Доктор на науките

на дисертационен труд за получаване на научната степен "Доктор на науките” по професионално направление 4.2. Химически науки (Физикохимия)

За откриването на атомно-силовата микроскопия беше присъдена Нобелова награда през 1986 год., след което тя претърпя бурно развитие, намери и продължава да намира все по-разнообразни приложения. В труда на Балашев е изследвано поведението на гранични повърхности на ензими, полициклични ароматни въглеводороди, протеини от групата на хидрофобините, златни и полимерни наночастици и хроматин на дрожди – обекти с приложения в ензимологията, протеомиката, нанотехнологиите, във фармакологията за създаване на преносители на лекарствени средства, и в структурната биология. Всичко гореизложено обуславя по безспорен начин актуалността и значимостта на изследванията в този труд.

Материалът в дисертацията е разпределен в осем глави и е отразен в 194 страници, 78 фигури и 13 таблици. Цитирани са 315 литературни източника. Първите три глави са уводни и разглеждат принципът на AFM и други допълващи експериментални методи, използвани при изучаването на молекулната организация и реакциите, протичащи на гранични повърхности. От 4-тата до 8-мата глава са представени резултатите от различните изследвани обекти. В края, дисертацията съдържа 8 приложения, където коректно и точно са описани методичните детайли, експерименталните протоколи и условия при провеждането на различните експерименти.

Голяма част от резултатите получени в дисертацията имат подчертано оригинален характер, освен поради удачния избор на обектите и комбинирането на методиките на изследване, но и поради факта, че редица от изследваните обекти в дисертацията са сравнително оскъдно изследвани в литературата, а други произтичат от оригиналните и дългогодишни изследвания на колеги от Лабораторията по биофизикохимия, ръководена от проф. Ив. Панайотов.

Списъкът на публикациите, включени в дисертационния труд съдържа 32 заглавия. От тях 17 бр. са статии в реномирани международни списания с импакт фактор и реферирани в ISI Web of Knowledge и SCOPUS; 7 бр. са статии в пълен текст от сборници на конференции и 8 бр. са резюмета от конференции. Така, общия брой на включените статии в дисертацията е 24, от които 16 статии са с ИФ (с общ ИФ над 50). В тях, Балашев е първи автор в 7 и последен автор в 3 статии. Представен е и списък на участия с доклади на 12 конференции и семинари в чужбина. Справка в SCOPUS показва, че статиите на Балашев са цитирани над 165 пъти (h индекс=7).

Най-основната група статии на Балашев (10 бр. с импакт фактор) върху които се базира дисертацинния труд отразява резултати от изследвания върху действие на ензими (липази и протеази) на гранични повърхности. При изучаване на ензимите и тяхното взаимодействие с липиди и протеини на гранични повърхности умело са съчетани техниките на класическите монослоеве на граничната повърхност вода/въздух с Лангмюир-Блоджетовите (LB) филми от една страна и от друга - на AFM с повърхностно чувствителен синхротронен рентгеноструктурен анализ, като допълващ AFM метода. Така, чрез LB методиката монослоевете се прехвърлят при строго контролирани условия от повърхността вода/въздух върху твърда слюдена подложка, а след това чрез AFM и рентгеноструктурен анализ се визуализират и охарактеризират, с прецизност в нанометричната скала, молекулната структура и организация на бислойните филми в процеса на ензимната реакция. В резултат на действието на ензимите продуктите на хидролизата напускат бислоя и се разтварят (десорбират) във водната фаза, при което в него се образуват области с дълбоки дефекти. Тези дефекти са основният експериментално наблюдаван параметър чрез AFM като се приема, че скоростта на ензимната реакция е пропорционална на скоростта на десорбция на молекулите на продукта, и в резултат на това, на увеличаването на размера на бислойните дефекти.

Следвайки тази експериментална стратегия са получени редица оригинални резултати относно действието на липази и протеази, по-важните от които бих споменал както следва:

1. При изследване хидролизата на смесени фосфолипид/лизолипид/палмитинова киселина бислоеве под действие на PLA2 е установено наличието на два типа дефекти при бислоеве, съдържащи 75% лизопродукти - структурни и композиционни. Показано е, че обект на ензимното действие са предимно композиционните дефекти в бислоя и че продуктите на реакцията имат съществено влияние върху активиране на ензима и продължителността на латентната фаза на реакцията.

2. Анализирана е кинетиката на ензимни реакции с помощта на данни получени с AFM, позволяващи да се проследи появата и еволюцията на бислойни дефекти, както и на характерни 3D кристалоподобни структури. Демонстрирано е как чрез определяне на периметъра и площта на дефектите може да се следи кинетиката на ензимните реакции. При хибридни липид/фосфолипид бислоеве е установено, че скоростта на хидролиза зависи от дължината на периметъра на първоначалните структурни дефекти в бислоевете, както и че предпочитаните места за ензимна атака са ръбовете на съществуващите дефекти в хибридните бислоеве. Изследван е механизма на синергичното действие на два ензима (PLA2 и HLL) върху смесени липид/фосфолипид (DPPC /DPG) бислоеве чрез AFM и е показана последователността на действие на ензимите.

