До председателя на Научното жури определено със заповед на Началника на вма №828 от 04. 06. 2015

Нямам общи публикации с автора и конфликт на интереси от друг характер

Респираторните инфекции причинени от интрацелуларни бактерии и вируси са честа и важна за армията патология. С промяната в етиологичната структура и новопоявилите се амплификационни генетически методи за диагностика, научния интерес към тези инфекции се повиши. Представената дисертация отговаря на все още нерешени въпроси на лабораторната диагностика. Докато амплификационните генетични методи в реално време за диагностика на грипните, парагрипните -, метапневмо-, респираторносинцитиалния вируси, рино-, адено- и ентеровируси, хламидофилните, микоплазмените, легионелните и коксиелни и туларемийни инфекции са ежедневие в работата на референтните лаборатории на НЦЗПБ(въведени са методи за БИРС, САРС, птичия грип и почти всички опасни белодробни патогени) много малко се знае за полиомния респираторен вирус KI PyV, за новите диагностични възможности на примково-медиираната изотермална амплификация на ДНК, особено при един важен потенциален агент в арсенала на бактериологичното оръжие като Coxiella burnetii . В нашата страна обикновено научните дисертации в тази област са посветени или на един метод или на един патоген и липсва цялостен епидемиологичен преглед на респираторната инфекциозна патология за двадесет годишен период за армията, какъвто ни дава настоящата дисертация.

Доцент Мекушинов си поставя за цел да анализира респираторната инфекциозна патология за двайсет годишен период (с вирусна и вътреклетъчна етиология ), както и да разработи, въведе и оптимизира съвременни диагностични методи за диагностика на респираторен полиомен вирус и да усъвършенства диагностиката на Q-треската, да апробира и приложи в лабораторната практика тези методи, както и да проведе епидемиологични и молекулярно – генетични проучвания с тях. За изпълнение на тази цел последователно решава следните методични задачи:

1. Извършва задълбочен ретроспективен анализ на лабораторните резултати от главно серологичните изследвания на пациенти с респираторни заболявания, извършени във вирусологична лаборатория на ВМА за 20 г. период

2.Разработва, оптимизиране, апробира( като валидира метода) и прилага PCR за диагностика на респираторния полиомавирус KI PYV

3. Доразвива, оптимизира, валидира метода, изпитва и прилага PCR за диагностика на Coxiella burnetii

4. Въвежда и оценява, валидира и прилага за диагностика метода примково- медиирана изотермална амплификация – (LAMP) за диагностика на Coxiella burnetii

Представения ми за рецензия дисертационен труд е написан на 347 стр. от които 1 страница е заглавна, 2 стр. е съдържанието, 2 стр. са използваните от автора съкращения, 5 стр. Въведение в дисертацията , общо 100 стр. обзор на литературата в 4-те раздела( всеки раздел има отделен литературен обзор), 1 стр. цел и задачи, общо 67 стр. Материали и методи( за всеки от четирите раздела), 198 стр. резултати и обсъждане, 3 стр. резюме на резултатите и изводи, 5 стр. Заключение, 53 стр. използвана литература общо 644 автора, от които 49 са с български букви и 595 са на латиница, 3 стр. списък на публикациите във връзка с дисертацията - 22 публикации. Дисертацията е онагледена е с 79 информативни таблици и 77 фигури, които точно илюстрират текста.

Литературния обзор предшества четирите части на работата. Обзорът би спечелил ако се позовава на първоизточници и цитира оргинални приноси на наши учени, а не това което те са прочели от някъде. Не мисля, че употребота на понятието „небактериални пневмонии” за легионелозата и хламидофилните инфекции от 2006г-(стр 23) употребено от наш автор, трябва да се цитира в такъв съвременен труд, като тази дисертация. Едва ли лечението с zanamivir и oseltamivir е въведено или сериозно проучено от цитираните двама наши учени.

В различните части на обзора последователно се представят съвременни литературни данни относно: рекласификацията на микробните причинители, основни техни микробиологични характеристики, генетични особености, антигени, гени кодиращи различните антигени и тяхната експресия, имунен отговор, клинично протичане на заболяването, лабораторна диагностика- включваща методи за директно доказване на причинителя, култивиране на клетъчни култури, опитни животни, молекулярно генетични методи за диагностика (амплификационни техники и др.), серологични/имунологични методи за с всичките им разновидности. Специално внимание се обръща и на епидемиологията на респираторните заболявани, като аначин на заразяване, инфекциозна доза, резервоари на инфекцията, клиника и терапия. Научна стойност има и факта, че всеки един обзор, преди всяка глава на дисертацията завършва с изводи и набелязване на възможности за оригинални проучвания, които са тема на този труд.

В първата част на дисертацията на базата на почти двайсет и пет хиляди серологични изследвания за период от двадесет години е извършен ретроспективени анализ. Използвани са широк набор от културелни и серологични методи: изолация на грипни вируси в кокоши ембриони и клетъчни култури; директен и индиректен флуоресцентен метод с отпечаткови препарати от назофарингеален секрет за откриване на антигени на грипния вирус (метода е пионерен за автора), и в препарати от материали за доказване на аденовируси и C.burnetii; и серологичните методи- доказване антитела към грипния вирус, парагрипните , адено- и RS-вируси, C.burnetii, също така при бактериите C. pneumoniaе и M. pneumoniaе. Анализирана промяната в етиологичната структура на респираторни инфекции сред контингента на ВМА и установена причинната връзка между промяната на вътрешното разпределение на респираторните причинители и промяната на възрастовия, полов и професионален състав на изследвания контингент, вследствие на структурните промени в БА. Заслужава особено внимание научния факт, че в епидемичните сезони наред с грипния вирус респираторните инфекции в армейските контингенти се дължат в еднаква степен и на аденовируси, което променя концепциите за първична имунопрофилактика.

