Аналитично охарактеризиране и фармакологична оценка на наноразмерни системи за пренос на цисплатин

на дисертационния труд на Екатерина Венциславова Стоянова, редовен докторант към катедра Аналитична химия във Факултета по химия и фармация на Софийския университет “Св. Климент Охридски” по професионално направление: 4.2. Химически науки, научна специалност Аналитична химия за присъждане на образователната и научна степен “доктор” на тема:

Аналитично охарактеризиране и фармакологична оценка на наноразмерни системи за пренос на цисплатин

от доц. д-р Елена Бориславова Каменска-Карабоикова, член на научното жури

Дисертационният труд включва 31 фигури, 11 таблици и 182 литературни източника. Тематичното направление на дисертацията е повече от актуално и значимо, не само в социален аспект, а най-вече с опита си да се разработят нови полимерни носители на цитостатика цисплатин, притежаващи висок капацитет на натоварване, стабилност и насочено освобождаване, водещо до ефективно натрупване в туморни клетки. Изследванията в тази посока са истинско предизвикателство, защото проблемите са многостранни и изискват комплексни, интензивни разработки до създаването на лекарствена форма на цисплатин. Трябва да се подчертае, че докторантката Стоянова много точно е избрала правилния подход към създаване именно на нови полимерни лекарствени системи на цисплатин с насочен пренос и акумулиране в туморни тъкани, водещ до висока терапевтична активност.

Литературната справка е написана систематично и прецизно. Последователността и структурирането на литературните данни показва, че докторантката много добре познава и анализира всички проблеми, произтичащи както от синтеза и характеризирането на различни полимерни носители на цисплатин, така и тези, породени от високата му цитотоксичност и възникващата туморна резистентност. Последните реакции водят до значително понижаване на терапевтичната ефективност на цитостатика. Докторантката Стоянова е систематизирала литературните данни по ясни критерии, като е представила резултати за синтеза и свойствата на полимерни носители на цисплатин, включващи функционализирани съполимерни наночастици и филми, липозоми, мицели и дендримери. Детайлно са представени данни за структурата и свойствата на цисплатин, за механизма на действието му като цитостатик и за протичащите нежелани процеси при химиотерапията. Така представената литературна справка дава възможност на читателя бързо и лесно да тълкува описаните резултати. От проведената дискусия на литературните данни и направените от нея заключения, Екатерина Стоянова точно и ясно е формулирала основните цели и задачи на своя дисертационен труд.

Експерименталната част на дисертацията е точно структурирана и представя методите за синтез и характеризиране свойствата на полимерен носител на цисплатин-звездовиден съполимер от типа ядро-обвивка (ПСПА 38, ПСПА 42 и ПСПА 58). Описани са методите за имобилизиране на цисплатин в звездовидните съполимери ПСПА38 и ПСПА58 и на поддържащото му освобождаване от тези носители.

Представен е методът за получаване на пегилиращия агент- ПЕГ-цисплатин. Описани са методиките на пегилиране на звездовидния съполимер ПСПА42 с ПЕГ-цисплатин, на натоварването му с Pt(II) с различни концентрации- ПЕГ-ПСПА42-Рt1 и ПЕГ-ПСПА42-Рt2 и на поддържащото освобождаване на неговите комплекси от натоварените носители.

Молекулномасовите, структурните и морфологичните характеристики на изследваните непегилирани и пегилирани звездовидни съполимери натоварени с цисплатин са определени чрез ¹Н- ЯМР и дифузионно-подредена ЯМР спектроскопия, гел-проникваща хроматография, атомно-силова микроскопия, динамично светоразсейване и FT-ИЧ. Концентрацията на Рt(II) в разтворите на звездовидните съполимерни носители и на диализатите им е определена чрез индуктивно-свързана плазма с оптично-емисионна спектрометрия (ICP-ОЕS) и електротермична атомноабсорбционна спектрометрия (ETAAS). Предложен е метод за оценка на противотуморната активност на наноконюгати на цисплатин с непегилирани и пегилирани звездовидни носители. Разработен е метод за изследване на вътреклетъчното акумулиране на наноконюгати на цисплатин ПСПА-Рt и ПЕГ-ПСПС-Рt в различни туморни клетъчни линии. Не познавам лично изследователската работа на докторант Стоянова, но мога да кажа на основата на описаните експериментални методи, че тя притежава отлични познания и умения и на тази основа е изпълнила голям обем от различни изследвания и анализи и компетентно ги е представила.