3. При изследване на ензимо-каталитичното действие на Savinase върху монослой от BSA на границата вода/въздух към класическите измервания на изменението на повърхностното налягане и потенциал в хода на реакцията е приложена и визуализация на действието на ензима чрез AFM във времето. От получените данни е определена каталитичната константа на ензимната реакция, протичаща на граничната повърхност вода/въздух в два случая – в монослой от нанесен на границата BSA и на адсорбиран BSA върху слюдена подложка.

4. При изследване на ензимо-каталитичното действие на Savinase върху монослой от инсулин е визуализирана структурата на слоя от инсулин преди и в края на хидролизата чрез AFM. За кинетичния модел на реакцията е приложен теоретичен подход на Панайотов и сътр., описващ кинетиката на разграждане на монослой от α-глиадин под действие на Savinase. Показано е, че AFM изображения на LB филми, прехвърлени преди и след действието на Savinase върху инсулиновия монослой значително се различават морфологично, както и че се появяват 3D структури от хидролизирани инсулинови В-вериги при филмите прехвърлени след действието на Savinase.

В дисертационния труд, освен ензимологичните публикации, са включени и други 6 статии с импакт фактор, които разкриват разнообразни приложения на AFM върху различни обекти: полициклични ароматни въглеводороди като Hexasubstitutedhexa-peri-hexabenzocoronenes (HBCs); протеини от групата на хидрофобините (HFBII); златни наночастици (AuNP); полимерни наночастици (на базата на VA-co-DMAPS – винил ацетат-ко-3-метил амониев пропан сулфонат, с различно молно отношение на DMAPS) и хроматина на Cerevisiae Saccharomyces. В комбинация с AFM в някои от тези изследвания са използвани и други методи: Келвинова силова микроскопия (KFM), рентгеноструктурен анализ (grazing incidence X-ray diffraction, GIXD) и пълно вътрешно отражение на рентгеновото лъчение (XD), LB техника и динамично светоразсейване (DLS).

По-важните, според мен, постигнати резултати в тази част на дисертацията са свързани с изучаване на латералната организация и молекулярната структура на LB филми, на изследвания на фазови преходи и електронни свойства на HBC, както и на структурната организация на хидрофобини, метални и полимерни наночастици, а също така и на хроматин. Така например:

- Показано е, че HBC молекулите се самоорганизират на границата вода/въздух в различни ламеларни фази в зависимост от стойността на повърхностното налягане, като при по-високо налягане HBC монослоят търпи фазов преход в 2D кристално състояние, съпроводен с промени в електронните свойства на молекулния филм.

- Демонстрирано е влиянието на повърхностното налягане при което се прехвърля монослой от хидрофобин (HFBII) за структурната организация на LB филми и преференциалното образуване на монослойни или трислойни покрития от HFBII върху твърдата подложка.

- Предложен е експериментален подход с помощта на AFM за изучаване кинетиката на растеж на златни наночастици в хода на техния синтез, чрез нанасяне по специален начин на малко количество от реакционната смес на повърхността на слюдена подложка. Сравнен с други известни от литературата методи (TEM и DLS) предложеният подход показва някои предимства.

- Характеризирани и определени са чрез AFM размера и морфологията на полимерни наночастици (синтезирани на основа на полимери Poly(VA-ко-DMAPS), които са подходящи носители на лекарствени форми. С помощта на AFM са визуализирани морфологичните промени, настъпващи в наночастиците, когато в тях се включи лекарството Metoprolol Tartrate, и са определени диаметърът и склонността на наночастиците към агрегиране в зависимост от степента на включване на лекарството.

- Демонстрирани са възможностите на AFM за получаване на топографски изображения на хромозоми с нанометрична резолюция. Приложен е експериментален подход, при който са получени AFM изображения на хроматин от див (WT) и мутантен (HHO1 KO) тип Saccharomyces Cerevisiae. Количественият анализ на изображенията показва съществени структурни различия при мутантния тип хроматин, свързани с липсата на свързващия хистон. Показано е, че линкерният хистон Hho1, кодиран от Hho1p гена на S. Cerevisiae, играе важна роля за високия порядък на организацията и структурната цялост на хроматина.

1. 
   Изследвано ли е влиянието на йонния състав на субфазата на липидните монослоеве върху структурата и стабилността на получаваните LB филми?
   
2. 
   По какви съображения е предпочетена LB или LS техниката за трансфера на монослоевете при изследваните в дисертацията различни обекти?
   

Авторефератът съответства по съдържание на дисертацията и отразява най-важните резултати.

Като цяло, дисертацията е осъществена на високо професионално ниво и представлява съществен принос в областта на приложенията на атомно-силовата микроскопия за изследване на ензимни реакции на гранични повърхности и на молекулни явления на нанометрично ниво, включително и в области на структурната биология. Получените резултати в този дисертационен труд имат подчертано оригинален характер по причини, които изложих по-горе.

Обемът и качеството на изследванията отговарят напълно, а по някои показатели надхвърлят препоръчителните изисквания на ФХФ на СУ за научната степен ”Доктор на науките”. В представените трудове са получени съществени и оригинални научни резултати, които са намерили добро отражение в международната научна литература. Тази дисертация характеризира Константин Балашев като зрял, високо образован, квалифициран и самостоятелен изследовател. Поради всичко гореизложено предлагам с убеденост на уважаемото Научно жури и на ФС на ФХФ на СУ да присъди на Константин Тодоров Балашев степента ”Доктор на науките”.
20.01.2015 г. Рецензент:

/проф. З. Лалчев/