Флора Венциславова Цветанова Получаване на 2,3-бутандиол от нишесте чрез рекомбинантен щам Klebsiella pneumoniae G31 А



страница1/3
Дата24.01.2017
Размер423.35 Kb.
#13395
ТипАвтореферат
  1   2   3


БЪЛГАРСКА АКАДЕМИЯ НА НАУКИТЕ

ИНСТИТУТ ПО ИНЖЕНЕРНА ХИМИЯ



Флора Венциславова Цветанова

Получаване на 2,3-бутандиол от нишесте чрез рекомбинантен щам Klebsiella pneumoniae G31 - А

Автореферат

на дисертация за получаване на научна и образователна степен „Доктор“

Научна специалност: 02.10.09

Научен ръководител: проф. д-р Калоян Петров

София

2016г.


Дисертационният труд съдържа 103 страници, 9 таблици и 20 фигури. В библиографията са включени 155 заглавия. Експерименталната работа е извършена в Институт по Инженерна Химия и Институт по Микробиология „Стефан Ангелов“.

Защитата на дисертационният труд ще се проведе на ………………. от ……….. часа в Институт по Инженерна Химия на БАН – София, ул. „Акад. Георги Бончев“, блок 103.

Материалите по защитата са на разположение на интересуващите се в канцеларията на Института по Инженерна Химия.

Автор: Флора Венциславова Цветанова

Заглавие: Получаване на 2,3-бутандиол от нишесте чрез рекомбинантен щам Klebsiella pneumoniaе G31 - А

БЪЛГАРСКА АКАДЕМИЯ НА НАУКИТЕ

ИНСТИТУТ ПО ИНЖЕНЕРНА ХИМИЯ

Флора Венциславова Цветанова

Получаване на 2,3-бутандиол от нишесте чрез рекомбинантен щам Klebsiella pneumonia G31 - А

Автореферат

на дисертация за получаване на научна и образователна степен „Доктор“

Научна специалност:

02.10.09.

Научен ръководител: проф. д-р Калоян Петров

Научно жури: Доц. д-р Величка Гочева

Доц. дбн Маргарита Камбурова

Доц. д-р Александър Рътков

Проф. д-р Калоян Петров

Проф. д-р Драгомир Янков



София

2016г.


СЪДЪРЖАНИЕ

Списък на използваните съкращения

6

  1. Въведение

7

  1. Цел и задачи

8

  1. Материали и методи

9

    1. Бактериални щамове

9

    1. Състав на хранителната среда и условия на култивиране

10

    1. Изолиране на геномна ДНК

11

    1. Изолиране на плазмидна ДНК

12

    1. PCR

12

    1. Клониране на генът amyl

12

    1. Трансформация на бактериалният щам и отделяне на амилаза

12

    1. Нуклеотидни секвенционни анализи на amyL

13

    1. Условия за култивиране на генно-модифициран щам Klebsiella pneumoniae G31 – A

13

    1. Аналитични методи

14

      1. Определяне на разтворими метаболити

14

      1. Определяне на нишесте

14

      1. Определяне на ензимна активност и количество белтък

14

      1. Определяне на биомаса

15

  1. Резултати

15

    1. Изучаване влиянието на различните компоненти на хранителната среда при ферментацията на глюкозата от Klebsiella pneumoniae G31

15

    1. Получаване на 2,3-БД от нишесте с рекомбинантен щам Klebsiella pneumoniae G31 – A

19

      1. Клониране и секвенционни анализи на amyL от B. licheniformis

19

      1. Хетероложна експресия на гена amyL в Klebsiella pneumoniae G31–A

21

      1. Метаболитен профил на ферментацията на нишесте с рекомбинантен щам Klebsiella pneumoniae G31–A

24

    1. Влияние на IPTG върху синтезирането на 2,3-БД

25

    1. Влияние на Ca2+ върху получаването на 2,3-БД

26

    1. Влияние на добавянето на глицин върху извънклетъчната амилазна активност и получаването на 2,3-БД

29

    1. Конверсия на високо концентриран разтвор на нишесте

32

  1. Обсъждане на резултатите

37

  1. Изводи

42

  1. Приноси

43

Списък на научните публикации по дисертацията и участие в научни конференции

44


СПИСЪК НА ИЗПОЛЗВАНИТЕ СЪКРАЩЕНИЯ

2,3-БД

2,3-бутандиол

NAD

коензим никотинамид аденин динуклеотид (Nicotinamid Adenine Dinucleotide)

