другият вид решения са свързани с разработването на технологии за пречистване на престояли дълго време препарати. Най-често използвани методи тук са:

-модификация на имуноглобулините с химични съединения, нямащи противопоказен ефект върху организма;

-използуване на физични методи като хроматография в комбинация с утаявяне с полиетиленгликол;

-ензимна обработка на препаратите, целяща разграждането на имуноглобулиновите агрегати. За целта до сега са използвани различни протеолитични ензими като папаин, трипсин, плазмин и пепсин в разтворено състояние.

Всички посочени по-горе методи имат общ недостатък: след третирането на препаратите е необходима и следваща обработка за пречистването им, а това удължава и оскъпява тяхната преработка. Този недостатък би могъл да се избегне ако за разграждане на образуваните агрегати се използуват имобилизирани ензими, които по всяка вероятност ще атакуват гама-глобулиновите агрегати по същия начин, както и разтворените ензими. Проверката на тази възможност представлява обект на настоящата работа.

 ЛИТЕРАТУРЕН ОБЗОР
Имуноглобулините са белтъци, които имат много важна роля при двата типа имунен отговор - клетъчен и хуморален. Те се продуцират от В-лимфоцити. Именно те са белтъците, които свързват навлезлите в организма антигени. Това тяхно свойство се използва за създаването на ваксини.

Според съвременната номенклатура на СЗО човешките имуноглобулини изолирани от кръвен серум се разпределят в пет класа: IgG, IgA, IgM, IgD и IgE. От всички класове имуноглобулини само IgG е намерил широко приложение при създаването на ваксини поради неговата специфична биологична роля.

Развитието на методите за изолиране на достатъчни количества пречистени имуноглобулини позволи да се проучи добре тази група белтъци. Определянето на молекулното тегло на имуноглобулинова фракция чрез ултрацентрофугиране показва, че има един главен компонент със седиментационна константа 7 S и молекулна маса от 150 000 до 190 000. Според Porter (1960) тези колебания са свързани с експириментална грешка, появяваща се от наличието на малки количества агрегати в изолираните имуноглобулини, което завишава стойностите на молекулните маси на тези белтъци.

Въвеждането на хартиената електрофореза през 1952г. и имуноелектрофорезата през 1953г. улесни изследването на белтъците, включително и на имуноглобулините.

През 1959г. Porter провежда опити, които дават импулс в изследването на имуноглобулиновата структура. С помощта на папаин, и в присъствие на цистеин, той разгражда имуноглобулин, получен от зайци, имунизирани с яйчен албумин. Антителните молекули се оказали фрагментирани, така че те вече не преципитирали яйчен албумин, но можели да инхибират преципитацията на албумина от незасегнатите антитела. Освен това, при стоене на студено част от разградените молекули кристализирали. Тези кристални фрагменти нямали инхибиторна активност. Щастливо обстоятелство е, че Porter е избрал да проведе експиримента със заешки имуноглобулин, тъй като имуноглобулините от други животински видове не дават кристализиращи елементи след разграждане с папаин. При специални условия все пак може да се постигне кристализация и на фрагменти на човешкия имуноглобулин. Фактът, че част от имуноглобулиновата молекула може да кристализира е предизвикал голям интерес. По-малко драматична на пръв поглед, но ценна информация, получена от опита на Porter е, че големината на тази молекула може да се намали значително и тя пак да запази биологичната си активност. Човешкият имуноглобулин може да бъде разграден по подобен начин от папаин (Pranklin 1960, Edelman 1969).

Двата типа фрагменти се означават като F_ab (antibody binding) фрагмент и F_c (crystalizable) фрагмент (Pitzpatrick 67). F_c-фрагментите се движат по-бързо от F_ab в електрофоретично поле при pH=8.6. F_c-фрагментите имат молекулна маса 48000, а F_ab фрагментите - 52000 (Noelken1965). Двата типа фрагменти имат седиментационна константа 3.56 S (Porter 1959).

По-нататъшният прогрес в изучаване на структурата на имуноглобулините е свързан с редуциращи агенти в експериментите на Edelman et al. (1964), които показват, че гама-глобулиновите молекули могат да се разцепят до по-малки компоненти чрез редукция с тиолови съединения в присъствие на карбамид. Дисоциацията води до получаване на два компонента с различни молекулни маси. Това са тежките вериги с молекулна маса 53 000 и леките вериги с молекулна маса 22 000 (Skvaril 1963). Показано е, че F_ab e построен от лека верига и част от тежка верига, а F_c-фрагментът - представлява само части от тежки вериги (Fleishman 1963). Въз основа на тези данни Porter предложи модел на гамаглобулиновата молекула, изграден от две тежки вериги, свързани чрез дисулфидни мостове и към всяка тежка верига е свързана по една лека верига (Porter 1973).

Друг ензим, който успешно се използва при изучаване структурата на имуноглобулините е пепсинът. Той е първият протеолитичен ензим, приложен за разграждане на антитела. Тази възможност е използвана за пръв път от Parfentiev (1960), който е установил, че разграждане на конски антитоксичен серум при рН=4 с пепсин намалява антигенната му активност без да нарушава антитоксичността му. Още през 1941г. Peterman и Pappenheimer са намерили, че молекулното тегло на обработените с пепсин антитела е около 90 000 Da. По-късно Nisonoff et al. (1960) показват, че пепсина разгражда имуноглобулините, така че се получават 5S фрагменти с молекулна маса 100 000. 5S фрагментът се състои от два F_ab фрагмента и запазва бивалентната си антителна активност. Този фрагмент се означава като F_{(ab`) 2}. 5S фрагментите могат да преципитират с антигена и при това запазват около 70% от първоначалната си антителна активност. В присъствие на редуциращи вещества /0.01 М цистеин, 0.01 М меркаптоетанол и др./ 5S фрагментите се разпадат на 3.5 S фрагменти. Установено е, че разделянето на двете идентични половини става чрез редукция на единствената дисулфидна връзка (Nissonoff 1961). 3.5S фрагментите не преципитират с антигена, но инхибират реакцията на преципитация с необработеното тяло и свързват хаптена. Така 3.5S пепсиновите фрагменти са едновалентни и подобни на папаиновите фрагменти. F_c -частта на имуноглобулиновата молекула се разгражда от пепсина до по-малки фрагменти (Utsumi 1965).

