РЕАКЦИЯ НА СВЪРЗВАНЕ НА КОМПЛЕМЕНТА

 РЕАКЦИЯ НА СВЪРЗВАНЕ НА КОМПЛЕМЕНТА

Буфер

Eпруветките с дефибринирана овнешка кръв се промива трикратно с буфер. Втората и третата промивни води трябва да са безцветни. Утайката от епруветките (еритроцити) се суспендира в работен буфер до 5%-на концентрация. 1ml от тази суспензия се лизира с 3ml вода. Мери се А₅₄₀=1.2-1.5. Измерванията се правят срещу вода.

5%-ната еритроцитна суспензия се смесва с хемолизин с определен титър в съотношение 1:1. Смесването става бавно, при непрекъснато разбъркване. Инкубира се 30 min при t=37⁰C, като се разклаща от време на време. Хемолитичната система се съхранява в хладилник и може да се използва само 1 ден.

Най-напред комплемента се разрежда с 1ml вода. От този разтвор се правят две разреждания с работен буфер: 1 към 16 и 1 към 20 . За всяко разреждане се прави контрола с 1ml работен буфер, 0.2 ml комплемент 1:16 или 1:20 и 1ml хемолитична система. Следва инкубиране за 30 min при 37⁰С на водна баня. Сместа престоява за 10 min в хладилник. Центрофугира се за 5 min при 1500 об/min. Мери се адсорбция при А₅₄₀. За титър се взема това разреждане, при което имаме 80% хемолиза.

Имобилизацията се провеждаше по видоизменена от нас методика на Б.Ф.Поглазов, Г.Г. Иванов, А.Л.Метлина(1976). Към определено количество капрон се добавя от 0.5 до 3.5N HCI. Частичната хидролиза протича за 30 до 300 мин при температура 30 до 60^оС. Става разграждане на някои пептидни връзки :

След това капроновият носител бе промиван с около един литър дестилирана вода ,а след това и с един литър 0.1 М NaHCO₃. Така обработеният носител престояваше за 45 мин. в 2.5% -ен и от 0.005%-ен до 1%-ен разтвор на гл утаров алдехид. Разтворите на глутаралдехида във всички случаи бяха приготвяни в 0.2 М карбонатен буфер с рН=9.4 . При това протича следната химична реакция:

След свързването на глутар алдехида с едната му функционална група за частично хидролизирания носител промивахме препарата многократно с дестилирана вода. След това препаратът беше накисван за 45 мин. в 0.5 М NaCl. След промиване на препарата с вода той беше поместван в разтвор на ензим с концентрация от 0.005 мг/мл до 150 мг/мл (първите опити бяха проведени с концентрации от 250мг/мл ензим). Ензимът бе оставен, за да се свърже с някоя от своите аминни групи за втората, свободна група на глутаровия алдехид. Разтворите бяха оставяни за два часа на стайна температура и за една нощ в хладилник.

Вижда се, че глутаровия алдехид служи за свързващ мост между капроновите влакна и ензимната молекула. След това препаратите бяха промивани с около един литър 0.5М NaCl. Когато се налагаше бе провеждана редукция на шифовите бази с NaBH₄.

Редукцията на шифовите бази бе проведена по модифицирана методика на Gary E. Means и Robert E. Feeney(1971).Редуктивното метилиране протича при 0^оС. Към имобилизирания ензимен препрат, поставен в 5 мл. 0.2М боратен буфер с рН=9 се добавя 0.015-50 мг/мл NaBH₄.

0.09М NaCl

долива се с дестилирана вода до 500мл и се наглася рН на 7.4 с 1N HСl.

ХОД НА РАБОТА

Препаратите с имобилизиран ензим се поставяха в епруветки с 2.5 мл. TRIS буфер. Към всяка епруветка бяха добавяни по 2.5мл 3%-ен разтвор на казеин. Епруветките бяха инкубирани на водна баня при температура 37^оС. На първата и тридесетата минута от инкубацията бяха вземани по 2мл. Те бяха добавяни към 3мл перхлорна к-на( HClO₄).