SSF

едновременно озахаряване и ферментация (simultaneous saccharification and fermentation)

SHF

отделно протичащи хидролиза и ферментация (separate hydrolysis and fermentation)

IPTG

изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside)

rpm

обороти за минута (revolutions per minute)

ДНК

дезоксирибонуклеинова киселина

PCR

полимеразна верижна реакция (Polymerase Chain Reaction)

HPLC

високоефективна течна хроматография (High Performance Liquid Chromatography)

CDs

циклодекстрини (cyclodextrines)

cymH

Циклодекстриназа

SDS-PAGE

електрофореза в полиакриламиден гел с натриев додецил сулфат (Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)

1. ВЪВЕДЕНИЕ

Получаването на 2,3-бутандиол (2,3-БД) като продукт на микробна ферментация има дълга, повече от стогодишна история. Първите целенасочени опити за продуцирането му като метаболитен продукт на Klebsiella pneumoniae (тогава Aerobacter aerogenes) датират от 1906 година (Harden and Walpole 1906). През 1926 Donker използва щам на Bacillus polymyxa. Понастоящем са известни над 30 вида организми (основно бактерии), които могат да синтезират 2,3-БД. Едва няколко от тях, обаче, могат да го продуцират в количества, необходими за комерсиалното му използване. Схема за първото индустриално производство на 2,3-БД е предложена още през 1933 г. от Fulmer, но истински разцвет в научно и технологично отношение, ферментационното получаване на 2,3-БД преживява през годините на Втората световна война. Причина е нуждата от синтетична гума, основна суровина за чието производство се явява 1,3-бутадиена, дериват на 2,3-БД. По-късно, поради пад в цените на петрола и петролните продукти, производството на 1,3-бутадиен чрез конверсия на 2,3-БД става икономически неизгодно. Обратно, продължителното покачване в цените на петролните деривати през следващите две десетилетия, и най - вече скока през 70-те години, отново възвръщат интереса към 2,3-БД (първоначално в САЩ, по-късно и в Китай).

Вторият пик на значителен интерес към химикала продължава и до днес. Това се дължи на все по–широкото му приложение в редица индустрии – хранително-вкусова, фармацевтична, в козметиката, като дериват за получаване на диацетил, метилетилкетон и др. Ново приложение 2,3-БД намира като добавка в горивата. Поради високата калоричност на изгарянето му и високото октаново число, понастоящем се счита, че 2,3-БД има потенциал да бъде използван и като самостоятелно гориво.

Вследствие на непрекъснато развиващите се технологии за неговото получаване, себестойността му чувствително намалява. Според ценовият анализатор ISIC pricing, цената на тон технически 2,3-бутандиол към януари 2014 г. варира от 1850 долара (Китай) до 2100 евро (Германия), докато цената на 2,3-БД, пречистен за фармацевтична употреба е 48.32 долара за килограм.

През последните десетилетия, 2,3-БД е обект на множество научни изследвания, концентриращи се главно върху разработването на биотехнологии, използващи ферментация на все по-евтини субстрати. За целта усилено се работи както за оптимизиране на технологията на производството, така и за създаването на генетично модифицирани щамове–свръхпродуценти на 2,3-БД от различни субстрати. Целта е да се създадат хибридни организми, способни да разграждат колкото се може по-евтини материали – различни отпадни продукти, широко разпространени в природата полизахариди, както и различни захари, неподлежащи на конверсия от естествените организми. За целта, в естествените продуценти на 2,3-БД се клонират както гени, усилващи естествения метаболизъм на клетките, така и гени, чиято експресия води до създаването на нови метаболитни пътища и придава нови качества на организмите – например гени за целулазна, амилазна, ксиланазна и друга активност.

В този смисъл, целта на настоящия труд е създаването на генетично модифициран организъм, способен да разгражда нишесте и директно, в едностъпален процес на едновременно втечняване, озахаряване и ферментация, да го превръща в 2,3-бутандиол. Разработването на такава биотехнология би имало както научно, така и приложно значение, отваряйки възможността за индустриалното производство на 2,3-БД на базата на нишесте и нишестени материали.



2. ЦЕЛ И ЗАДАЧИ

Целта на настоящата работа е:



Създаване на биотехнология за директно превръщане на сурово нишесте в 2,3-бутандиол чрез ферментация.