При протеолиза с трипсин също се образуват 3.5S фрагменти. Така, при обработката на човешки имуноглобулин с 1% трипсин в продължение на 72 часа се откриват 45-60% фрагменти заедно с неразградени молекули. Получените фрагменти не се отличават от тези получени с помощта на папаин, както по седиментационни, така и по антигенни свойства, а също и при фракциониране с ДЕАЕ-целулоза (Schrohenloher 1963).

Възможно е да се получат хибридни антителни молекули след редукция на единичния дисулфиден мост на F_{(ab`) 2} -фрагмент. След отстраняване на редуциращия агент половинките на различните антитела се реасоциират безразборно до димери (Fudenberg 1964). Не е възможно да се свържат или окислят обратно обаче, F_ab-фрагментите, получени под действие на папаин. Причината за тази разлика не е известна.

След публикуването на горните експериментални данни става ясно, че класическата схема на строежа на гама-глобулина дадена от Porter (1973) има недостатък-непълна симетричност. Edelman и Gally (1965) предложиха свой вариант на тази схема, съблюдавайки изискването за симетричност на молекулата.

От доказателственият материал, получен от ензимните обработки на човешки гама-глобулин Tanford et al. (1965) предлагат следната конфигурация на молекулата. Според тях антитялото е изградено от три глобуларни участъка, свързани в единия си край в област, която вероятно съдържа споменатата по-горе единствена дисулфидна връзка между тежките вериги. Тази област е лесно достъпна за протеолитична атака.

Частта на антитялото, от която зависи специфичната му способност да се свързва с антигена, т.е. активният му център е разположен в тази “горна“ част на тежката верига, която при протеолитично разграждане остава във F_ab-фрагмента. Този участък на тежката верига или F_d-фрагмент, е по-слабо изучен. Известно е, че той има слаби антигенни свойства при имунизация с имуноглобулинова молекула. Смята се, че за F_d-частта е характерна значителна вариабилност.

При изучаването на активните центрове преки доказателства, че двете вериги участват в свързването на антигена са получени от опити с афинитетно белязане (Еdelman 1969). Този метод използва специфичността на пречистеното антитяло да свързва хаптена, носещ неговата характерна функционалната група, която образува ковалентни връзки с аминокиселините от активния център на антитялото.

В отсъствие на антиген големината на ъгъла между F_ab-фрагментите се ограничава от гъвкавостта на тежките вериги в т.н. шарнирна област на молекулата и от стерични фактори като взаимното отблъскване на намиращите се близо един до друг участъци на F_ab и F_c .В резултат на взаимодействие на антигена и антитялото в него настъпват изменения на третичната структура на F_ab - и F_c-фрагментите (Henney 1966). Аналогични изменения са наблюдавани при термична денатурация на F_c -фрагменти, изолирани от IgG (Henney and Ishizaka 1968).

Има доказателства (Edelman, 1970), че във всяка полипептидна верига на F_c-фрагмента, в антитялото се различават и по няколко линейно свързни глобуларни участъка, които са ограничени от периодически разположени дисулфидни връзки. В състава на тези компактни структури влизат съответните участъци на полипептидните вериги, характеризиращи се с хомоложност на първичната структура. Така, вариабилните по аминокиселинна последователност краища на леката и тежката верига са хомоложни помежду си и образуват V_L- и V_H-домени. Константните части на тежките вериги са разположени в три домена.Gally и Edelman (1970) представят структурата на човешкия IgG по следния начин: Fig.1 .

Многобройни са количествените изследвания върху съдържанието на имуноглобулиновите препарати. Известно е, че антителното съдържание, стерилността, стабилността и безвредността представляват важните показатели на изготвяните гама-глобулинови препарати за терапевтични и профилактични цели.

F_c -частта на молекулата е с важно функционално значение, тъй като нейната -верига носи въглехидратната съставка на молекулата (2.5% от общата маса). Тази съставка спомага за секрецията на белтъка през клетъчната мембрана. Известно е, че IgG преминава необичайно ефективно през плацентата, докато всички други белтъци на майката са изключени от феталната циркулация. F_c-частта на IgG носи и други функции като фиксиране към комплемента, склонност към полимеризация, определя степента на катаболизиране на съответната фракция, наличие на имуноглобулините в секрети и тъкани, сенсибилизация и ефективност при аглутинация.

Антигенните и функционални различия между IgG-молекулите са позволили те да бъдат разпределени в 4 подкласа. Техните свойства са описани в таблица 1:

 Таблица N 1.

 Компоненти на гама-глобулиновата фракция и някои техни характеристики.

Броят и положението на дисулфидните връзки между тежките вериги са характерни за всеки подклас (Frangion 1969,Grey1967).

