Акад. Кирил Братанов” Българска Академия на Науките

„Акад.Кирил Братанов”

При подбора разплодните животни трябва да се преценяват по следните критерии:

• 
  мъжките кучета да са достигнали полова зрялост- най-подходяща възраст за използване на кучетата за разплод е след 16-18 месечна възраст до 6-7 години.
  
• 
  Външните белези- животните да отговарят на стандартите за определената порода и да са физически добре развити.
  
• 
  При провеждане на тестове за полова активност кучетата да показват добре проявено libido sexualis.
  

• 
  Преди започване на работа е задължително на всички животни да са проведени изследвания за бруцелоза.
  
• 
  Преди получаване се провежда профилактичен тоалет с промивка на препуциума с 1% риванол или калиев перманганат.
  
• 
  За активиране на половите рефлекси се използва женско куче, което е разгонено, като се допуска фиксирана за няколко минути при мъжкото животно.
  
• 
  Инструментариумът за получаване е подобен на този, с който се борави при другите видове животни.
  
• 
  Получаването на спермата става чрез метода на мастурбация за период от 15-20 минути, през което време спермата се отделя фракционно. Обикновено за работа се използва втората, богата на сперматозоиди фракция. Обемът на отделните фракции варира при дребните, средните и едри породи кучета:
  

1. 
   I-ва фракция от 0.25 до 4.0 мл с pH- 6.07
   
2. 
   II-ра фракция от 0.25 до 12.00 с pH-6.10
   
3. 
   III-та фракция от 1.00 до 25.00 мл с pH -7.20.
   

-Цветът на спермата е млечно бял, с лека опалесценция.

-Миризмата е специфична и не се допуска присъствието на чужди примеси

-Обемът на еякулатите варира от 0.5 - 1.25 мл за дребните породи кучета до 25 - 30 мл за едрите.

-нормалната подвижност е 80%, като се определят % сперматозоиди с праволинейно настъпателни движения;

-патологичните и мъртви сперматозоиди не бива да надвишават 20%;

-аглутинация не се наблюдава;

-концентрацията на сперматозоидите варира от 233.30 до 301.40 x 10⁶ клетки в мл;

-pH е 6.4 - 6.8;

- за работа не се допускат еякулати с контаминация;

- морфологично измененията на акрозомите на сперматозоидите при свежа сперма варират от 4.60% до 9.50%. Еякулати, показващи по-високи стойности не бива да се използват за работа.

-Определяне преживаемостта на сперматозоидите при 37ºC.

-Морфологични изследвания на натривки- състояние на акрозомите и интегритет на фосфолипидните мембрани.

-Провеждане на цитохимичен тест за акрозомална протеолитична активност.

-Биохимични изследвания на сперматозоидите и спермалната плазма.

-Микробиологични изследвания.

-Провеждане на прогностични тестове за оплодителна способност и криотолерантност на гаметите
БИОТЕХНОЛОГИЯ ЗА КОНСЕРВАЦИЯ НА СПЕРМА ОТ КУЧЕТА

Използват се две основни биотехнологии за съхранение на спермата- съхранение на 5ºC и криоконсервация

За постигане на добри резултати при съхранение при 5ºC, спермата се разрежда 1+3 с подходящ разредител.

Изследвани са редица буфери и среди, и ролята на захарите и електролитите върху преживаемостта на сперматозоидите. Установено е, че оптимално добрите среди съхраняват подвижни сперматозоиди до 12-я ден. Една от средите, с които се постига висока преживаемост на сперматозоидите има следното съдържание: натриев цитрат 1.42, калиев цитрат 0.08, глюкоза 1.25, глицерин 4%, жълтък 20%, pH-6.6.
КРИОКОНСЕРВАЦИЯ НА СПЕРМА ОТ КУЧЕТА

Прилагат се две основни технологии за криоконсервация на сперма от кучета: криоконсервация под формата на гранули по метода на Нагазе-Нива и криоконсервация в алуминиеви туби от 5 мл, разработена в секцията по „Репродуктивни биотехнологии и криоконсервация на половите клетки” – ИБИР, БАН от М. Иванова- Кичева 1994.

- След получаване и преценка спермата се разрежда 1+2 със захарозно-лактозна среда.

- Еквилибрацията е 220 минути при 4ºC

-Пробите се поставят в ледена баня и се пристъпва към замразените при 79 ºC- температурата на сухия лед.

-Накапват се гранули с обем 0.25 мл и след 10-15 мин се поставят в течен азот при - 196 ºC.

Размразяване на гранулите

Изборът за използване на среди за деконсервация е голям. Могат да се прилагат: 0.9% разтвор на NaCl, 2.8% разтвор на Na цитрат или модифицирани обогатени среди като Белтсвил среда, Трис- глюкозни среди и други.

Размразяването се извършва в 0.5 мл затоплен до 55 ºC разредител при усилено разклащане за 5-8 секунди, след което спермата се съхранява при 37 ºC до използването и.