За постигането на тази цел бяха поставени следните задачи:



  1. Избор на щам – продуцент на 2,3–бутандиол.

  2. Намиране на оптималните условия за получаване на 2,3–бутандиол от глюкоза.

  3. Клониране и хетероложна експресия на ген за екстрацелуларна α – амилаза в избрания щам.

  4. Оптимизиране на условията за максимална експресия на гена:

  • концентрация на индуктора IPTG;

  • концентрация на глицин;

  • концентрация на Ca2+.

  1. Метаболизиране на високо концентрирани разтвори на нишесте за максимален добив на 2,3–бутандиол.

3. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

3.1. Бактериални щамове

Използваният щам за трансформация - Klebsiella pneumoniae G31 е свръхпродуцент на 2,3-бутандиол от глицерол (Petrov and Petrova 2009, 2010), изолиран е от активна тиня и е депозиран в Българската Национална Банка за Промишлени Микроорганизми и Клетъчни Култури под регистрационен № 8650.

Рекомбинантният щам - Klebsiella pneumoniae G31- А е получен чрез клониране в дивия на α - амилазен ензим от щам на Bacillus licheniformis 44 MB82/G (получен от същата банка). Щамът Klebsiella pneumoniae G31 - А е депозиран в колекцията микроорганизми и клетъчни култури в институт Leibniz, Германия (DSM 27580).

Щамовете и плазмидните конструкти за получаването на рекомбинанта са посочени в табл. 1.



    1. Състав на хранителните среди и условия на култивиране

Бактериалните щамове са съхранявани при температура -200С в присъствие на 20 % (w/w) глицерол.

Компонентите на използваните хранителните среди за култивиране на Klebsiella pneumoniae G31 са следните (g/L): K2HPO4 (13.7), KH2PO4 (2.0), (NH4)2HPO4 (3.3 – 4.91), (NH4)2SO4 (5.35 – 6.6), MgSO4. 7H2O (0.2 – 0.25), FeSO4. 7H2O (0.02 – 0.05), ZnSO4. 7H2O (0.001), MnSO4. 7H2O (0.001 – 0.01), CaCl2. H2O (0.01), EDTA (0.05), KCl (0.4 – 0.75), NaH2PO4. 2H2O (13.8), Na2SO4 (0.28), CH3COONa. 3H2O (3.0), дрождев екстракт (2.0 – 5.0), бактопептон (2.0), солеви разтвор (ZnCl2 – 34.2, FeCl3. 6H2O – 2.7, MnCl2. 4H2O – 10, CaCl2. 2H2O – 0.85, H3BO3 – 0.31), лимонена киселина (0.42).

Всички експерименти са проведени на колби с обем 500 mL, (включително развитието на инокулума и работните среди). Извършени са със 100 mL хранителната среда при 37 0С и скорост на разбъркване 200 rpm на клатачка (New Brunswick Scientific CO, Edison, New Jersey, USA, модел G25). За приготвянето на инокулума е използвана среда 7 (виж табл. 2) с въглероден източник глюкоза (30 g/L). Глюкозната концентрация при работните колби е 55 и 100 g/L. Началното рН при старта на процесите е 7.0, а в хода им не е осъществяван рН-контрол.

За конструирането на рекомбинантният щам, културите E. coli и K. pneumoniae G31 са култивирани на среда Luria - Bertani (Scharlau Chemie S. A., Barcelona, Испания) със съдържание (g/L): триптон - 10, дрождев екстракт - 5, NaCl - 10. За приготвянето на петритата е използван 1.5 %-ен агар (Oxoid, Thermo Fisher Scientific, Hampshire, Великобритания). Добавяни са антибиотиците ампицилин, канамицин, тетрациклин, еритромицин и хлорамфеникол (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Германия).

Щамът B. licheniformis 44MB82/G е култивиран в хранителна среда със съдържание (g/L): месен екстракт - 10, пептон - 10, NaCl - 5, разтворимо нишесте - 0.5 %.

Всички щамове са култивирани на 37 0С на клатачка.