От таблица 1 се вижда, че по-голямата част /71%/ от нормалния IgG се състои от IgG₁. Концентрацията на IgG₃ е ниска и поради високата му склонност към катаболизиране. Различните субкласове се характеризират с нееднакво сродство към комплемента. Степента на свързване на субкласовете към С¹ намалява в следния ред : IgG₃, IgG₁, IgG₂, IgG₄ /Edelman 1969/.
 АНТИКОМПЛЕМЕНТАРНА АКТИВНОСТ НА ИМУНОГЛОБУЛИНОВАТА ФРАКЦИЯ
Davis (1944) отбелязва, че много серуми, съдържащи ненормално големи концентрации на гама-глобулин са антикомплементарни. Гама-глобулинът, изолиран от нормален серум, притежава антикомплементарни свойства и тези свойства могат да се неутрализират като гама-глобулинът се смесва с приблизинелно равно количество албумин или с друга серумна фракция.

Nilsen and Svenag (1961) съобщават своите изследвания върху патологични серуми, съдържащи имунни комплекси и установяват, че образуването на агрегати на имуноглобулините по време на съхранението на серумите е източник на грешки при определяне на комплексите антиген-антитяло. Затова те използват описан по-рано от Jonson и Fromhagen ефект на снижаване на антикомплементарността на серума след нагряването му при 56^о С за 60 минути или при 63^о С за 20 минути. Нагряването на пречистен 7S IgG при 61-63^о С за 10-20 мин. предизвиква образуването на комплемент-фиксиращи агреати на IgG. Ако тези топлинно агрегирани IgG-препарати се нагреят отново при 56^о С за 50 мин. непосредствено преди теста, то антикомплементарната активност се намалява с 40-50%. При това не е наблюдавано различие в количеството на IgG-агрегатите в серума, определено чрез гел-филтрация върху Сефадекс G-200. Продължителното топлинно третиране променя агрегатите, образувани при съхранението им в серума или формирани от 7S IgG след кратък топлинен импулс, като областите, свързващи комплемента стават по-малко достъпни или са разрушени.

Има многобройни доказателства, че силните антикомплементарни свойства на имуноглобулиновите препарати се дължат на агрегатите на IgG. Christian (1960) е изолирал чрез фракциониране с натриев сулфат агрегатите от имуноглобулинов препарат и е доказал, че те фиксират комплемента. Същият автор е показал, че инжектирането на 20 мг фракция от агрегати на 200-грамово морско свинче води до 25%-но снижение на нивото на комплемента 1 час след инжектирането. Нормалното ниво на комплемента се възстановява след 48 часа. При същите условия неагрегираната част на препарата има минимални свойства да свързва комплемента. Той съобщава също, че интрадермалното инжектиране на имуноглобулин води до развитие на възпалителни процеси на мястото на инжектирането.

Frommhagen, L. and H. Fudenberg /1962/ потвърждават данните на Christian, C /80/. Те съобщават, че агрегатите на IgG имат седиментационни константи 9.5х10³ и могат да бъдат утаени чрез прибавяне на 0.62% натриев сулфат. Белтъкът, който остава в супернатантата е главно със седиментационна константа 7³ и не носи антикомплементарни свойства. Ако тази фракция бъде нагрята при 63^оС за 20 мин. се наблюдава образуване на силни антикомплементарни свойства. Добавянето на албумин или глобулин към имуноглобулиновия препарат преди нагряването предотвратява образуването на агрегати или не позволява развитието на силни антикомплементарни свойства, докато прибавянето на горните серумни белтъци след нагряването няма ефект.

По-късни изследвания, проведени от Waldensbuhl, M. и др. /1970/ показват, че някои реагенти агрегират IgG, но не индуцират комплемент-фиксиращи свойства. Те доказват, че такива реагенти /глутаров алдехид/ водят до агрегиране чрез образуване на междумолекулни връзки между хидрофилни групи. Органичните разтворители като етанол и ацетон водят до образуване на агрегати с антикомплементарни свойства. Тези вещества влияят върху хидрофобните области като откриват структури, които си взаимодействат и се стига до образуване на агрегати. Според авторите антикомплементарната активност зависи също и от концентрацията на разтворителите. При ниски концентрации не става агрегиране и съответно не се развиват антикомплементарни свойства. Етанолът трябва да бъде повече от 5% за да може да индуцира антикомплементарност.

Друго обяснение на придобиването на антикомплементарни свойства при агрегиране на IgG, допълващо посоченото по-горе, е хипотезата, че се променя конформацията на F_c–частта в процеса на димеризация или по-нататъшна полимеризация. Тази хипотеза намира приложение и при изследване на механизма на фиксиране на комплемента върху повърхността на еритроцитите. Фиксирането на една молекула комплемент изисква върху повърхността на еритроцита да са се свързали поне две молекули хемолитични антитела. Може да се предположи, че свързването на антителните молекули върху клетъчните рецептори води до конформационни промени в F_c – фрагмента, подобни на тези, протичащи при димеризация на молекулите в разтвор. В потвърждение Taranta и др. /1962/ и Ishizaka and Sugahara /1962/ установяват, че F_c – фрагментът на IgG, получен чрез разграждане с папаин след агрегиране фиксира комплемента за разлика от агрегирани F_ab-фрагменти, които не придобиват такива свойства.

Kомплемент-фиксиращите свойства се отстраняват чрез редукция на IgG с 0.1М меркаптоетанол като при разкъсването на дисулфидните мостове се нарушава структурата на F_c (Wiederman и др.)/1963/.

F_c–частта носи не само структурите, които са отговорни за комплемент-фиксиращите свойства, но и за фиксиране на антитялото върху кожата, свойството да фиксира ревматоидния фактор и някои Gm–детерминанти /тези, които не са в F_d на тежките вериги/. Освен това, Henny, C. and Ishizaka, K. /1968/ установиха, че F_c носи антигенните детерминанти на агрегатите, срещу които се образуват антитела. Оказва се, че малки F_c – агрегати /димери и тримери/ нямат антигенни детерминанти, налични в големите агрегати.