Преципитатът се оставя за 45мин. на водна баня при температура 37^оС като се разбърква от време на време. След това преципитатът се държи за 45мин. на стайна температура като също се разбърква от време на време. След филтруване се отнема супернатантата и се измерва съдържанието на белтък при A=275nm. При такава дължина на вълната се мерят цикличните АК като Trp,Tyr, Phe и др. По дефиниция 1CTAeg освобождава 0.1еq Tyr /min.

 Модифициран метод
ИЗЧИСЛЕНИЯ
А=E275 * 5 * 2.5 / 0.132 * 30
E275(проба) - E275(контрола) = Е275
СТА ед/мл =Е275 * 3.16

СТА ед / мг = СТА ед /мл * разреждането / V (специфична активност).

0.132 - оптична плътност () на 0.1 М Tyr при 275 пт.

5 и 25 са фактори на разреждане на трихлороцетното стъпало и инкубационното стъпало т.к. инкубационният период е 30 мин следователно се дели на 30 .

 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ

Капронът беше предпочетен за носител поради следните причини :

1. При използване на капрон като носител за субтилизин DY могат да бъдат избягнати дифузионните ограничения върху скоростта на ензимната реакция. Тези дифузионни ограничения не биха били голяма пречка при аналитичния етап от работата ни, но при евентуална нужда от разработване на пилотна или полупромишлена инсталация те биха оказали решаващо влияние върху получените резултати.

2. При евентуално напредване на изследователския процес (излизане от аналитичния етап) работата с такъв носител би била много улеснена. Има се предвид възможността за поставяне на имобилизирания върху капрон ензим като работна част на филтър, използването му под формата на мрежа или отложен по стените на тръба. А това представлява увеличаване на възможностите при вземане на технологични решения.

3. Не на последно място като причина е неговата ниска цена, достъпност и достъпните и лесни за изпълнение предварителни препарационни стъпки .

Капронът е бил използван от Б.Ф.Папазов, Г.Иванов и А.Метлина (1976) за създаване на моделна система за изучаване взаимодействието между актин и миозин. Видоизменена методика за ковалентно прикачване на белтък бе използвана за осъществяване на опитите в настоящата работа.

Началните опити бяха проведени със 0.250 г. капрон с прикачен към него глутаралдехид. Активираният носител беше разбъркван 2 часа на стайна температура в разтвор на субтилизин с концентрация 0.250 мг/мл (специфична активност 40 СТА-ед./мг) и оставен на спокойствие при 4^оС в продължение на една нощ.

Полученият препарат от имобилизиран субтилизин имаше активност 0.2 СТА ед./мг, която бързо спадаше след последващи промивки и измервания на активността.

 Фиг.1.

Наблюдаваният спад в активността на препаратите вероятно се дължи на разпадането на двойните ковалентни връзки между капрона и глутаралдехида и между глутаралдехида и молекулата на белтъка при стайна температура.

Обратимостта на тази реакция създава възможност и за свързване на други белтъчни молекули напр. на субтилизиновия субстрат, които също имат свободни NH₂-групи. Субстратът ще конкурира молекулите на ензима за място върху капроновите влакна и ще го измества, което ще доведе до понижение на активността на ензима.

Друга възможна причина за наблюдавания спад в ензимната активност е постепенното отмиване на ензима от капроновата матрица пoради обратимостта на описаната вече реакция.

Възможно е спадът да се дължи и на промяна в конформацията на ензимната молекула, поради това, че преди определяне на активността на свързания ензим, той беше подлаган на изсушаване между отделните промивки. Тъй като опитите са изпълнени в рамките на 24 часа беше изключена възможността микроорганизми да увредят свързания ензим.

Тези проблеми наложиха необходимостта от редукция на Шифовата база до получаване на проста връзка между азота и въглерода, която е вече стабилна в неутрална среда. Редукцията на шифовата база бе извършена с NaBH₄ по /..../Бяха получени следните резултати:

 Фиг. 2.