Получените резултати и тяхната дискусия в дисертацията представя един задълбочен творчески процес. Анализът им показва, че основната цел на работата е изпълнена успешно. Резултатите от синтеза и изследването на специфичните характеристики на получения нов звездовиден съполимер доказват, че макромолекулата му е изградена от ядро от поли(р-йодометил стирен) и рамена от поли(натриев акрилат). Установено е, че синтезираният звездовиден съполимер ПСПА с различни състави е наноструктуриран. Резултатите от обратимото пегилиране на звездовидния съполимер ПСПА42 с пегилиращия агент ПЕГ-Рt(II) показват, че структурата на ПСПА-ПЕГ-Рt конюгатите се състои от рамене от поли(натриев акрилат) свързани с ПЕГ чрез цисплатин.

Дискусията на резултатите и направените изводи на тази основа свидетелстват, че дисертантката е натрупала опит и умело и правилно комбинира и тълкува данните от различни методи за анализ.

I. Синтезиран е нов наноструктуриран звездовиден съполимер с различни състави ПСПА38, ПСПА42 и ПСПА58. Тези съполимери на основата на уникалния си състав имат селективни свойства, които им позволяват да се използват като носители на цисплатин. Трябва да се подчертае, че докторантката успешно е изучила и след това е използвала прекурсора- звездовидния съполимер ПСПБА, предоставен от д-р Ковалчук. Отбелязвам този факт към приносите, защото точното тълкуване на резултатите от синтеза и изследването свойствата на този прекурсор има определящо значение при разработката на нов дизайн на носители на Pt(II). Подходящият състав и специфичната структурна организация на звездовидните съполимери ПСПБА с ядро от силно разклонени олигомерни вериги от поли(р-йодометил стирен) и рамена от поли(t-бутил акрилат), получени чрез контролирана радикалова полимеризация, осигуряват онази необходима основа за бъдеща целева модификация на фукционализираните макромолекули.

Установени са следните специфични свойства на новополучените звездовидни макромолекули, които ги определят като носители на цисплатин:

1. Звездовидните носители са водоразтворими при всички стойности на рН и са наноразмерни с тясно разпределение на наночастиците по размер.

2. Карбоксилатните групи в звездовидните съполимери имобилизират комплекси на цисплатин чрез лиганден обмен или чрез вътре- и междумолекулно омрежване. Постигната е ефективност на имобилизиране с цисплатин  80% като количеството му е 45% от масата на натоварените частици.

3. Поддържащото освобождаване на цисплатин от звездовидните съполимерни носители във физиологичен разтвор и в клетъчна среда е важен резултат за пасивното му насочване към туморни клетки.

4. Имобилизираният цисплатин в звездовидните конюгати ПСПА38-Pt и ПСПА58-Pt притежава по-ниска цитотоксичност в сравнение с тази на неимобилизирания. Този резултат е значим, имайки предвид високата му цитотоксичност.

5. Акумулирането на цисплатин в туморните клетки показва, че в тях прониква както освободеният, така и неосвободеният цисплатин от полимерния комплекс.

II. Предложен е нов метод за обратимо ПЕГилиране на звездовидния съполимерен носител ПСПА42, изграден от същото хидрофобно ядро- поли(р-йодометил стирен) и рамене от хидрофилния поли(натриев акрилат) свързани с веригите на ПЕГ чрез цисплатин. Установени са следните характерни свойства на ПЕГилираните полимерни-цисплатин конюгати:

1. Размерът на наночастиците на пегилирания звездовиден ПЕГ-ПСПА42 нараства и обвивката от ПЕГ пречи на междумолекулното им омрежване. Този процес силно стабилизира водни им разтвори за повече от 3 месеца.

2. Пегилирането на ПСПА42 води до по-висока скорост на поддържащо освобождаване на цисплатин в сравнение с непегилираните съполимери.