Ishizaka, Т. и др. /1959/ са изследвали биологичните активности на агрегираните човешки имуноглобулини от различни класове. Те намират, че IgG₄ и IgA и след агрегиране не увеличават комплемент-фиксиращите си свойства и кожната реактивност на морско свинче. Останалите имуноглобулини: IgG₁, IgG₂ и IgG₃ и IgGМ придобиват силна антикомплементарна активност след агрегиране. Агрегираните IgG₂ и IgG₃ предизвикват увеличен пермеабилитет на кожните капиляри на морско свинче, което IgG₁ и IgGМ не правят. Тези активности на агрегираните имуноглобулини са независими от типа на леките вериги и от Gm-факторите. Резултатите показват, че структурите на тежките вериги, които са от значение за фиксирането на комплемента са различни от тези, които са включени при фиксирането на IgG върху кожата на морско свинче при пасивна сенсибилизация.

Данните получени от Кульберг, А. Я. и др. /1972/ и Шмелева, Н. /1972/ показват, че, поради способността си да се свързват с комплемента, агрегираните IgG, появяващи се в кръвоносната система, могат да предизвикат съществени нарушения на хомеостазата. За характера на тези процеси може да се съди от опитите, при които е изследвана реакцията на зайци при венозно инжектиране на високопречистени хомоложен и хетероложен IgG в агрегирана и нативна форма. Инжектирането на агрегирания IgG предизвиква преходна пирогенна реакция и левкопения. Освен това спада нивото на ендогенния комплемент, а в редица случаи и на фибриногена. Нативният IgG е показал незначителна активност. Следователно, даже минимални количества агрегиран IgG при попадане в кръвоносната система могат да предизвикат изразени патологични реакции.

Антикомплементарните свойства на имуноглобулиновите препарати водят до ограничаване на клиничното им приложение и невъзможност да се прилагат венозно, тъй като може да доведе до сериозни реакции / Richerson, H. and P. Seebohm /1962/ Ellis, и Генчева Г. /1977/ също отдават нежелателните реакции при мускулно приложение на имуноглобулини на антикомплементарната активност на IgG-агрегатите. Stanworth, D. and C. Henney /1974/ чрез аналитично ултрацентрофугиране на търговски имуноглобулинови препарати установяват, че освен главния компонент 7S IgG в тях се съдържат около 15% 10S и около 20% -40S агрегати. Те определят, че не само високомолекулните агрегати са силно антикомплементарни, но и 10S са също много активни, докато 7S IgG има слабо изразени свойства в това отношение. Mackay, M. и др. /1973/ и Генчева, Г. /1977/ проучват дали определянето на антикомплементарната активност може да се използва като мярка за количеството агрегиран белтък и като средство за предсказване на серии, които биха могли да доведат до нежелателни реакции при инжектиране.

Miekka, S. and I. Gozze /1975/ са изследвали антикомплементарните свойства на имуноглобулиновите препарати като са насочили вниманието си към увеличаването на антикомплементарността по време на определението. Те установяват, че по време на извършване на серийните разреждания за определяне на антикомплементарната активност могат да се отчетат до 20-кратно завишени стойности за нея. Ако към IgG, обаче, се прибави албумин преди серийните разреждания, той предпазва от получаването на неверни резултати за комплемент-фиксиращите им свойства. Ефективни стабилизатори в това отношение са и полиетиленгликол, поливинилпиролидон, метил-целулоза, желатин и октанол. Авторите отбелязват линейна зависимост на антикомплементарната активност от броя на пипетиранията. Образуваната допълнителна антикомплементарност се дължи на малки количества високоактивни високоагрегирани белтъци. Изследователите стигат до заключението, че образуваната активност зависи поне от 4 фактора: 1. Брой на пипетиранията; 2. Концентрация на IgG; 3. Количество на албумина или други стабилизатори; 4. РН, което влияе на стабилизирането на имуноглобулините с албумина.

Muller-Eberhard, H. J. /1969/ публикува през 1969 година своите изследвания върху взаимодействието на С1 с имуноглобулините и техните агрегати. В първия етап на тази реакция става свързване на белтъка с първия компонент на номплемента /състоящ се от С1_q, С1_r и С1_s/ и се образува С1-естераза, което се следва от редица реакции, водещи до увреждане на клетките. Рецепторите за свързване на IgG и IgМ се намират върху компонента С1_q /202, 292/. Опитите на са показали, че нативния IgG взаимодейства с С1_q, но той не може здраво да свързва С1-комплекса, което е необходимо условие за вътрешномолекулното му престрояване и активиране на проензима С1_s. Здравото свързване на С1 става само с участието на имунни комплекси /150/ или от неспецифично агрегиран IgG /1969/.

Получени са данни за ролята на различни участъци на молекулата на IgG в активацията на системата на комплемента. Показано е, че F_c фрагментът, получен след хидролиза с папаин, в агрегирано състояние има комплемент-свързваща активност и може неспецифично да инхибира комплемент-зависимия лизис на сенсибилизирани еритроцити /1951/. Чрез изследване на комплемент-свързващите свойства на части на F_c е било показано, че те се носят от структура, намираща се в N-края на F_c- фрагмента. Utsumi, S. /1969/, т.е. в шарнирната област на IgG.