Поради това, че при различнште стъпки на промиване при приготвянето на имобилизирания препарат се губеше известно количество носител решихме да използваме друг тип капрон съдържащ носител под формата на мрежа. Парченцата мрежа бяха квадрати със страна 1 см. и тежаха по 25 мг.

След като установихме, че сме получили относително стабилен имобилизиран ензим ние насочихме вниманието си към създаване на модел за оптимизиране на процеса с цел неговото управление.

Поради липсата на каквато и да било първоначална информация свързана пряко с разработвания проблем ние решихме да включим в началните опити колкото може повече фактори, като в същото време държахме сметка и за броя на необходимите за това опити и за риска от избиране на тип експериментален план, определящ работа с модел, който не описва достатъчно добре процеса.

От логични съображения бяха избрани указаните в таблица No.3 пет фактора за изследване на влиянието им върху отговора на системата-ензимна активност:
 Таблица N.3.

 Избрани за наблюдение фактори влияещи върху активността на свързания ензим

Стойностите в експерименталния план са кодирани по следните формули :

Ниво	Истинска стойност
- 	Min
-1
0
1
	Max

След провеждането на опитите данните бяха обработени със специализирания програмен пакет STATGRAPHICS +. Стана ясно, че моделът, включващ абсолютно всички фактори, техните квадратични ефекти и техните взаимодействия съвсем не е най- добрия възможен. За това се наложи да бъде намерен по-добър подмодел. Различните подмодели бяха сравнявани по тяхните статистически показатели R² и R²_a. R² представлява коефициент на корелация между измерената стойност на наблюдаваната величина и предсказаната от изучавания модел стойност. Колкото по-добър е моделът толкова повече R² се доближава до 1 (или 100%). Другият наблюдаван показанел, R²_a представлява коефициент, при който се вземат под внимание както броя на опитите, така и броя на факторите включени в модела. Колтото по- висока е стойността на R²_a толкова по-добър е моделът. Така според посочените критерии като най-добър бе приет моделът:

R²=57,93% R²_a = 46.242 МАЕ (средна абсолютна грешка)= 0.06.

От тези показатели се вижда, че моделът обяснява само 58% от отговорите на системата. Това означава,че избраният модел от втора степен не е най-подходящият за обяснение на този процес. Вторият извод, който можем да направим е, че вероятно не са взети под внимание фактори, съществено влияещи на процеса на имобилизацията.

 Фиг. 3

 Фиг. 4

 Фиг.5

 Фиг.6

 Фиг.7

Това, че първият модел се оказа не достатъчно добър за да обясни измененията в стойностите на ензимната активност се наложи провеждането на допълнителни опити. Ришхме да проверим адекватността на линеен модел. А също така и влиянието на фактори невключени в първия. Бяха променени и интервалите на вариране на факторите.

 Избрани за наблюдение фактори влияещи върху активността на свързания ензим при втори модел.

Опитите бяха проведени по следният експериментален план:

Експерименталният план съдържа 19 опита. Той е от типа факториални планове. Характерно за тях е, че не се изпълняват всички възможни комбинации от фактори и техните нива, които в случая са 2⁹ = 512. За сметка на това, обаче влиянието на някои фактори може да се “смеси” с влиянието на взаимодействия между факторите от втори порядък. За това беше важно да се избере правилно т.н. “генератор на обърквания” или правилното подреждане на факторите по колоните на експерименталната матрица. Това е важен етап, защото от него зависи след това до каква степен ще имаме възможност за оценка на главните фактори. За успешния избор на генератор на обърквания много ни помогна информацията, получена от първия модел. Трите експеримента, проведени в центъра на експерименталната област са за да се определи грешката и отклонението.