3. Пегилираните полимерни-цисплатин конюгати ПЕГ-ПСПА42-Pt имат по-добра инхибираща активност спрямо растежа на туморни клетки от различни линии.

III. Разработени са нови аналитични процедури на основата на ICP-OES и ETAAS за определяне количеството на комплекси на цисплатин в три различни по своята химична природа среди:

1. Определен е капацитетът на натоварване с цисплатин на непегилирани и пегилирани носители в присъствието на матрица от поли(акрилова киселина).

2. Определена е степента на поддържащо освобождаване на комплекси на платина(II) от непегилирани и пегилирани носители в присъствие на PBS.

3. Определена е противотуморната активност на свободен и имобилизиран цисплатин в разложени туморни клетки.

Дискутираните резултати доказват, че новосинтезираните наноструктурирани непегилирани и пегилирани звездовидни съполимери могат да се използват като носители на цисплатин.

Въпреки че резултатите от представените изследвания са от различни направления, те са анализирани последователно и взаимно се допълват, следвайки основната цел на работата. Заслужава да се отбележи, че именно при този подход на дискусия, докторантката е съумяла да направи заключения за всеки един етап от изследванията си и на тази основа да представи изводите, които са точни и обосновани. Дискутираните резултати са публикувани в три статии, отпечатани в международни списания с IF - 1.167 до 3.991. В две от публикациите докторант Стоянова е на първо място, което съвпада с мнението ми за личния й принос при дефинирането на поставените задачи и тяхното изпълнение.

Докторант Стоянова е участвала в 4 проекта, два от които са финансирани от Фонд „Научни изследвания” при Министерството на образованието, младежта и науката и един е финансиран от Европейския съюз. Изследователската си работа Екатерина Стоянова е представила с доклади на 3 национални конференции с международно участие и на 7 постерни сесии в Полша, Словения и България. Тя е провеждала упражнения по Аналитична химия на студенти от специалностите – Биология и Биотехнологии. Докторант Стоянова е била консултант на два дипломанта по магистърска програма Екохимия и по бакалавърска програма Инженерна химия и съвременни материали.

1. Какъв метод използвате, за да установите края на диализата на поли(р-йодометил стирен)-поли(акрилова киселина)?

2. Предоставените Ви от д-р Ковалчук прекурсори ПСПБА с ядра от поли(р-йодометил стирен) по данни от публикацията й в Polymer от 2005 г. притежават 7 рамене от поли(t-бутил акрилат). Вие използвате във вашите изследвания като прекурсори звездовидни съполимери с 10 рамена от поли(t-бутил акрилат).

3. Вероятната химична структура на ядрото на макроинициатора- силно разклонен олигомерен поли(р-йодометил стирен) е представена в работите на д-р Ковалчук. Показването на тази структура в дисертацията би била важна за читателя, защото така по-нагледно ще се изяснят някои от специфичните свойства на звездовидните носители на цисплатин.

4. Имате ли хипотеза, която да обяснява вероятния механизъм на насоченото действие към туморните клетки на звездовидните носители на цисплатин? Според Вас, кои са определящите фактори на този процес като имате предвид новия дизайн на съполимерния състав и структура на изследваните носители?

5. Вие предполагате, че конюгатите на цисплатин навлизат в туморните клетки чрез ендоцитозен механизъм. Бихте ли обяснили как нарастването на размера на макромолекулите на носителите на цисплатин влияе на този процес?

6. Имате ли концепция, която да предлага вероятен модел на координиране на наноструктурираните звездовидни носители на цисплатин спрямо пуриновите бази на ДНК в туморните клетки?

Заключение

Дисертационният труд на Екатерина Стоянова напълно отговаря по обем и качество на изискванията на Закона за развитие на академичния състав в Република България и Правилника за приложение на закона във Факултета по химия и фармация при Софийския университет “Св Климент Охридски”. Научните постижения на дисертационния труд и моите лични впечатления ми дават пълното основание да подкрепя с „да” присъждането на образователната и научната степен „доктор” на Екатерина Венциславова Стоянова.

(доц. Елена Каменска)