До скоро се смяташе, че F_ab –фрагментите сами или в комплекс с антигена и след неспецифична агрегация не свързват комплемента. Тези изводи са направени въз основа на опити, в които източник на комплемент е хетероложен серум на морско свинче. Но се оказва, че при инкубиране на заешки F_abc пресен заешки серум съдържанието на комплемента в него се снижава в сравнение с контролата. Данните на Кульберг, А. и др. /1971/ и Шмелева, Н. /1972/ показват, че при добавяне на увеличаващи се дози F_ab –фрагмент към един и същ обем пресен заешки серум, количеството на свързания комплемент постепенно нараства, стигайки до определено ниво и остава постоянно.

Разисквайки данните от литературата Кульберг, А /1973/ изказва следните предположения за ролята на агрегирането на IgG за здравото фиксиране на C1_q:

1. В молекулата на IgG комплемент-свързващият център е частично или напълно екраниран и става достъпен за рецепторните групи на C1_q в резултат на конформационни изменения на молекулата, настъпващи при взаимодействието на IgG с антигена или при неспецифичната му агрегация;

2. Процесът на агрегация на IgG се съпровожда от изменения в третичната структура на молекулата му и, в частност, от известно престрояване на комплемент-свързващия център, което води до увеличаване на неговото сродство към рецепторите на C1_q.

 ПРОМЕНИ НА ИМУНОГЛОБУЛИНОВИТЕ ПРЕПАРАТИ ПО ВРЕМЕ НА СЪХРАНЕНИЕТО ИМ.
Във връзка с оценяването на терапевтичната и профилактичната стойност на имуноглобулиновите препарати, които са били съхранявани продължително време, много изследователи са насочили вниманието си към промените, настъпващи в тези препарати.

След първите съобщения на Skvaril, F. /1960/ през 1960 г., че имуноглобулините могат да претърпят разграждане при съхранение в разтворено състояние, се появиха потвърждаващи съобщения от много автори Art, G. /1969/, E.Cohn /1976/, Skvaril F. /1968/ и др. Имуноелектрофоретичната характеристика на имуноглобулиновите препарати, направена от Мухина, Н. /1976/ също показва, че в някои от тях настъпва разграждане. Фрагментирането се отдава на наличие на следи ат протеолитични ензими /плазмин/ в препаратите. Данни на Бинева /1973/ говорят в полза на това предположение. Чрез прилагане на гел-филтрация и йонообменна хроматография Skvaril, F. and V. Brummelova /1968/ изолират F_ab и F_c фрагменти от имуноглобулинови препарати с изтекъл срок на годност. При това разграждането на препарати от плацентарни суровини става много по-бързо отколкото на препарати от донорска плазма. Подобна нестабилност на имуноглобулина е наблюдавана и в престояли по-дълго време серуми и препарати, получени чрез фракциониране с ДЕАЕ-целулоза. Този продукт се фрагментира за няколко седмици при 4⁰С. Sgouris, J. и др. /1962/ са наблюдавали разграждане на имуноглобулин, получен по метода на Oncley и съхраняван при 4⁰С в продължение на повече от 5 години. Sgouris, J. /1966/ съобщава и за проведен от него сравнителен анализ на препарати от различни производители. Получените данни са показали, че почти всички имуноглобулинови препарати се разлагат още преди да е изтекъл срокът им на годност. Данните на Холчев, Н. В. И др. /1972/ показаха, че имуноглобулинови препарати, които не са били лиофилизирани се разграждат по-бързо и в по-голяма степен. Painter, R. H. и сътр. /1973/ също съобщават, че имуноглобулини, изолирани от плазма се фрагментират преди да е изтекъл срокът на годност. James, K. и др. /1964/ и Oberdoerater, F. и др. /1972/ твърдят, че в човешките имуноглобулинови препарати най-напред настъпва спонтанно агрегиране и после фрагментиране по време на съхранението. Авторите предполагат, че агрегираният белтък селективно се атакува от протеолитичните ензими и картината на изменение по време на съхранението си се дължи на баланс между образуване и разграждане на агрегати. Dorrington, K. and Tanford, C. /1970/ са показали, че агрегирането на IgG става при съхранение на белтъчните разтвори както при ниски, така и при високи температури. Склонността към агрегиране не е пряко свързана с принадлежността на IgG към определен подклас, типа на леката верига или строежа на въглехидратната част. Очевидно, асоциацията на молекулите на IgG става за сметка на структури, разположени както в F_ab, така и в F_c частта и е съпроводена с изменение на имунохимичните им свойства.

Mosley, J. и др. /1968/ правят опит за клинична преценка на разградена серия имуноглобулин и на интактна серия. Те отбелязват, че фрагментираният имуноглобулин има протективен ефект 47% докато с интактния препарат протекцията е 87%. Клиничните опити на Adam, E. and Y. Skvaril /1965/ показват, че имуноглобулинови препарати, в които протеолизата е инхибирана с: -аминокапронова киселина са по-ефективни при профилактика на морбили. Никитина, В. r др. /1976/ също добавят инхибитори /-аминокапронова киселина или циклокапрон/ за предотвратяване на разграждането. Производителят е изправен пред необходимостта да изолира имуноглобулинови препарати без агрегати и фрагменти и белтъчните разтвори да останат такива по време на съхранението им. Във връзка с това трябва да се отговори на три въпроса:

1. Кои фактори допринасят за нестабилността на препарата?

2. Как може да се предвиди кои серии ще бъдат нестабилни?

3. Какво може да се направи за да се избегне разграждането?