След провеждането на опитите по същият начин, както бе посочено по-горе бе избран следния подмодел:

Активност (СТА ед.) = 0.115+0.042 х време(мин.)+0.024 х NaBH₄ (мг/мл)+0.025 х глутаралдехид(мг/мл )+0.014 х повърхност(см²)+0.084 х HCI (N)+0.068 х ензим (мг/мл) - 0.019 х йонна сила(мг/мл NaCI)+0.046 х време х HCI+0.011NaBH₄ х HCI +0.028 х глутаралдехид х HCI+0.065 х ензим х HCI.

Този подмодел показа, че обяснява 91.69% от измеренита активност. Неговият R²_a =78.64, а неговата средна грешка е 0.03.

 Фиг.6

 Фиг.7

 Фиг.8

На фигура 8 е показано влиянието на съставните фактори. Една от линиите е промяната на активността при промяна на първия фактор от ниво -1 към ниво +1, докато втория се задържа на ниво +1 . Другата линия представлява същото действие, но тогава втория фактор от двойката се задържа на ниво -1.

 Фиг.9

 Фиг. 10

 Зависимост на активността на имобилизирания ензим от от концентрацията на HCl и времето на третиране . Всички останали фактори са фиксирани на ниво 1.
На фигура 9 е показана ензимната активност като функция от концентрацията на HCI и концентрацията на добавяния ензим. На фигура 10 също е представена активността като функция от концентрацията на солната киселина и времето. Показаните стойности на активността са най-високите в интервала. В същото време избраните фактори за контрол на процеса са по-лесно управляеми. Поради тази причина избрахме този варианта да влияем на ензимната активност, като варираме факторите HCI и време. Проверката на адекватността на модела беше направена в три точки, в които модела прогнозира активности : 0.1СТА ед. ; 0.3 СТА ед. и 0.5 СТАед . Това са последните три комбинации от експерименталния план. На таблица N^o6 са показани получените резултати, които потвърждават адекватността на модела.
 Таблица N 6

След като се убедихме, че моделът е работещ и можем да произвеждаме имобилизирани препарати с желаната от нас активност преминахме към следващия етап : определяне на активността на имобилизирания ензим спрямо имуноглобулинови компплекси.

Парче капронова мрежа с казеинолитична активност 0.5 СТА единици бе поставено в 5 мл. разтвор, съдържащ имуноглобулинови агрегати. Концентрацията на разтвора на IgG беше 10мг/мл. Бяха вземани проби от 0.2мл. на всеки кръгъл час до петия, следващата проба бе взета на двадесет и четвъртия час, а последната след една седмица. Пробите бяха изследвани на HPLC апарат Perkin  Elmer. При този експеримент не беше наблюдавано намаление в количеството на агрегатите. Поради това следващият опит бе проведен с 10 пъти по-голямо количество от имобилизирания препарат, т.е. с обща казеинолитична активност 5 СТА единици. Пробата беше оставена за 24 часа в разтвора на IgG. Беше направен тест за антикомплементарна активност и такава не беше установена. Данните са приложени в табл. 5. От тях се вижда, че в третирания препарат количеството на IgG-агрегатите е понижено до допустимите от СЗО 3%.

Първоначално съществуваха съмнения за това дали имобилизиран ензим, който е обездвижен до известна степен върху матрицата ще може да разгради относително трудно подвижни високо молекулни белтъчни агрегати по такъв начин, че получените фрагменти от една страна да не предизвикват анафилактична реакция (имунен отговор) и от друга да запазят имунните си свойства. Предвид големите предимства, които се откриват при положителен отговор на горния въпрос, т.е. при евентуална възможност имобилизирани ензими да могат да се използуват за понижаване концентрацията на имуноглобулиновите агрегати решихме да пробваме. За щаствие, резултатите от настоящата дипломна работа показаха, че имобилизирани ензими, чието отделяне от имуноглобулиновия препарат не представлява никакво затруднение могат да бъдат използувани за привеждане на имуноглобулинови препарати с високо съдържание на агрегати в такива, които отговарят на изискванията на Световната здравна организация.