Втората част на дисертацията е посветена на създаването, валидирането и внедряването на PCR диагностика на респираторния полиомен вирус KI PyV. За първи път в нашата страна е идентифициран новия полиомен вирус KI PyV. Чрез PCR e установено присъствието на KI PyV в клинични материоали от деца и възрастни с респираторни инфекции и здрави лица. Интересен е научния факт, че в HIV-позитивни пациенти с респираторни заболявания и в трансплантирани лица наличието на този вирус с честота от 15% до 11,11%. Високо е разпространението на вируса в трансплантирани пациенти(11,11%), което е характерно за полиомавирусите. Авторът потвърждава едновременното откриване на респираторни причинители и KI PyV в 62,5% до 66,66% при ХИВ-позитивните и трансплантираните пациенти. Изследвани са достатъчен брой пациенти, което предполага достоверност на изводите. Носо-гърлени секрети са взети и изследвани от 123 деца, 134 възрастни пациенти с клинично проявени респираторни заболявания, както и на 40 ХИВ-позитивни лица и 27 трансплантирани пациенти. Като контроли при изследванията са обработени материали от 37 здрави деца и 48 здрави възрастни. Новодоказаната амплифицирана вирусната ДНК е секвенирана от автора. Доказва се 97% съвпадение с референтния вирусен щам и секвенираната последователност е регистрирана в Световната генна банка - GenBank, Bethesda, Maryland, USA с accession № JN582333. Което е съществен научен принос.

Третата част на труда е посветена на валидация на амплификационни техники за диагностика на Q-треска. Разработени са оригинални различни варианти на конвенционална и real tyme-PCR, разширяват се методически възможностике, включително със въвеждането на SYBRGreen за откриване консервативни участъци от генома на C. burnetii в диагностиката на Q-рикетсиозата. Авторът установява оптималния срок на давност на заболяването за доказване C.burnetii в кръвни проби от пациента с PCR. Подходящия период от време е до 2 седмици от началота на заболяването при остра инфекция и след рецидив на хронична форма на Q-треската. Подходяща кръвнa проба за целта е цела венозната кръв с консервант EDTA. С PCR е проследена динамиката на коксиелната инфекция във вътрешните органи и кръвта на експериментално заразени опитни животни и е мониториран ефекта на терапевтични средства върху експериментална инфекция с Coxiella burnetii. Експериментални лабораторни модели на тази инфекция в момента у нас се правят само от колектива на докторанта.

Четвъртата глава на дисертацията е посветена на въведената за първи път у нас LAMP(бримкова амплификационна генетична техника в изотермични условия) метода за диагностика на Q-треската с кръвни проби от пациенти и експериментални модели. Доказана е по-високата чувствителност на метода в сравнение с PCR.

Приемам следните научно-теоретични приноси:

1. 
   Извършеното първо за страната изследване за респираторния полиомавирус KI с помощта на , както и секвенирането на получения амплифиран продукт, доказателството, че циркулиращият в България вирус, който е регистриран в генбанката се различава от първооткрития вирус с 3 %.
   
2. 
   Валидираните и оптимизирани методи за идентифициране на C.burnetii : SYBRGreen, както и LUX PCR, които са изпитани експериментално на моделни животни и са въведени в лабораторната диагностична практика.
   
3. 
   Оргинално е разработена и лабораторно валидирана амплификационна система за доказване на специфичен участък от плазмида на C.burnetii, отговорен за нейната инфекциозност.
   
4. 
   Оргинални елементи има и в проучването и проследяването на динамика на коксиелната инфекция с различните си параметри в опитни животни. Такива, които са лекувани и такива кото не са лекувани с антибиотици..
   
5. 
   Направеният ретроспективен анализ на етиологията на респираторните заболявания, изследвани във вирусологичната лаборатория на ВМА доказва промяни в етиологичната структура на изследваните инфекции.
   
6. 
   Оргинално за нашата страна е валидирането на метода за бримкова изотермична амплификация на генома на Q-рикетсиозата, както и изпитанието му на опитни животински модели. Също така за първи път се изследват клинични материали, както и се определя границата на чувствителност на този нов амплификационен метод.
   

1. 
   Въвеждане на комбиниран подход в лабораторната диагностика на Q-рикетсиозата, в началота на заболяването амплификациозни генетични техники и ензимно-сорбентно доказване на имунен отговор към различни антигени и с различни класове антитела в напредналите етапи на болестта.
   
2. 
   Валидиране на лабораторен метод за диагностика на респираторния полиома вирус.
   

Дисертацията на на доц. д-р. Красимир Димитров Мекушинов д.м., завеждащ лаборатория Вирусология към Катедра Военна Епидемиология и Хигиена на ВМА на тема:„ Съвременни диагностични подходи за оценка на етиологичната роля на някои респираторни патогени”, в научна специалност „ВИРУСОЛОГИЯ”, отговаря на изискванията на ЗРАСРБ и правилниците за приложението му за присъждане на научната степен „Доктор на науките”. Подкрепям убедено пред Научното жури присъждането на тази научна степен.