Степента на фрагментиране се влияе от метода на фракциониране. Различните методи позволяват отстраняването на протеазите в различна степен. Painter, R. /1970/ и Painter, R. and J. Minta /1969/ намират връзка между рН, при което се отделя фр.III по Cohn и склонността на препарата към разграждане . Ако фр.III се отдели при рН=5.4 фрагментиране не настъпва или ако настъпва, то е в много малка степен, а ако изолирането на фр.III се проведе при рН=4.8 в последствие в имуноглобулиновите разтвори настъпва значително разграждане. Количественото определяне на F_ab и F_c в препаратите показва, че когато фр.III се утаява при ниско рН фрагментите са 20-40 мг/г белтък. Тези стойности се намаляват десетократно когато утаяването се проведе при рН=5.6, но при това добивите спадат с 15%.

Подходите за свеждане до минимум или предотвратяване на протеолитичното разграждане в имуноглобулиновите препарати са: а/ рН на крайния продукт да се остави 6.4. б/ Да се използва инхибитор на протеазите. в/ Да се направи селективна адсорбция на протеолитичния ензим A. Habeer/1977/; г/ Утаяване на фр.III при по-високо рН; д/ Съхранение на препарата в замразено или сухо състояние; е/ Инкубиране на разтвора на препарата при 45⁰С за инактивиране на плазмина G.Art /1969/

От казаното до тук става ясно, че са положени доста усилия за предотвратяване на разграждането в имуноглобулиновите препарати. От друга страна, обаче намалената антикомплементарна активност на препарати, претърпели частично разграждане представлява потенциална възможност за интравенозното им приложение.
 КРАТКА ХАРАКТЕРИСТИКА НА СУБТИЛИЗИНИ
 СПЕЦИФИЧНОСТ НА СУБТИЛИЗИНИ
Синтетични субстрати

Субтилизините притежават широка специфичност. Те могат да хидролизират пептиди, амиди и естери на някои аминокиселини. Обикновено са предпочетени аминокиселините с ароматен или поне хидрофобен характер и блокиран аминокрай (Glazer, 1967; Barel and Glazer, 1968).

Този факт навежда на мисълта, че S₁ субцентъра в субтилизините е хидрофобен. По-късно рентгиноструктурният анализ на субтилизин BPN^` потвърждава това и показва, че субстрат-свързващият център представлявя хидрофобен “улей”, а не хидрофобен “джоб”, както е при панкреатичните протеинази (Robertus et al., 1972). При хидролизата на споменатите естери на аминокиселините субтилизин Карлсберг проявява по-висока максимална скорост от тази на субтилизин NOVO и амилозахаритикус. Понеже процесът на ацилиране за естерните субстрати е по-бърз от този за деацилиране (Bender and Kedzy, 1965), по-високата максимална скорост на субтилизин Карлсберг показва, че процеса на деацилиране при него е по-бърз от този при субтилизин НОВО и амилозахаритикус.

Някои естери на мастни киселини с въглеродна верига, състояща се от 3 до 8 атома, също се хидролизират от субтилизин Карлсберг (GÜntelberg and Ottesen, 1954; Svendsen, 1976).

Morihaga и Tsuzuki (1960) определят степента на хидролиза след 20 минути и след 16 часа на няколко пептида с дължина от 2 до 5 аминокиселинни остатъка, чиито аминокрай е карбобензоксилиран, а карбоксилния им край в повечето случаи е амидиран. Субтилизин BPN^` хидролзира пептидни или амидни връзки, в които участват хидрофобни и/или ароматни аминокиселини с техните карбоксилни групи. Ензимът не разкъсва пептиди при D-левцинов остатък, което демонстрира стереоспецифичността на S₁-субстрат-свързващия подцентър.

Естествени пептидни субстрати

Субтилизините проявяват много широка специфичност при действието си върху пептиди и протеини. Специфичността на субтилизин Карлсберг е изследвана върху B-веригата на инсулина. Най-напред се хидролизира пептидната връзка след Leu-15, а след това следват Gln-4, Ser-9, Leu-15, и Tyr-26. Това се установява когато се използват ниски ензмни концентрации (Johansen et al., 1968; Morihaga and Tsuzuki, 1969). При използване на относително високи ензмни концентрации и по-дълъг период на хидролиза, се разграждат допълнително и връзките след Asn-3, His-5, Leu-6, Cys-7, Gly-8, Ser-9, Leu-11, Glu-13, Tyr-16, Leu-17, Val-18, Cys-19, Gly-20, Glu-21, Arg-22, Gly-23, Phe-24, Phe-25, Lys-29 (Tuppy, 1953; Haugaard and Haugaard, 1955; Meedon, 1955). Качествени различия мужду специфичностите на субтилизин BPN^{`</sup> и Карлсберг не са били установени, но все пак пептидните връзки след Ser-9 и Tyr-26 се хидролизират по-бързо в присъствие на субтилизин BPN<sup>`}, докато тези след Glu-4 и Leu-11 се хидролизират по-бързо в присъстви на субтилизин Карлсберг.

Ограничени хидролизи на ензими или протеини също са описани. Пример за това е хидролизата на овалбумин с помощта на субтилизин Карлсберг, при която след отделянето на един вътрешен хексапептид се получава плакалбумин (Ottesen, 1958). Това е реакцията, станала причина за откриването на първия субтилизин. При частична хидролиза на DNA-полимераза със субтилизин Карлсберг е възможно дори да се инактивира екзонуклеазната активност, докато полимразната активност остава непроменена (Brutlag et al., 1969; Klenow and Henningsen, 1970).

Високата специфичност проявена от субтилизините при някои ограничени хидролизи се отдава на стерични особености на субстрата. Предполага се, че най-чувствителните пептидни връзки се намират по повърхността и в клупове от подвижни части на полипептидните вериги на субстратите. Малките различия в специфичността на субтилизините Карлсберг и BPN^` се обясняват с различия в субстрат-свързващите подцентрове у двата ензима.

