За оценка на ефикасността на ивмп и определяне напрежението на имунитета в серуми от опитни животни



Дата16.10.2017
Размер54.42 Kb.


Институт за контрол на ветеринарномедицински продукти

Версия: 02/ 11.06.2009г.

Лист


Стандартна оперативна процедура 031
ИЗВЪРШВАНЕ НА РЕАКЦИЯ МИКРОСТЕПЕННА АГЛУТИНАЦИЯ

Изменение ......./……………






  1. ЦЕЛ

Тази стандартна оперативна процедура се прилага за качествено и количествено определяне титъра на антителата в серуми от ваксинирани опитни животни или в имунни серуми, както и за изясняване на съаглутинацията, когато един микроорганизъм се аглутинира от няколко имунни серуми.



  1. ОБХВАТ

За оценка на ефикасността на ИВМП и определяне напрежението на имунитета в серуми от опитни животни.



  1. ЧЕСТОТА НА ПРИЛОЖЕНИЕ

Методът се използва при оценка на ИВМП, когато в неговата документация микростепенната аглутинация е посочена като метод за доказване на неговата ефикасност, и като скрининг тест.



  1. АПАРАТУРА И МАТЕРИАЛИ

Апаратура: Автоклав, инкубатор, микроскоп, хладилник, центрофуга

Помощни материали: Микротитьрна плака (U-образните са за предпочитане, но могат да се използват също и V-образни плаки), стерилни епруветки, Епендорф епруветки, Микропипети, многоканални пипети, Ерленмайерови колби;

Консумативи: Физиологичен разтвор - 0,9% NаС1, pH 7,1 5; Антигени (живи или убити бактериални суспензии); Хиперимунни серуми - референтни положителни (+) и отрицателни (-) серуми; Контролни нулеви серуми; Серуми от ваксинирани животни; Стандарти;



  1. ОТГОВОРНОСТИ

Ръководителят на лабораторията носи отговорност за извършване на реакцията.


  1. ПРОЦЕСНА КАРТА






  1. ПРОЦЕДУРА

Действие

От кого се извършва

Кога се извършва

Как се извършва

1. Накапване в микротитърна плака


лаборант




Във всяка ямка на микротитърна плака с микропипета се поставят равни обеми физиологичен или друг разтвор, посочен в досието на продукта (например РВS). Стандартното количество на разтвора е 50ml или 100ml, освен ако не е посочено друго количество в досието на продукта.


2. Добавяне на серуми


лаборант




Във всяка ямка се прибавя еднакво количество, от тестваните или от контролните серуми, съответстващо на обема на физиологичния разтвор, с изключение на ямките, определени за контроли на антигена

3.Получаване на двукратни разреждания


лаборант




Съдържанието във всяка ямка се хомогенизира и от нея се прехвърля по 50 ml (100 ml) в следващата, стояща в дясно от предходната ямка, разположени на един и същ хоризонтален ред.

От последната ямка се изхвърля съответното количество (50 ml или 100 ml), за да бъдат равни обемите във всички ямки. Така се получават двукратни разреждания (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024, 1:2048, 1:4096), освен ако не се изискват десетократни или други разреждания.




4. Накапване на антиген1


лаборант




Накапва се аналогично количество от разредения антиген (50 ml или 100 ml) във всяка микроямка, без да се включват ямките, определени за контроли на положителните и отрицателните серуми.

Същото се повтаря за толкова редове от микротитърната плака, колкото са необходими за изпълнението на реакцията.




5. Покриване с парафилм

лаборант




Плаката се покрива с парафилм и внимателно се разклаща.

6. Инкубиране


лаборант




В термостат при 35°С -37°С/18-24 часа, след което престоява на стайна температура 2 часа.

7. Отчитане на резултатите


Инспекторът, извършващ анализа




Отчитането се извършва с просто око или с вдлъбнатoто огледало на микроскопа, като се наблюдава откъм дъното на плаката, в присъствието на лека светлина 2


1 За антиген се използват: живи култури щамове микроорганизми, използвани в хиперимунизацията или при изготвянето на ваксини. Те се посяват на твърди хранителни среди и се култивират при 33°-35°С/ 18-24 часа. Агаровите култури се отмиват с физиологичен разтвор и се стандартизират до необходимата гъстота -1,2 или 3 милярда бактериални тела в 1ml по Мас Fагlаnd; убити бактериални суспензии (диагностикуми), приготвени (чрез химична и термична обработка, според термостабилността на антигена - О, Н и К антигени) и титрирани
2 При добавяне на равен обем бактериални суспензии към серумните разреждания, се получава удвояване на разреждането, затова крайното отчитане на реакцията е с едно разреждане по-високо.

Най - напред се отчитат контролите. Реакцията е протекла правилно, когато липсва спонтанна аглутинация в контролата на антигена и отрицателния серум, а аглутинацията в контролата на положителния серум е добре изразена. При положителна аглутинация аглутинатът покрива цялото дъно във вид на чадърче и надутаечната течност се избистря. При отрицателна аглутинация бактерийната суспензия се утаява копчевидно и течността остава мътна. Титърът на серума е максималното разреждане, при което все още всички бактерии са слепени на купчинки на дъното на ямките в микротитърната плака.

Ако за микростепенната аглутинация е използвана суспензия от бактерии, на които ресните са разрушени, се отчита О - аглутинация. Н - аглутинация се отчита, когато соматичния антиген на бактериите е бил отстранен, а при използване на К- антигени, се отчита К -аглутинация.

За изразяване силата на аглутинацията в отделните ямки, се използват следните обозначения:

++++ - при положителна аглутинация, аглутинатът покрива цялото дъно във вид на чадърче и надутаечната течност се избистря;

+++ - при почти пълно избистряне на суспензията, тъй като по-голямата част от бактериите са аглутинирани;

++ - при аглутиниране на около 50% от бактериалните тела, при което мътнината е редуцирана на половина, в сравнение с контролата;

+ - когато течността е мътна, поради аглутинация на малка част от бактериите;

- отрицателна реакция, при липса на аглутинация и мътнина, подобна на контролата


Разработил:
ИННОВА ЕООД

Утвърдил:
(име, подпис)

01/06/2009 г.


11/06/2009 г.







База данных защищена авторским правом ©obuch.info 2016
отнасят до администрацията

    Начална страница