Табл.1. Щамове, плазмиди и праймери

Щам/плазмиди/праймери

Характеристики

Източник

Щам







K. pneumoniae G31

продуцент на 2,3-БД, Ampr

Petrova et. al., 2009

K. pneumoniae G31-A

продуцент на 2,3-БД, Ampr, Kanr, pCRamyBL

Tsvetanova et. al., 2014

E. coli DH5α

F-endA1 gln V44 thi-1 recA1 relA1

gyrA96 deoR nupG Φ80ddlacZΔM15

Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rk-mk+), λ-


InvitrogenTM

B. licheniformis 44 MB82/G

разгражда необработено нишесте, amyL

Tonkova, 1991

Плазмиди






pJET2.1/blunt

Ampr, T7 промотор, rep (MB1)

Thermo Scientific Inc.

pJETamyBL

Ampr, T7 промотор, rep (MB1), amyl

Tsvetanova et. al., 2014

pCR®2.1-TOPO®

Ampr, Kanr, f1 ori, pUC ori, Plac, lacZα

InvitrogenTM

pCRamyBL

Ampr, Kanr, f1 ori, pUC ori, Plac, amyL

Tsvetanova et. al., 2014

Праймери







amyFa

5’-gtgtaggattccatgaaacaacaaaaacggctttac-3’

Tsvetanova et. al., 2014

amyR

5’-gattccgttcctatctttgaacataaattgaaacc-3’

Tsvetanova et. al., 2014

pJET2.1-forward

5’-cgactcactatagggagagcggc-3’

Thermo Scientific Inc.

pJET2.1-reverse

5’-aagaacatcgattttccatggcag-3’

Thermo Scientific Inc.

aНуклеотидите, представени с наклонен шрифт представляват клонираната в Klebsiella последователност Shine-Delgarno

3.3. Изолиране на геномна ДНК

Тоталното количество геномна ДНК е изолирано от 24-часова култура B. licheniformis 44 MB82/G с GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), като се спазват препоръките на производителя.



3.4.Изолиране на плазмидна ДНК

Пречистването на плазмидната ДНК е извършено с GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.).



3.5. PCR

За PCR-амплифицирането на генът amyL са използвани праймерите amyF и amyR (Biomers.net GmbH, Ulm, Германия; табл.1.) и смес за PCR-GeneAmp® High Fidelity PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) с краен обем 50 µL, концентрация на праймерите 0.5 pmol/µL и геномна ДНК от B. licheniformis 44 MB82/G - 2 ng/µL. PCR реакцията е проведена в апарат QB-96 Satelite Gradient thermal cycler (LKB Vertriebs GmbH, Vienna, Австрия) при следния температурен профил: начална денатурация при 94 0С за 3.5 min, 35 цикъла, състоящи се от: една минута денатурация при 94 0С, 45 секунди хибридизация на праймерите при 550С, елонгация – 2 минути на 720С, последвани от финална фаза на елонгация при 720С за 5 минути. Получените PCR - продукти са разделени и визуализирани електрофоретично на 1 % - ен агарозен гел при 60 V за 50 минути.



3.6. Клониране на генът amyL

Намноженият посредством PCR ген amyL е пречистен с GFX PCR DNA and gel band purification kit (Amersham Biosciences, Uppsala, Швеция) и е клониран във вектор с тъпи краища pJET 2.1 (2974 bp) според инструкциите на CloneJETTM PCR Cloning Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, САЩ). Полученият конструкт е обозначен като pJETamyBL и е използван за секвениране на amyL. От този конструкт с рестрициране на Xho I/Xba I е получен рестрикционен фрагмент, съдържащ amyL (New England Biolabs, MA, САЩ). Фрагментът е клониран във вектор pCR®2.1-TOPO® под контрола на lac промотор. Конструктът е наречен pCRamyBL.



3.7. Трансформация на бактериалният щам и отделяне на амилаза

Щамът E. coli DH5α е използван като гостоприемник, с помощта на който са мултиплицирани плазмидите pJETamyBL и pCRamyBL. Поръчани са компетентни клетки MAX Efficiency® DH5αТМ от InvitrogenTM Life TechnologiesTM Co. Приготвени са компетентни клетки на K. pneumoniae G31 с кит за бактериална трансформация TransformAidТМ (Fermentas, Thermo Fischer Scientific Inc.).

Качествените анализи на способността на получените трансформанти да секретират α - амилазния ензим са проведени на петрита със среда LB с добавено 0.5 % нишесте. След 24-часово култивиране при 37 0С получените бактериални колонии са обработени с разтвор на I2/KI. Около колониите, в чиито клетки фрагментът е успешно клониран и се експресира, се образува жълта зона поради липса на нишесте.