Nedkov (1992) проверява хидролзиращото действие на субтилизин DY върху ацетил-L-тирозинетилестер и казеин при различни рН. Установява се, че максимумът на протеолитично действие при субстрат казеин е в силно алкалната област. Авторът отбелязва и факта, че ензима показва значителна активност и в неутралната област-около 55% от максималната си активност. Поради платото на активността между рН 6.5 и 7.5 при субстрат казеин е възможно допускането, че препаратът се състои от две протеинази-алкална и неутрална, но е доказана неговата хомогенност. От това следва изводът, че намереният рН профил на активността е специфична характеристика на самият ензим. Характерният за ензима рН профил на активността при субстрат казеин е обяснен с различната достъпност на ензима до чувствителните пептидни връзки и с промяна на чувствителността на някои пептидни връзки у казеина с промяната на рН. Това разнообразие идва не само от от вида на двете аминокиселини, които образуват дадена връзка, а и от няколко съседни остатъци, които също се свързват специфично за определени подцентрове по повърхността на ензима (Shechter and Berger, 1967). Едно добро потвърждение на тази теория е факта, установен от Raykova et al. (1978), че Tos-Phe-CH₂Cl не повлиява активността на мезентерикопептидазата, докато Cbz-Ala-Phe-CH₂Cl е вече инхибитор и че Cbz-Ala-Gly.Phe-CH₂Cl е 35 пъти по-силен инхибитор от предишния.

Nedkov (1992) след ензимна хидролиза на казеин със субтилизин DY използва метода на Akabori et al. (1952, 1956), като получената смес от хидразиди и свободни аминокиселини нанася директно на колона за количествен аминокиселинен анализ. Това е станало възможно след установяването, че хидразидите на аминокиселините се разполагат като широк пик в областта на аргинина при стандартна процедура за количествено определяне на аминокиселини. Авторът установява, че субтилизин DY хидролизира пептидните връзки при най-малко 13 аминокиселинни остатъка, като в това число не влизат остатъците от триптофан, който при хидразинолиза се разпада, а също и тези на глутамин и аспарагин, които се превръщат в хидразиди и не могат да бъдат установени. Установен е и много интересният факт, че специфичността на субтилизин DY се променя съществено както от промяна на рН на средата, така и от промяна на диелектричната константа на средата, или от добавки, като натриев додецилсулфат, повлияващи образуването на хидрофобни връзки при протеините.

Morihaga et al. (1969) използвайки пептиди с различна дължина и тирозинов остатък в позиция P₁ показа, че субтилизин BPN^{`</sup> притежава най-малко 6 подцентъра. Това се установявя като се варират позициите на аминокиселинните остатъци в субстрата и се определя скоростта на хидролиза на чувствителната връзка. Например, голяма по обем странична верига (тирозит или фенилаланин), попадаща в позиция S<sup>`}₁ понижава скоростта на хидролиза, а в позиция S^{`</sup><sub>2</sub> я ускорява. Тези факти ясно говорят, че има значение местоположението на остатъците в позиции P<sup>`}₁ и P^`₂ на субстрата, което категорично показва, че те се свързват със съответните подцентрове на ензима.

Обобщавайки резултати от подобни изслезвания, Svendsen (1976) прави следните изводи:

1. На повърхността на субтилизин BPN^{`</sup> съществуват само два подцентъра (S<sup>`}₁ и S^`₂) настаняващи остатъци от напускащата група на субстрата.

2. Подцентъра S^`₂ трудно поема обемисти странични вериги.

3. Съществува подцентър S₄, който настанява P₄-остатъка на ацилиращата група от субстрата. Подцентърът S₄ е бил разпознат при заместване на L-Ala в P₄ с D-Ala.

4. Вторичните свързващи центрове влияят най-вече на скоростта на хидролиза на субстратите и в много малка степен върху силата на свързване.

5. Фактите, а) че Phe-Ala-Lys-хлорметилкетон, който предлага хидрофилна странична верига за хидрофобния подцентър S₁ и въпреки това инактивира субтилизин BPN^`, както и б) много широката специфичност на субтилизините навждат на мисълта, че са възможни повече от един начин на продуктивно свэрзване със субстрата.

Svendsen с помощта на пространствен модел на субтилизин BPN^` показва, че е възможно гръбнакът на полипептидната верига на субстратите да образува -структура с гръбнака на полипептидната верига на ензима, т. е. с остатъците Ser-125, Leu-126 и Gly-127, макар че при една от водородните връзки, трите атома, които я изграждат, не стоят на една права линия (Svendsen, 1976). Последният факт очевидно няма голямо значение за здравината на “огънатата” водородна връзка, тъй като Fersht (1974) твърди, че енергията на водородната връзка силно варира от рзстоянието между атомите и много слабо от ъгъла, сключен между правите, на които са разположени тези атоми. Споменатата -структура дава допълнително обяснение за широката специфичност на субтилизините.
 МОДЕЛИРАНЕ И ОПТИМИЗИРАНЕ НА ПРОЦЕСИ
Моделирането и опримизирането на даден процес най-лесно може да се постигне като предварително се изгради план на експеримента. Теорията на този вид задачи е била разработена през 1940 г., а практиеското им приложение започва да се прилага по-интензивно след развитието на компютърните технологии и датира от последните 10 години.

Експерименталните планове за осъществяване на някакво изследване се използват за изучаването на феномени от типа “черна кутия“. Теоритическото изучаване на задачата ни помага не само да опримизираме процеса но в много случаи и да вникнем в неговата същност. Информацията за наблюдаваните феномени се събира на базата на предварително направени опити или изчисления симулиращи опити.