Описание на метода за криоконсервация на сперма от кучета в алуминиеви туби от 5 мл:

- След получаване и преценка спермата се разрежда 1+1 с трис-фруктозна среда или модифицирана трис- глюкозна среда-Farstad W 1989, Oetle TT 1986.

- Еквилибрацията е 240 минути при 4ºC

- Пробите се поставят в ледена баня и се наливат в предварително охладени туби- по 5 мл всяка туба. След затварянето се пристъпва към замразяване.

- Замразяването е върху парите на течен азот при -130 ºC за 15-20 минути, след което тубите се потапят в течен азот.

Размразяване на тубите

Методът за размразяване е разработен от колектив Иванова- Кичева М., Бобадов Н- 1994.

• 
  Размразяването се извършва във водна баня при 60 ºC за 15-20 секунди при усилено разклащане, като преди това тубите са отворени, но се внимава да не попадне вода в тях.
  
• 
  След размразяване спермата се съхранява при 37 ºC до използването и.
  

- Оптималното количество сперматозоиди, необходими за провеждане на успешно оплождане е 9-12 x 10⁸ сперматозоида за една доза, като % на сперматозоиди с активно настъпателно движение да е в границите на 35-40%.

Половата зрялост при женските кучета настъпва между 4-6 месечна възраст, като в зависимост от породата и начина на хранене може да се прояви и по-късно до 8-10 месеца. Оптималната възраст за заплождане женските кучета е между 3-4-я еструс до 6-7 годишна възраст. Кучето е сезонно моноциклично животно. Женските животни се разгонват обикновено пролет и есен. Половият цикъл е характерен с 4-те фази- проеструс, еструс, метеструс и анеструс. Продължителността на отделните фази на половия цикъл е следната:

-проеструса варира от 5 до 10 дни, средно-9 дни

-еструса от 3 до 7 дни, средно 3-5 дни

-метеструса -90 дни

-анеструса- средно 75 дни.

Определянето на овулацията става чрез преценка на:

• 
  Поведението- животните са неспокойни, променят апетита и поведението си спрямо другите кучета, вдигат опашка с охота, позволяват да бъдат заскачани и оплождани
  
• 
  Клиничните признаци и промени на външните полови органи- влагалищните изтечения просветляват, срамните устни са набъбнали максимално и леко зачервени
  
• 
  Провеждане на вагинална ендоскопия- по метода на Jeffcoate 1989, позволява чрез промени в температурата и електропроводимостта да се определя оптималното време за оплождане.
  
• 
  Измерване нивото на хормоните - при достигане на зрялост на фоликулите, когато са във фаза преди разпукване се наблюдават високи нива на естрогените, които инхибират секрецията на FSH и стартират отделянето на лутинизиращия хормон (LH) от предния дял на хипофизата, което води до овулация. За разлика от другите животни кучката е нетипична в две отношения - първо преди овулация има ниски нива продуциращия се от предовуларните фоликули прогестерон и те заедно с падащите естрогенни нива са причината за еструса. Характерно за този вид е, че проеструса и еструса протичат последователно и трудно се отдиференцират. В тази насока краят на проеструса и началото на еструса са съпроводени с промени на прогестерона в кръвта, които достигат до 0.5 ng/ml и се задържат на това ниво, докато нивата на естрогените паднат. Друга отличителна черта е дълъг период на доминиращ прогестерон, вероятно защото няма лутеолитичен фактор, който да се продуцира от матката на кучката.
  
• 
  Изследване на цитонамазки от вагинален секрет - в периода на проеструса се установяват червени кръвни клетки, единични кератинизирани клетки, левкоцити и клетъчни остатъци. В периода на еструса количеството на кератинизираните клетки нараства, липсват левкоцити, има единични еритроцити и клетъчни остатъци.
  
• 
  По метода на Concannon (1989) се определя овулацията по време след LH пика:
  

Зреене на яйцеклетката- 4-5 дни (2-3 дни след овулацията)

Най-добра заплодяемост- 0-5 дни

Имплантация-18 дни

Раждане- 64-68 дни
ИЗКУСТВЕНО ОСЕМЕНЯВАНЕ НА ЖЕНСКИ КУЧЕТА
Разработени са два основни метода на изкуствено осеменяване на кучета- Иванова-Кичева М. 1996:

-Интравагинален и интра утеринен метод. Поради някои особености в анатомията на половия апарат, начина на протичане на половия цикъл и осъществяването на копулацията, както и наблюдаването на така наречения феномен „заклещване”, е необходимо за постигане на добър резултат да се прилагат методи, които оптимално да наподобяват естественото заплождане.

От проведени от нас изследвания е установено, че използването на изкуствено осеменяване по метода на интраутеринно осеменяване, резултатите са достоверно по-добри от интравагиналния метод, като заплодяемостта достига до 83.47%- за интраутеринния метод, при 37.50%- за интравагиналния метод.
ИНСТРУМЕНТАРИУМ ЗА ИЗКУСТВЕНО ОСЕМЕНЯВАНЕ

За провеждане на ИО са необходими спекулуми с различни размери, в зависимост от породата кучета-22/3 за едри породи, 18/1- за средни и 8.5/0.5- за дребни кучета.