3.8. Нуклеотидни секвенционни анализи на amyL

Генът amyL е секвениран от Macrogen Inc. (Амстердам, Холандия) с праймери pJET2.1F и pJET2.1R, съответно работещи в права и в обратна посока. Секвенционните анализи са проведени с помощта на програмите Chromas и CAP3 (http://genome.es.mtu.edu/cap). Съпоставката на получената нуклеотидна последователност с данните от GenBank е извършена посредством програмите BLASTN и ClustaW. Предполагаемата белтъчна структура на амилазата е анализирана с програмата Expasy (Swiss Institute of Bioinformatics). Нуклеотидната последователност на гена е депозирана в базата данни на NCBI GenBank под номер KF261567.

3.9. Условия за култивиране на генно – модифициран щам K. pneumoniae G31 - A

Периодичните ферментационни процеси с K. pneumoniae G31 - A с клониран плазмид pCRamyBL са проведени на колби от 500 mL, съдържащи 100 mL хранителна среда М7d със съдържание (g/L): картофено нишесте (Fluka) – 40 ÷ 300, (NH4)2HPO4 - 4.9, CH3COONa.3H2O - 3, KCl - 0.4, MgSO4.7H2O - 0.2, FeSO4.7H2O - 0.02, MnSO4.7H2O - 0.01, ZnSO4.7H2O - 0.001, дрождев екстракт-5 (pH=7.0). Добавени са 75 µg/mL канамицин. Колбите са посяти с 24-часов инокулум със същата хранителна среда. За експериментите, проведени при начални концентрации на нишесте 40 g/L е използван 2 % - ен инокулум, а за всички други - 10 % - ен. Процесите са проведени на клатачка (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, САЩ) при 37 0С. Скоростта на разбъркването е 200 rpm при експериментите с начална концентрация на нишесте 40 g/L и 240 rpm при тези с начална концентрация на нишесте 100, 200 и 300 g/L.



Проведени са и процеси с добавяне на β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG), глицин или CaCl2 (Sigma). След вземане на пробите, супернатантите са филтрувани през филтри с големина на порите 0.2 µm (Minisart®, Sartorius Stedim Biotech, Германия) и анализирани за амилазна активност, неразградено нишесте и съдържание на разтворими метаболити.

3.10. Аналитични методи

      1. Определяне на разтворими метаболити

Количественото определяне на разтворимите метаболити е извършено с високоефективна течна хроматография (HPLC). Съдържанието на 2,3-БД, ацетоин, етанол, оцетна, сукцинова и млечна киселина е анализирано с хроматографска колона Bio-Rad Aminex HPX-87H, темперирана на 65 0С и е детектирано на базата на промяна на рефрактометричен индекс, използван за 2,3-БД, ацетоина и етанола (RI детектор), или чрез UV абсорбция при дължина на вълната 210 nm, като за целта е използван детектор с променлива дължина на вълната Knauer за измерване съдържанието на органичните киселини. Като мобилна фаза е използвана 5 mM H2SO4 с дебит 0.6 mL/min. Глюкозата, малтозата и олигозахарите са разделени с хроматографска колона Bio-Rad HPX-42A при 85 0С и детектирани с RI детектор (Perkin-Elmer 10). Мобилната фаза е дестилирана вода с дебит 0.6 mL/min.

      1. Определяне на нишесте

Съдържанието на нишесте е определено чрез измерване на светлинната абсорбция на комплекса нишесте-йод при дължина на вълната 580 nm (Nakashimura, 1981).

      1. Определяне на ензимна активност и количество белтък

Извънклетъчната амилазна активност на супернатантата е определена по метода на Pantschev et. al. (1981) при рН=6.0 (0.1 mol/L цитрат-фосфатен буфер) и температура 37 0С. За целта е измерена комплексообразуващата способност на нишестето с йод. Една единица амилазна активност се дефинира като количеството на ензима, който хидролизира 1 µmol нишесте за една минута. Една единица специфична амилазна активност е амилазната активност, измерена на милиграм тотален извънклетъчен белтък. Съдържанието на белтък е определено по метода на Bradford (1976).

      1. Определяне на биомаса

При култивиране със субстрат глюкоза клетъчния растеж е определен чрез измерване на оптичната плътност на културата (при средите без нишесте) при дължина на вълната 600 nm (OD600) със спектрофотометър UV-1600PC (VWR).



Сподели с приятели:
  1   2   3




©obuch.info 2024
отнасят до администрацията

    Начална страница