Експериментаторът има за цел да определи параметрите, от които зависи отговора на процеса. Тези параметри са наречени “входове, действия или фактори” на “черната кутия”(виж Фиг. 2 ). Това са променливи величини, стойностите на които експериментаторът трябва да има възможност да фиксира на определени нива .
Случайни величини

Входни параметри

фактори или действия Отговори

 Фиг.2
Изходите на “черната кутия” са наречени отговори на системата. Те също трябва да бъдат дефинирани преди започването на експеримента.

Целта на експериментатора е да обясни функционирането на “черната кутия” въз основа на реализирани експерименти, оценявайки и отговорите на системата за нереализирани комбинации на входните параметри. По този начин трябва да се намери конфигурация на входните параметри, която решава проблема. Намирането на такава конфигурация може да стане по следните начини:

-Реализиране на всички възможни комбинации на факторите и избиране на комбинацията, даваща най-добър резултат. Този подход е най-трудоемък;

-Експериментаторът решава кои опити да бъдат поставени по емпиричен начин. В този случай рискът да не бъде покрит целия експериментален домен е по-голям;

-Директна оптимизация по Симплекс метода;

-Реализиране на избрани комбинации с цел моделизиране на изучавания феномен. Така полученият модел на изучавания феномен се използва за оценка на нереализираните комбинации и за избор на най-подходящата за решаването на даден проблем;

Дефиниране на модел. Ако дефинираме добре входните променливи, ограничавайки подходящо тяхното поле на вариране, физичният феномен се описва от функция на тези параметри, например с един полином. Тази функция вече е достатъчна за илюстриране на физичния феномен и чрез нея може да се оптимизира и управлява функционирането на системата. Статистическият метод, използван за установяването на модела е множествена линейна регресия.

Първоначално възприетия модел наричаме “обобщен линеен модел”. Този модел свързва количественият отговор на системата със входните променливи чрез една линейна функция, определена от нейните коефициенти.

y= f(v) = a₁v₁ +a₂v₂ +......+a_jv_j +....a_pv_p

Където:

y е наблюдавания отговор;

a_j са неизвестни коефициенти отговарящи на v_j. Целта е те да бъдат определени колкото може по-точно;

Три етапа са необходими за конструирането на един модел:

1.Определяне на коефициентите. То става чрез множествена линейна регресия. Търсените коефициенти трябва на бъдат такива, че получената функция да описва възможно най-добре получените резултати.

2.Търсене на най-подходящ подмодел. Състои се в избор на най-подходящите входни променливи измежду всички.

3.Анализ на стандартното отклонение. Избраните променливи от най-добрия подмодел са иерархизирани според тяхното влияние върху отговора. Това дава възможност да се елиминират незначимите фактори от модела,което го опростява. Избираме възможния минимален брой променливи.

Опити и комбинации. Опитът е физична реализация на една конфигурация на входните параметри на “черната кутия”(напр. конфигурация от определена температура, концентрация и рН), за която е измерена стойност на отговора (напр. добив на вещество). Кмбинация е отделна конфигурация на входните параметри, фигурираща в експерименталния план, и която може да бъде повторена. На всяка комбинация от плана отговаря един опит.

За да се определи модела трябва да се направят необходимия брой опити. Резултатите от опитите са “суровата материя” за множествената линейна регресия. Подразбира се, че съдържанието и качеството на модела се определя от самите данни.

Броят опити и тяхната структура определят формата и качествата на модела.

Брой опити. Изказваме хипотезата, че съществува поне един модел, описващ вярно функционирането на “черната кутия”, и че за неговото съставяне са необходими много по-малък брой опити от максимално възможния.

Колкото повече увеличаваме броя на действията и сложността на модела толкова повече опити трябва да бъдат направени. Броят опити е винаги ограничен поради икономически съображения и време. Моделизирането е алтернатива на извършването на всички възможни опити.

1.Повишаване на прецизността на предвиждане за нереализираните комбинации. Това има пряко отношение към качеството оптималност на експерименталния план.

2.Добро разделяне на влиянията на факторите при анализа на стандартното отклонение. Това се определя от качеството ортогоналност на експерименталния план.

Така техниките за конструиране на експериментални планове се предопределят от статистически методи за анализ.

1.Икономически съображения. Планирането позволява да се предвиди необходимия бюджет, необходимото време и необходимия персонал.

2.За оптимизиране на статистическите инструменти.Структурата на плана определя качествата на модела. Тъй като са рядко случаите, когато е възможно да се реализират абсолютно всички комбинации от фактори и техните нива е необходимо да се направи подбор. Техниките за създаване на експериментални планове се състоят в избор на ансамбъл от комбинации, чиято структура отговаря на определени статистически качества. Съществуват различни типове експериментални планове, имащи различни статистически свойства.

 ЦЕЛ И ЗАДАЧИ

Целите на настоящата дипломна работа бяха определени от поставения за изучаване проблем: Възможно ли е използването на имобилизиран Субтилизин DY за довеждане на съдържанието на високомолекулни комплекси на IgG в препарати за интравенозно приложение до стандартните норми, така че препаратите да не предизвикват активиране на системата на комплемента у пациентите?

За реализирането на тази задача бяха поставени следните цели:

1. Имобилизиране на субтилизин DY върху капронови влакна.

2. Моделиране и оптимизиране на процеса на имобилизиране на субтилизина.

3. Провеждане на начални опити с получените имобилизирани препарати за отчитане на въздействието им върху IgG разтвори за интравенозно приложение.

 МЕТОДИ И МАТЕРИАЛИ